Oddělení funkční genomiky a proteomiky Přírodovědecká fakulta MU Charakterizace proteinů hmotnostní spektrometrií Část III Zbyněk Zdráhal Centrální laboratoř-proteomika, CEITEC-MU Oddělení funkční genomiky a proteomiky, ÚEB PřF zdrahal@sci.muni.cz www.sci.muni.cz/fgp
Analýza proteomu proteinů je podstatně víc než genů lidský genom obsahuje ~21 000 genů, ale lidský proteom může obsahovat ~ 1 000 000 proteinů a jejich forem (izoformy, PTMs) (http://www.expasy.org/sprot/hpi/hpi_desc.html) ~ 10 000 proteinů v buňce v každém okamžiku široký rozsah koncentrací proteinů (~ 10 řádů) nutnost účinné separace majoritních proteinů od minoritních, chybí obdoba PCR reakce používané pro amplifikaci DNA široké spektrum fyzikálně-chemických vlastností analýza komplexů pro úplné pochopení buněčných procesů mnohdy nestačí prostá identifikace jednotlivých proteinů, cca 80% je funkčních jako součást komplexů
Pečlivá příprava vzorku základní kámen úspěchu GIGO zachování původního proteinového složení zachování modifikací (např. inhibitory fosfatáz)...
Keratiny!!! from skin, hair, nails, wollen clothes. EVERYWHERE a.i. 700 In-gel digestion of very weak Ag stained band 600 500 400 300 zbytky media detergenty netěkavé pufry EGs... 200 100 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 m /z /D = /D ata/z bynek/2003/10_oct/031030/v z_2/0_j11_2r ef/pdata/1 A dm inistrator W ed D ec 10 13:46:44 2003
Standardní 1-D postupy JEDNODUCHÉ SMĚSI 1-D GE Separace proteinů Specifické proteolytické štěpení MALDI-MS/MS LC-MS/MS Specifické proteolytické štěpení Separace naštěpených peptidů 1-D LC-MS/MS shotgun proteomics MS/MS
kda 97.4 66.2 45.0 31.0 GE Proteinový extrakt fága 1-D separace cca 50 bandu Intens. x10 7 2.0 1.5 LC/MSMS Iden. 5 majoritních proteinů 21.5 14.4 1.0 0.5 koncentrační rozsah snížená možnost detekce minoritních komponent rozhoduje instrumentace podmínky LC separace 0.0 0 10 20 30 40 50 60 Time [min]
2-D Klasické 2-D postupy 2-D GE Separace proteinů Specifické proteolytické štěpení MALDI-MS MALDI-MS/MS LC-MS/MS Specifické proteolytické štěpení Separace naštěpených peptidů 2-D LC-MS/MS on-line/off-line LC-MALDI MS/MS
Proteinový extrakt fága 2-D separace 2-D GE/MALDI-MS 700 skvrn 20 proteinů
Protein mix 2-D LC peptides On-line ( MudPIT ) digesce 1D - SCX 2D - RP MS/MS frakcionace step by step Peptide Peptide fraction Peptide Off-line fraction Peptide fraction Peptide 1D - SCX fraction UV Peptide fraction Peptide fraction LC fraction MS/MS 2D - RP Peptide fraction MudPIT (multidimensional protein identification technology)
2-D LC peptides
2-D LC (peptides) 1D-RP 2D-RP, frakce 5 mm 2D-RP, frakce 50 mm 2D-RP, frakce 100 mm Dionex application note
Průměr HPLC kolony vs citlivost Sensitivity increases with a decrease in column diameter because the same sample mass (amount) is eluted in a smaller volume. Therefore the concentration of the eluting peak is higher and the detection signal is stronger. Amer. Lab., 2001, 33 (10), 26-38.
