8. Měření kneky dohasínání fluorescence v časové doméně
Kneka dohasínání fluorescence Po excac vzorku δ-pulsem se hladna S 1 depopuluje podle dn( ) = ( k k ) n( ) d F + N Pronegrováním a uvážením, že měřená nenza je úměrná poču čásc, dosaneme I() = I 0 e / kde doba žvoa = (k F + k N ) -1 Sřední doba žvoa je rovna (pro jednoexponencální dohasínání) = 0 0 I I ( ) ( ) d d = 0.exp 0 exp ( ) d ( ) d 2 = = Sřední doba žvoa není závslá na koncenrac, proo bývají nformace o mkrookolí fluoroforu spolehlvější než pouhé měření nenzy. Problémem je analýza složějších sysémů I ( ) I α exp = 0 poče foonů poče foonů 10000 8000 6000 4000 2000 10000 1000 100 10 7500*exp(-/5.5)+2500*exp(-/8) 2500*exp(-/4.5)+7500*exp(-/6.7) 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 čas (ns) 7500*exp(-/5.5)+2500*exp(-/8) 2500*exp(-/4.5)+7500*exp(-/6.7) 1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 čas (ns)
Sřední doba žvoa Více-exponencální kneka dohasínání fluorescence D = α e Sřední doba žvoa - vážená ampludam m = α α Sřední doba žvoa - vážená seady-sae nenzou m = f f = α α Příklad 8.1: Spočíeje sřední dobu žvoa váženou (a) ampludam, (b) nenzam pro znázorněný příklad. 2
Hradlovaná deekce (gaed deecon) Pulsní (časová) doména excace δ-pulsem nenza n * I ( ) ( ) = n * 0 e ( ) ( ) = I 0 e Hradlovaná (gaed) deekce oevření hradla čas exc. pulz fluorescence Hsorcky nejsarší meoda pro měření kneky dohasínání fluorescence v časové doméně Hradlování může bý zajšěno buď ím, že je deekor zapnu jen na velm krákou dobu, nebo ím, že deekor je zapnu po celou dobou měření, ale elekrcký sgnál je snímán sroboskopcky. Inenza je proměřena pro časové nervaly s různě dlouhou prodlevou po excačním pulzu Díky horšímu rozlšení (IRF~3 ns) a sysemackým arefakům prakcky opušěna, nyní se v někerých aplkacích začíná vrace Výhody: - relavně levná - možnos rychlého načení celé dohasínací křvky - s výhodou využívána např. v mkroskop nebo pro měření pomalejších knek
Meoda časově-korelovaného číání foonů (me-correlaed sngle-phoon counng, TCSPC) Inenza ~ Pravděpodobnos emse Vzorek ozařujeme sérí pulzů Po každém pulzu deekujeme nejvýše jeden emovaný foon, pro nějž přesně změříme čas, ve kerém přleěl na deekor Údaje o časech příleu shromažďujeme v hsogramu Pro velký poče zaznamenaných foonů hsogram rekonsruuje dohasínací křvku Výhody: - vysoké rozlšení (běžné přísroje > 50 ps) - analýza více-exponencálního dohasínání - malá náchylnos k sysemackým arefakům - směrodaná odchylka poču deekovaných foonů v každém kanálu (N ) je dána Possonovskou saskou (N ) 1/2 - možnos porovnání fovaného modelu s eoreckou předpovědí Becker&Hckel, The bh TCSPC handbook
U Prncp měření TCSPC START STOP reverzní mód TAC
Rychlos měření chceme načís co nejvíce foonů (alespoň 5.10 6 ) opakovací frekvence je lmována hardwarově knekou dohasínání účnnos deekce - čím věší, ím lepší...... ale jen do určé míry ple-up efek
Saska musí bý úplná! EXC OK OK DET 0 NE I Elmnace ple-up efeku: Coun-rae musí bý < 1%. Tzn. př opakovací frekvenc 10 MHz můžeme deekova max. 10 5 foonů za 1s. Příklad 8.2: Za jak dlouho jsme schopn za opmálních podmínek nasbíra hsogram z 5.10 6 foonů? 0
Přesnos měření log I var excačního pulsu nesabla elekronky (me-jer) časový nerval pro 1 kanál př ukládání da rans-me spread poče deekovaných foonů sabla vzorku Becker&Hckel, The bh TCSPC handbook
Funkce přísrojové odezvy není δ-funkce M = IRF D Analýza da Časový posun (shf) mez deekcí IRF a M Dohasínání nemusí bý monoexponencální D D D = α e = 0 ( ) e = α. = e β více komponen dsrbuce naažená exponencála D 2b = e přechodové jevy Je velm užečné, mí předsavu o om, jak má vypada dohasínání
