Mentype AMLplex QS. Návod k použití. Důkaz chromozomálních aberací Akutní myeloidní leukémie. Diagnostika in vitro. Vyrobeno v Německu

Návod k použití Důkaz chromozomálních aberací Akutní myeloidní leukémie Diagnostika in vitro Srpen 2019 45-31220-0010 45-31220-0025 45-31220-0100 45-31220-0400 Biotype GmbH Moritzburger Weg 67 D-01109 Dresden Německo Vyrobeno v Německu

2 Společnost Biotype GmbH vyvíjí, vyrábí a prodává aplikace pro lékařskou diagnostiku, založené na PCR (polymerázová řetězová reakce). Naše testovací sady Mentype zaručují nejvyšší standardy kvality. V případě informací a podnětů jsme vám ochotně k dispozici. Kontaktujte nás nebo navštivte naši domovskou stránku www.biotype.de.

3 Obsah 1. Použití v souladu s určením... 5 2. Základní informace... 5 3. Popis produktu... 5 3.1 Nástroje... 7 3.2 Typ vzorků... 7 4. Výstražná a bezpečnostní upozornění... 8 4.1 Zajišťování kvality... 8 5. Materiály dodané společně se sadou... 9 5.1 Obsah sady... 9 5.2 Informace o objednávce... 9 5.3 Reagencie a vybavení, které jsou potřebné navíc (nejsou součástí sady)... 9 6. Skladování... 11 7. Pracovní postup... 12 7.1 Příprava vzorků a použité objemy cdna... 12 7.1.1 Izolace RNA... 12 7.1.2 Transkripce RNA na cdna... 12 7.1.3 Použití vzorů cdna... 12 7.2 Příprava master mixu... 13 7.2.1 Pozitivní kontrola... 13 7.2.2 Negativní kontrola... 14 7.3 Reakční objem... 15 8. Program PCR a amplifikace... 16 9. Kapilární gelová elektroforéza... 17 9.1 Elektroforéza na genetickém analyzátoru ABI PRISM 310... 17 9.1.1 Vytvoření matrice... 17 9.1.2 Příprava vzorků... 21 9.1.3 Nastavení softwaru Data Collection... 22 9.2 Elektroforéza na genetickém analyzátoru ABI PRISM 3100-Avant/3100... 22 9.2.1 Spektrální kalibrace / vytvoření matrice... 23 9.2.2 Příprava vzorků... 25 9.2.3 Nastavení softwaru Data Collection... 26 9.3 Elektroforéza na genetickém analyzátoru ABI PRISM 3130/3130xl... 28 9.3.1 Spektrální kalibrace / vytvoření matrice... 29 9.3.2 Příprava vzorků... 33 9.3.3 Nastavení softwaru Data Collection... 33 9.4 Elektroforéza pomocí genetického analyzátoru ABI PRISM 3500/3500xL... 36 9.4.1 Spektrální kalibrace / vytvoření matrice... 37 9.4.2 Příprava vzorků... 40 9.4.3 Nastavení pro spuštění... 41 10. Vyhodnocení dat... 45

4 10.1 Software a předlohy pro vyhodnocení... 45 10.2 Postup při vyhodnocování dat... 46 10.2.1 Všeobecné minimální požadavky při vyhodnocování dat... 46 10.2.2 Kontrola standardu délky Size Standard 550 (BTO)... 47 10.2.3 Kontrola alelického ladderu/allelic Ladder... 47 10.2.4 Test Control cdna KAS-1... 50 10.2.5 Test negativní kontroly... 50 10.2.6 Vyhodnocení dat vzorků... 51 11. Řešení problémů... 53 11.1 Detekční limit... 53 11.2 Průsvity (Pull-up Peaks)... 53 11.3 Přidání nukleotidů, které je nezávislé na vzoru... 53 11.4 Artefakty... 53 11.5 Vliv typu polymeru... 54 12. Objednací informace... 55 13. Reference... 56 14. Značky a vyloučení ručení... 57 15. Symboly... 58 A Analytická validace... 59 A a) Stanovení standardní reakce a tolerancí specifických pro šarže... 59 A b) Testování přesnosti měření... 59 A c) Testování analytické specifičnosti... 60 A c) a) Testování analytické specifičnosti podle předběžně negativně typizovaných cdna... 60 A c) b) Testování analytické specifičnosti podle předběžně pozitivně typizované cdna 60 A d) Testování analytické senzitivity... 60 A e) Testování různých termocyclerů PCR... 61 A f) Testování vlivu různých teplot annealingu v PCR... 61 A g) Testování různých pufrových šarží PCR... 61 A h) Trvanlivost po otevření... 62 B Klinické údaje o výkonu... 63 B a) Odběr vzorků, etická a regulační hlediska... 63 B b) Srovnávací testování... 63 B c) Extrakce DNA a přečištění... 63 B d) Výsledky... 63 B e) Literatura o biomarkerech a jejich sekvencích DNA... 65