2-D LC peptides sorbenty 1-D: ionex 2-D: reverzní fáze IMAC (fosfoproteiny) affinity (lectin glyko) On-line vs Off-line automatizace flexibilita optimalizace kontinuální odběr frakcí
LC MALDI (peptides) Peptide fraction nano LC (RP) on-line ESI-MS/MS Depozice na MALDI target off-line MALDI TOF/TOF MS Archivace
LC separace komplexních proteinových směsí exp. exp. Protein mix Protein 1D frakce Frakcionace I. Ionex, SEC,. Frakcionace II. RP Protein 1D frakce Protein 2D frakce Různé druhy detekce Protein 2D frakce digesce 1D (2D) HPLC ESI-MS/MS
LC separace komplexních proteinových směsí
LC MALDI (proteins) Protein mix (2 D) LC CE 2. Digesce na destičce 1. Depozice na MALDI target off-line MALDI TOF/TOF
Kombinace GE a HPLC separace 1-D GE slices protein fractionation digesce nano 1-D LC ESI-MSMS nebo IPG strip často používané pro analýzu proteinových komplexů
2D-Off-line (3D?) 2D-On-line from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16, 3285 3303.
from Carter et. al. The Plant Cell, 2004, 16, 3285 3303.
Celková analýza proteomu (screening) Depletovaná plazma (3500 9000 proteinů??) 0. rozměr IEF (liq) 1. rozměr 20 frakcí LC (RP) 2. rozměr 1600 frakcí GE (1D/2D) 3/4. rozměr frakcí from H. Wang, Molecular & Cellular Proteomics, 2005, 4, 618 625.
Cílená analýza imunoafinitní frakcionace (Y(phos)) from A.D. Zoumaro-Djayoon et al. / Methods 56 (2012) 268 274
Cílená analýza jednotlivých proteinů Parent mass CID Fragment mass Q1 fix Q3 fix Q1 Q2 Q3 kvadrupol Q1 i Q3 jsou nastaveny na vybrané hodnoty m/z (prekurzoru a vybraného fragmentu), zaznamenány jsou jen prekurzory, z kterých při fragmentaci v kolizní cele Q2 vzniká určený fragment během analýzy lze sledovat více reakcí (MRM) from K. Bluemlein et al. / Nature protocols 6 (2011) 859 869
High throughput
+ Miniaturizace - chip technologie
MS Charakterizace Modifikací Phos
N-terminus C-terminus b- ion serie y- ion serie b 1 b 2 + + + + y 1 y 2 + + b 3 y 3 b 4 + + y 4
Fragmentace peptidů CID vs ETD b, y c, z C-terminus (z- serie) CID ETD N-terminus (c-serie)
Proč analýza modifikací proteinů? Možnosti MS při analýze modifikací Druh Místo Úroveň
Druhy modifikací: mutace (záměna AMK) chemické posttranslační Užitečný přehled modifikací: DeltaMass http://www.abrf.org/index.cfm/dm.home ExPASy - http://www.expasy.ch/
Chemické modifikace: záměrné modifikace (karbamidometylace Cys, N terminal acetylace, PSD derivatizace, kvantifikační značky aj.) nechtěné modifikace (oxidace Met, deamidace N D při purifikaci, adukty farmak)
Common Posttranslational Modifications Methylation +14.0269 Formylation +28.0104 Acetylation +42.0373 Lipoic acid +188.3147 Amines (K/N-terminus) Farnesylation +204.3556 Myristoylation +210.3598 Biotinylation +226.2994 Palmitoylation +238.4136 Stearoylation +266.4674 Geranylgeranylation +272.4741 Acids & amides (E/D/Q/N) Pyroglutamic acid (Q) -17.0306 Deamidation (Q/N) +0.9847 Carboxylation (E/D) +44.0098 Hydroxyl groups (S/T/Y) Phosphorylation +79.9799 Sulphation +80.0642 Carbohydrates (S/T/N) Pentoses +132.1161 Deoxyhexoses +146.1430 Hexosamines +161.1577 Hexoses +162.1424 N-acetylhexosamines +203.1950 Sialic acid +291.2579 Další detaily: http://web.indstate.edu/thcme/mwking/protein-modifications.html
MS Charakterizace mutací
Potvrzení výměny AMK na peptidové úrovni Protein: Zm-p60 (pozice 186) wild type 179-203 NWLTFNEPQTFTSFSYGTGVFAPGR 2824 E186Q Q 2823 peptide mass difference: - 1 Da In-gel digesce MALDI-TOF MS a.i. 2799.85 1000 900 800 700 2799.73 Zm-p60.1 E186Q 2823. 82 600 500 1 Da 400 Zm-p60.1 wild type 2824. 65 300 2800 2810 2820 2830 m/z
Identifikace výměny AMK na aminokyselinové úrovni Protein ve dvou variantách v jednom spotu na 2-D gelu Vstupní informace: Změna hmotnosti tryptického peptidu: 14 Da... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG... MALDI-MS MALDI-PSD potvrzení změny hmotnosti daného peptidu (2 proteázy) nejednoznačné výsledky LC-MSMS nalezena mutace D/E v pozici 210... DEEELQKENVKNTASLTGKITLSVTQSKPETGEVIGVFESIQPSDTDLGAKVPKDVKIQG...