Meody vyhodnocování Meoda nejmenších čverců (LSA) zadáme model dohasínání zadáme paramery, keré chceme nají hledáme mnmum funkce 2 χ = N EXP FIT 2 N EXP FIT ( X X ) ( X X ) = 2 EXP = 1 σ = 1 X 2 Použelnos LSA 1. Neurčos v expermenálních daech se ýká pouze závslé proměnné (y-osa) 2. Neurčos v závslé proměnné mají Gaussovskou dsrbuc 3. Závslá (y) an nezávslá (x) proměnná není zaížena sysemackou chybou 4. Funkce použá pro fování je správným maemackým popsem sysému. Nesprávné modely dávají nesmyslné paramery. 5. Všechny body v souboru jsou navzájem nezávslé. 6. Máme dosaečné množsví da, akže hledané paramery jsou přeurčené. Tyo podmínky bývají v TCSPC splněné
Meody vyhodnocování Meoda maxmální enrope (MEM) vybereme nerval, ve kerém očekáváme, že se doby žvoa budou nacháze rozdělíme eno nerval na n čásí fujeme podle modelu n = 1 α. e přčemž jsou dána rozdělením nervalu a hledáme pouze α, přčemž hledáme maxmum funkce d X ( ) X ( ) X ( ) X log f f exp f X 0 exp ( ) ( ) Výhodné př analýze složých sysémů Nepředpokládáme a pror poče komponen an jejch dsrbuce
nejdůležějším krér jsou: χ R 2 náhodnos rozložení resduí Kvala fu χ N EXP FIT 2 N EXP FIT ( X X ) ( X X ) = 2 EXP 2 1 1 R = N p = 1 σ N p = 1 X 2
Auokorelační funkce udává, nakolk koreluje odchylka v k-ém bodě s odchylkou v (k+j)-ém bodě C ( ) j m 1 m 1 n k = 1 = n D k= 1 k D D 2 k k + j D k... odchylka v k-ém bodě n... celkový poče kanálů m... poče kanálů přes kerý se počíá auokorelace
Provázanos paramerů
Deekory Foonásobče (PMT) - levné, rans-me-spread > 100 ps, afer-puls
Mkrokanálové desčky (MCP PMT) rans-me-spread ~ 30 ps menší nenza aferpulsů dražší Lakowcz Prncples of Fluorescence Specroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999 Foodody (PD) velm levné, ale nemají pořebné zesílení Lavnové foodody (APD) rosoucí populara, pro někeré aplkace nejpoužívanější deekor problémem velm malá akvní plocha (ypcky 10 µm x 10 µm) FWHM pulsu od 20 ps
Rozmíací kamera (sreak camera) současně zaznamenaná nformace o časových charakerskách a o vlnové délce výhodné pro současné zaznamenání celého spekra
Upconverson Umožňuje deekc velm krákých časů < 2 ns Rozlšení je dáno šířkou laserového pulsu (> 10 fs) deekor zpožďovací lnka excace vzorek cu-off flr cu-on flr emse sčíání frekvencí hradlovací pulz generace druhé harmoncké frekvence pulzní T:Sapph laser, 800 nm
DAS (decay-assocaed specra) I (,λ) = I 0 Σ α (λ) exp (-/ ) Globální analýza Možnos rozlšení komponen, jejchž emsní spekra se překrývají, ale lfemy jsou různé. Lakowcz Prncples of Fluorescence Specroscopy, 2.ed., Kluwer/Plenum, 1999
TRES (me-resolved emsson specra) v 2 S 2 k R relaxace v 1 v 0 v 3 v 2 S 1 absorpce k A hν A k N k E hν E v 1 v 0 emse v 3 v 2 Energe S 0 v 1 v 0
TTTR (me-agged-me-resolved) Je zaznamenáno zpoždění emovaného foonu vůč excačnímu pulzu, ale aké doba příleu v absoluní časové škále To umožňuje sledova komplení časový vývoj sysému - nenzy kneky dohasínání Becker&Hckel, The bh TCSPC handbook
FluoTme 200 (PcoQuan) Zdroje: pulsní LED 298 nm (10 MHz, 1,8 µw) pulsní LED 308 nm (10 MHz, 0,9 µw) pulsní laserová LED 445 nm (40 MHz, 1,8 mw) Excační a emsní polarzáor Moorzovaný monochromáor (λ blaze =450 nm) Foonásobč PMA-182-P-M (185-820 nm) PcoHarp 300 (rozlšení 4 ps) Sofware: FluoF Pro 4.2.1 (LSA) Flame5 (MEM)
SHRNUTÍ Měření doby žvoa excovaného savu v časové doméně Excace pulzním zdrojem svěla (deálněδ-pulz) Způsob záznamu kneky dohasínání - hradlovaná deekce, korelovanéčíání jednolvých foonů (TCSPC), záznam TTTR (me-agged-me-resolved) Analýza da - dekonvoluce přísrojové funkce, použí správného modelu, problémy př analýze složějších sysému, meoda nejmenších čverců (LSA), meoda maxmální enrope Idenfkace správného fu -χ R2, rozložení rezduí, auokorelační funkce Deekory - foonásobče, MCP, foodody, lavnové foodody, rozmíací kamery, meoda up-converson Meody se spekrálním rozlšením - TRES, DAS