5 1. Použití v souladu s určením Sada je určena pro kvalitativní důkaz 34 variant genových transkriptů, které mohou vzniknout v případě určitých subtypů akutní myeloidní leukémie (AML) chromozomálními translokacemi (somatické mutace) s podílem 11 různých genových fúzí. Aplikace jsou určeny výhradně pro profesionální použití ve specializovaných laboratořích. Personál by měl být vyškolen pro techniky PCR a použití diagnostiky in vitro. 2. Základní informace Důkaz specifických chromozomálních aberací má velký prognostický význam, a je proto nezbytný pro diagnostiku akutních leukémií. Identifikace specifických genetických translokací umožňuje klasifikaci subtypů leukémie, čímž podporuje léčbu pacientů, která je přizpůsobena riziku. Sada umožňuje robustní identifikaci pro léčbu významných chromozomálních aberací, které jsou základem akutní myeloidní leukémie (AML). Tuto identifikaci lze v rutinní diagnostice pomocí této sady snadno provést. 3. Popis produktu identifikuje při metodě s využitím několika parametrů 34 transkripčních variant následujících fúzních genů: RUNX1-RUNX1T1, BCR-ABL, PICALM-MLLT10, CBFB-MYH11, DEK-NUP214, KMT2A-MLLT4, KMT2A-MLLT3, KMT2A - ELL, KMT2A -PTD, NPM1-MLF1 a PML-RARA (srv. Tabulka 1). Výsledky jsou zabezpečeny dvěma interními kontrolami. Interní kontrola PCR (senzor kvality QS-Control ) zobrazuje úspěšnost amplifikační reakce; kontrola cdna (ABL-Control) je připojena k sadě pro zobrazení kvality použité cdna. Test se provádí fragmentační analýzou pomocí kapilární gelové elektroforézy. Primery jsou značeny fluorescenčními barvivy 6-FAM, BTG nebo BTY.

6 Tabulka 1 Genové fúze a varianty transkriptů, které lze prokázat pomocí Genová fúze Chromozomální aberace Varianta RUNX1-RUNX1T1 t(8;21) (q22;q22) - (AML1-ETO) BCR-ABL t(9;22) (q34;q11) e1a3 PICALM-MLLT10 (CALM-AF10) t(10;11) (p13;q14) e1a2 b3a2 b3a3 b2a2 b2a3 CBFB-MYH11 inv(16) (p13;q22) Type A DEK-NUP214 (DEK-CAN) t(6;9) (p23;q34) - KMT2A-MLLT4 (MLL-AF6) t(6;11) (q27;q23) - MLLT10_240-PICALM_1987 MLLT10_240-PICALM_2092 Type B Type C Type D Type E Type F Type G Type H Type I Type J KMT2A-MLLT3 (MLL-AF9) t(9;11) (p22;q23) 6A_(THP-1) 7A_(10A) 8A_(MM6) 6B_(9B) KMT2A-ELL (MLL-ELL) t(11;19) (q23;p13.1) e10e2 KMT2A-PTD (MLL-PTD) Parciální tandemová duplikace NPM1-MLF1 t(3;5) (q25.1;q34) - e10e3 e9e3 e10e3 e11e3 PML-RARA t(15;17) (q22;q21) bcr1 (PR-L) bcr2 (PR-V) bcr3 (PR-S)