300 200 100 MSMS peptidu LSVTQSKPXTGEVIGVFES, MW 2006.0 (1992.0) Modif - detail MS/MS spektra D 927.2 945.0 +MS2(997.4), 32.6min (#887) 1+ 956.4-14 Intens. 400 300 200 EIC chromatogram Modif MS2 (997.4, 2+) m/z 956 0 m/z 100 300 200 100 Ion b 9 LSVTQSKPX Nemodif detail MS/MS spektra E 951.7 933.5 D / E +MS2(1004.0), 32.1min (#878) 1+ 970.6 0 Intens. 300 200 100 30.5 31.0 31.5 32.0 32.5 33.0 33.5 Time [min] EIC chromatogram m/z 970 Nemodif MS2 (1004.4, 2+) 0 920 930 940 950 960 970 m/z m/z 0 30.5 31.0 31.5 32.0 32.5 33.0 33.5 Time [min] Rt (min)
LC-MSMS methylace, potvrzení D v pozici 210 po derivatizaci výměna H za CH3 na karboxy skupině tj. Da/skupinu y 8 VTQSKPX*TGE*VIG* Da y 8 nederiv m/z 787.2 pro D y 8 methyl m/z 829.3 pro D
MSMS peptidu VTQSKPXTGEVIG před a po methylaci [Abs. Int.] 550 500 450 400 y 8 787.7 42 Da y 8 829.3 350 300 250 200 150 100 50 0 750 760 770 780 790 800 810 820 830 840 850 m/z
MS Charakterizace modifikací chemické
MALDI MS spektrum digestů před a po modifikaci nemodifikovaný peptid 2060 (výřez spektra) 162 Da Peptid + X 2222
a.i. 1200 MALDI MS spektrum Oxidace Met (výřez spektra) 1100 1000 900 800 16 Da Sample prep artefact (Sypro Ruby) 700 600 500 400 300 200 100 1256 1261 1266 1271 1276 m/z
Výsledek identifikace proteinu (Mascot) 1. gi 15803837 Mass: 13532 Score: 487 Queries matched: 5 50S ribosomal protein L14 [Escherichia coli O157:H7] Observed Mr(expt) Mr(calc) Delta Miss Score Peptide. 939.45 1876.89 1876.88 0.02 0 (125) MIQEQTMLNVADNSGAR 947.44 1892.87 1892.87-0.01 0 159 MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) 947.45 1892.88 1892.87 0.01 0 (147) MIQEQTMLNVADNSGAR + Oxidation (M) 955.45 1908.89 1908.87 0.03 0 (118) MIQEQTMLNVADNSGAR + 2 Oxidation (M). m/z 8 (16). 16 (32) Jen část týkající se modifikovaného peptidu (Petra P. Vz. 3, 080821)
LC-MS/MS EIC: m/z 939.5 (2+) m/z 947.4 (2+) m/z 955.4 (2+) 1x Ox 1x Ox 2x Ox
MS/MS spektrum nemodifikovaného peptidu - MIQEQTMLNVADNSGAR Abs. b Int. * 1000 E Q T M L N V A D N S G A y R A G S N D A V N L M T 903.396 120 y 9 690.316 110 y 7 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 175.000 y 1 303.140 y 3 246.056 y 2 390.198 y 4 373.230 b 3 504.285 y 5 502.227 b 4 619.285 y 6 862.373 b 7 630.269 b 5 731.326 b 6 789.388 y 8 975.463 b 8 1016.528 y 10 1089.552 b 9 1259.676 b 11 1188.612 b 10 1147.592 y 11 1248.657 y 12 1374.689 b 12 1488.738 b 13 1575.759 b 14 1505.698 y 14 1703.916 b 16 1632.827 b 15 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z
y 11 y 10 MIQEQTMLNVADNSGAR b 9 b 9 M 1 IQEQTM 7 LN y 10 LNVADNSGAR y 11 M 7 LNVADNSGAR Posuny v m/z vybraných fragmentů pro jednotlivé případy M (ox) bez 1 Ox 1 Ox 2 Ox M 1 M 7 oba y 10 0 0 0 0 y 11 0 0 16 16 b 9 0 16 16 32
Abs. b Int. * 1000 N V y L M T 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 y 10 1016.528 y 10 1016,5 y 10 LNVADNSGAR y 11 M 7 LNVADNSGAR b 9 M 1 IQEQTM 7 LN b 9 1089.552 b 9 1089,5 nemodifikovaný 1147.592 y 11 y 11 1147,6 0 1020 1040 1060 1080 1100 1120 1140 1160 1180 m/z Abs. b Int. * 1000 N V y L M T 1016.516 y 10 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 y 10 1016,5 M1 - ox + posun celé b serie (b 3 - M 1 IQ) 1147.568 y 11 y 11 +16 0 1105.517 b 9 b 9 1147,6 1105,5 0 1020 1040 1060 1080 1100 1120 1140 1160 1180 m/z Abs. b Int. * 1000 N V y L M* T 1016.507 22 y 10 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 y 10 1016,5 M7 - ox +16 1105.526 +16 b 9 b 9 1105,5 1163.569 y 11 y 11 1163,6 0 1020 1040 1060 1080 1100 1120 1140 1160 1180 m/z Abs. b Int. * 1000 N V y L M* T 1.4 1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 1016.543 y 10 y 10 1016,5 M1, M7- ox +32 1121.505 b 9 b 9 1121,5 +16 1163.578 y 11 y 11 1163,6 0.0 1020 1040 1060 1080 1100 1120 1140 1160 1180 m/z
LC-MSMS spectrum (výřez spektra) VC*AR Potrzení modifikace na Cys Intens. x10 4 1.25 3000 C + modifikace y 4 448.2 y 3 * 493.3 1.00 y 3 349.3 2000 0.75 C modifikace 285.4 0.50 y 2 314.9 522.2 268.1 315.3 441.4 1000 0.25 200.3 200.4 y 2 246.1 246.4 285.5 300.0 383.3 384.0 410.5 410.1 428.2 455.9 468.1 478.5 0.000 200 250 300 350 400 450 500 m/z
Intens. [a.u.] Histon H3, lokalizace acetylace (in-vitro) MALDI-MS digestu (detail spektra) 5340 Non-acetylated fragment Ac 5382 Fragment with one E Ac 5340 1500 1250 1000 Ac? 750 500 Fragment with two E Ac 250 0 5250 5300 5350 5400 5450 5500 5550 5600 5650 5700 5750 m/z
c 14 Histon H3, lokalizace acetylace K(14) MALDI-ISD MS (detail spektra) c 13 ARTKQTARKSTGGKAPR Abs. c Int. * 1000 T G G K 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 T G G K* 1246.4 c 11 1246.8 c 11 1303.4 c 12 1303.8 c 12 1360.4 c 13 1360.8 c 13 1488.9 c 14 42 Da 1530.4 c 14 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550 m/z
Konec III. části