7 3.1 Nástroje Sady byly verifikovány a validovány na těchto cyclerech PCR: GeneAmp TM 9700 Silver Thermocycler (Applied Biosystems TM ) Eppendorf Mastercycler ep-s (Eppendorf AG) Biometra T1 (Analytik Jena AG) Sady byly verifikovány a validovány na těchto systémech kapilární gelové elektroforézy za použití POP-4TM (Applied Biosystems TM ) a délky kapilár 36 cm, použití POP-7 TM bylo verifikováno: ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems TM ) ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems TM ) ABI PRISM 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems TM ) Vyhodnocení dat bylo verifikováno pomocí těchto softwarových verzí: GeneMapper TM ID 3.2 (Applied Biosystems TM ) GeneMapper TM ID-X 1.4 (Applied Biosystems TM ) Použití sad na jiných nástrojích nebo s jiným softwarem než s tím, který je uveden výše, musí být uživatelem validováno a verifikováno na vlastní odpovědnost. 3.2 Typ vzorků byly validovány s cdna, transkribované z RNA, která byla izolována z plné krve s citrátem. Produkt je validován pro použití 1 µl cdna, která bude validována z 1 µg RNA v reakčním objemu 20 µl. Použití větších množství cdna musí být uživatelem validováno.

8 4. Výstražná a bezpečnostní upozornění V této sadě je obsažena následující potenciálně nebezpečná látka: Tabulka 2 Potenciálně nebezpečné složky sad Složka sady Chemikálie Nebezpečí Reakční mix A Azid sodný NaN3 Toxický při polknutí, při kontaktu s kyselinou vyvíjí toxické plyny Řiďte se prosím bezpečnostními listy (BL) produktů Biotype, které vám na vyžádání ochotně zašleme (support@biotype.de). Pro bezpečnostní listy reagencií, které nejsou obsaženy v testovací sadě, kontaktujte prosím příslušného výrobce. Před použitím produktu si pozorně přečtěte návod k použití. Po obdržení produktu a jeho složek zkontrolujte, zda je kompletní - počet, typ a plnění (viz kapitola 5.1, Obsah sady), správné označení, zmrazený stav reagencií a neporušenost jejich obalu. Při použití testů noste rukavice, laboratorní plášť a popř. ochranu očí. Zabraňte kontaminaci vzorků nukleázou (DNáza / RNáza) použitím jednorázových pipetových špiček bez DNázy / RNázy s filtry absorbujícími aerosol. Použijte oddělené pracovní prostory pro přípravu vzorků (pre-pcr), preparaci mastermixu a následnou úpravu vzorků a analýzu (post-pcr). Pozitivní kontroly skladujte v prostoru odděleném od složek sad. Podle směrnic nebo požadavků místních, státních a / nebo federálních předpisů či akreditačních organizací mohou být potřebné dodatečné kontroly. Nepoužívejte složky sady, které překročily své datum skončení trvanlivosti a nemíchejte šarže. Odpady ze vzorků a testů likvidujte podle místních bezpečnostních ustanovení. 4.1 Zajišťování kvality Celý obsah testovací sady je podrobován intenzivnímu zajištění kvality ve společnosti Biotype GmbH. Kvalita testovacích sad je nepřetržitě kontrolována, aby byla dokumentována neomezená použitelnost. V případě dotazů na zajištění kvality nás prosím kontaktujte na e- mailovou adresu info@biotype.de.

9 5. Materiály dodané společně se sadou 5.1 Obsah sady Sady obsahují tyto složky, které postačí pro provedení 10, 25, 100 nebo 400 reakcí. Tabulka3 Velikosti balení a složky obsažené v sadách Složka sady / reagent Objem na velikost balení 10 reakcí 25 reakcí 100 reakcí 400 reakcí Nuclease-free Water 1 x 1,5 ml 1 x 1,5 ml 2 x 1,5 ml 6 x 1,5 ml Reaction Mix A 1 x 250 µl 1 x 250 µl 1 x 500 µl 2 x 1,0 ml Primer Mix 1 x 25 µl 1 x 63 µl 1 x 250 µl 4 x 250 µl MultiTaq2 DNA Polymerase 1 x 10 µl 1 x 10 µl 1 x 40 µl 1 x 160 µl Control cdna KAS-1 1 x 10 µl 1 x 10 µl 1 x 10 µl 1 x 10 µl Allelic Ladder AMLplex 1 x 25 µl 1 x 25 µl 1 x 25 µl 4 x 25 µl Size Standard 550 (BTO) 1 x 13 µl 1 x 13 µl 1 x 50 µl 1 x 200 µl 5.2 Informace o objednávce Písemnou objednávku prosím zašlete e-mailem na sales@biotype.de. Objednávka musí obsahovat objednací čísla podle Tabulka 4 a Tabulka 44, strana 55. Tabulka 4 Objednací čísla sad Produkt Velikost balení Obj. č. 10 reakcí 45-31220-0010 25 reakcí 45-31220-0025 100 reakcí 45-31220-0100 400 reakcí 45-31220-0400 5.3 Reagencie a vybavení, které jsou potřebné navíc (nejsou součástí sady) Pro počáteční kalibraci zařízení pro kapilární gelovou elektroforézu na specifická fluorescenční barviva sady Menytpe AMLplex QS musí být provedena spektrální kalibrace pomocí následující reagencie firmy Firma Biotype GmbH (Tabulka 5):

10 Tabulka 5 Navíc požadované reagencie společnosti Biotype GmbH Reagencie Matricový standard BT5 single Matricový standard BT5 multi Matricový standard BT5 multi Použití Spektrální kalibrace systému kapilární gelové elektroforézy (jedna kapilára) Spektrální kalibrace systému kapilární gelové elektroforézy (více kapilár) Spektrální kalibrace systému kapilární gelové elektroforézy (více kapilár) Velikost balení Obj. č. 5 x 25 µl 00-10411-0025 1 x 25 µl. 00-10421-0025 2 x 25 µl. 00-10421-0050 K provedení sady jsou potřebné tyto obecné materiály a nástroje: stolní centrifuga s rotorem pro 2ml reakční nádoby mikrotitrační destičky s 96 jamkami nebo 0,2ml reakční trubičky, v případě použití mikrotitračních destiček s 96 jamkami vhodná víka nebo fólie, centrifuga s rotorem na mikrotitrační destičky mixér Vortex, vhodný pro mikrotitrační destičky s 96 jamkami nebo 0,2ml reakční trubičky pipety, pipetové špičky s filtry (jednorázové) jednorázové rukavice bez pudru Vhodná sada na izolaci RNA (srv. kapitola 7.1.1, Izolace RNA) vhodný nástroj pro kvantitativní měření koncentrace RNA po izolaci a přečištění (srv. kapitola 7.1.1, Izolace RNA) vhodná sada pro transkripci RNA na cdna (srv. 7.1.2, Transkripce RNA na cdna) blok ledu pro krátkodobé skladování polymerázy vhodný cycler PCR (srv. kapitola 3.1, Nástroje) Hi-Di TM Formamide (Applied Biosystems TM ) reagencie a spotřební materiály systému kapilární gelové elektroforézy vhodný nástroj na kapilární gelové elektroforézu (srv. kapitola 3.1, Nástroje) Upozornění: Zajistěte, aby byly všechny přístroje instalovány, prováděna jejich údržba a kalibrovány podle podmínek výrobce. Přesvědčte se, že jsou k dispozici všechny reagencie k provozování příslušného PCR a nástroje pro kapilární gelové elektroforézu (viz návod k použití od příslušného výrobce přístroje).

11 6. Skladování Sady jsou expedovány na tuhém oxidu uhličitém. Složky sady budou doručeny zmrazené. Pokud by jedna nebo více složek nebylo po obdržení zmrazených, nebo by došlo k poškození zkumavek během přepravy, obraťte se pro další podporu na společnost Biotype GmbH (support@biotype.de). Složky musí být skladovány při -25 C až -15 C. Kontrolní cdna a reagencie post-pcr (alelické laddery a size standard BTO) by měly být skladovány odděleně od reagencií PCR. Zabraňte opakovanému rozmrazení a zmrazení. Maximální počet 20 cyklů rozmrazení a zmrazení nesmí být překročen. Sady musí být uchovávány tak, aby byly chráněny před světlem. Trvanlivost testovací sady je uvedena na obalovém štítku.

12 7. Pracovní postup 7.1 Příprava vzorků a použité objemy cdna 7.1.1 Izolace RNA Kvalita izolované RNA má rozhodující vliv na výkon a kvalitu celého testovacího systému. Musí být zajištěno, aby byl systém použitý k izolování RNA kompatibilní s technologií PCR. Následující sady byly testovány pro izolaci RNA a jsou vhodné k použití: RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, DE) RNeasy Plus Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, DE) Použití alternativních sad pro izolování RNA musí být na vlastní odpovědnost validováno uživatelem. Upozornění: Pro přesné výsledky je zapotřebí kvantifikace RNA (např. pomocí kvantifikace RNA prostřednictvím UV/VIS spektroskopie při A260 nm a stanovení kvality prostřednictvím poměru A260 / A280, který by měl být v rozmezí 1,7 až 2,0). 7.1.2 Transkripce RNA na cdna Po provedení izolace a kvantifikace RNA se provede transkripce na cdna pomocí běžně dostupných sad. Použití RNA 1 µg v reakční sestavě 20 µl. Transkripční reakce byla validována. Následující sady byly testovány pro transkripci a jsou vhodné k použití: High Capacity cdna Transcription Kit (Applied Biosystems TM ) QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen GmbH, Hilden, DE) Použití alternativních transkripčních sad musí být na vlastní odpovědnost validováno uživatelem. 7.1.3 Použití vzorů cdna Sada byla optimalizována pro použití 1 µl cdna (bez zředění), která byla připravena tak, jak je popsáno v 7.1.2. Množství vzorů může být v případě kritických vzorků pacienta zvýšeno. Maximálně by měla být použita 1/10 objemu reakce RT. V reakční sestavě sady je třeba upravit objem vody bez nukleázy upravit tak, aby byl celkový objem směsi PCR vždy 25 µl. Tento postup musí validovat uživatel na vlastní odpovědnost.

13 7.2 Příprava master mixu Všechny reagencie by měly být před nasazením mastermixu dobře smíchány a krátce centrifugovány (cca 10 s). Multi Taq2 DNA polymerázu uložte během manipulace na blok ledu. Celkový objem PCR reakce musí být vždy 25 µl. U počtu nasazovaných reakcí PCR vždy přihlížejte k pozitivním a negativním kontrolám. K celkovému počtu přidejte jednu nebo dvě reakce, abyste kompenzovali chybu pipetování. Následující přehled ukazuje objemy použitých složek sady s 1,0µl objemem vzorků (vzory cdna) a reakčním objemem 25 µl. Tabulka 6 Sestava master mixu pro reakci při použití 1 µl cdna Součást Nuclease-free Water 16,1 µl Reaction Mix A* 5,0 µl Primer Mix 2,5 µl Multi Taq2 DNA Polymerase (hot start, 2,5 U/µl) 0,4 µl Celkový objem mastermixu 24,0 µl Template cdna 1,0 µl * obsahuje Mg 2+, dntps, BSA 7.2.1 Pozitivní kontrola Objem na sestavu PCR Kontrolní pozitivní kontrolu cdna KAS-1, obsaženou v sadě, nejprve nařeďte beznukleázovou vodou na 250 ng/µl. Pro pozitivní kontrolu použijte místo vzoru cdna 1 µl zředěné pozitivní kontroly Control cdna KAS-1. Do reakční nádoby s master mixem PCR napipetujte místo vzoru cdna kontrolní cdna. Následující přehled ukazuje objemy použitých složek sady s 1 µl kontrolní cdna a reakčním objemem 25 µl.

14 Tabulka7 Sestava master mixu pro reakci s použitím 1 µl vzorku pozitivní kontroly Součást Nuclease-free Water 16,1 µl Reaction Mix A* 5,0 µl Primer Mix 2,5 µl Multi Taq2 DNA Polymerase (hot start, 2,5 U/µl) 0,4 µl Celkový objem mastermixu 24,0 µl Control cdna KAS-1 1,0 µl * obsahuje Mg 2+, dntps, BSA 7.2.2 Negativní kontrola Objem na sestavu PCR Jako negativní kontrolu (No Template Control) napipetujte do reakčních nádob s předlohovým master mixem PCR 1 µl beznukleázové vody. Následující přehled ukazuje objemy použitých složek sady s 1 µl beznukleázové vody a reakčním objemem 25 µl. Tabulka 8 Sestava master mixu negativní kontroly pro reakci Součást Nuclease-free Water 16,1 µl Reaction Mix A* 5,0 µl Primer Mix 2,5 µl Multi Taq2 DNA Polymerase (hot start, 2,5 U/µl) 0,4 µl Celkový objem mastermixu 24,0 µl Negativní kontrola - beznukleázová voda 1,0 µl * obsahuje Mg 2+, dntps, BSA Objem na sestavu PCR Navíc lze rovněž vést již známou cdna, která je ohledně prokazatelných genových fúzí a translokací negativní, jako negativní kontrolní vzorek. Je třeba ji zpracovat jako normální vzorek a použít v PCR jako extra reakci.

15 7.3 Reakční objem Napipetujte 24 µl master mixu PCR do reakčních nádob nebo na multimikrotitrační destičku. Pak přidejte 1 µl cdna nebo 1 µl pozitivní či negativní kontroly. Po pipetování musíte reakční nádoby, resp. multimikrotitrační destičky zavřít. Reakční směsi krátce promíchejte a centrifugujte a poté je dejte do cycleru PCR za účelem amplifikace.

16 8. Program PCR a amplifikace Pro aktivaci DNA polymerázy Multi Taq2 a pro potlačení tvorby nespecifických amplifikačních produktů by měl být proveden hot start. Aby byl stanoven počet potřebných cyklů PCR, může být jako reference použita interní kontrola ABL. V důsledku toho by výška píku neměla překročit specifikovaný měřicí rozsah zařízení (např. 500 až 5000 RFU u ABI 3130). Z důvodu příliš nízké koncentrace cdna může dojít ke statistickým výpadkům (Allelic Dropouts) a nevyváženostem výšek píků. Se zvyšujícím se počtem cyklů stoupá pravděpodobnost nespecifických amplifikačních produktů. Upozornění: Pro optimální rovnováhu sady by měla být rychlost ohřevu a chlazení přístrojů PCR nastavena na 4 C/s.. Tabulka 9 Parametry amplifikace PCR pro implementaci přípravku Teplota Čas Počet cyklů 96 C 4 min. 1 x (hot start pro aktivaci Multi Taq2 DNA polymerázy) 96 C 30 s 61 C 120 s 22-28 x 72 C 75 s 68 C 10 min.* 1 x 10 C hold Pokud dojde ke zvýšeným hladinám adeninových píků (-1 bp), může být tento krok redukován na max. 5 %. 60 min. Počet cyklů je závislý na použitém množství cdna a úrovni exprese detekované transkripční varianty. Byly testovány počty cyklů mezi 22 a 28. Pro referenční vzorky z materiálu buněčné kultury (vysoká míra exprese) doporučujeme snížení cyklů PCR na 22 cyklů. Pro dosažení maximální citlivosti (11.1 Detekční limit) doporučujeme použít maximální počet 28 cyklů.

17 9. Kapilární gelová elektroforéza 9.1 Elektroforéza na genetickém analyzátoru ABI PRISM 310 Všeobecné pokyny k analytickému zařízení, vytvoření matrice a použití softwaru GeneMapper TM najdete v příslušném návodu pro uživatele genetického analyzátoru - ABI PRISM 310. Dále je popsána elektroforéza pomocí softwaru GeneMapper TM ID-X. Pro kombinované použití pěti fluorescenčních barviv 6-FAM, BTG, BTY, BTR a BT0 je určeno použití virtuální sady filtrů G5 (matricový standard je dále označen jako BT5). Tabulka 10 Potřebné materiály pro provoz genetického analyzéru ABI 310 Materiál Kapilára Polymer Pufr Vlastnost 47 cm / 50 µm (zelená) POP-4 for 310 Genetic Analyzer 10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA 9.1.1 Vytvoření matrice Před provedením fragmentační analýzy pomocí sady filtrů G5 musí být nejprve vytvořena matrice s fragmenty PCR příslušných pěti fluorescenčních barviv 6-FAM, BTG, BTY, BTR a BTO pro příslušné analytické zařízení. Tabulka 11 Označení barev standardu matric BT5 single a příslušnost k odpovídajícímu kanálu Barva Blue (B) Green (G) Yellow (Y) Red (R) Orange (O) Matricový standard 6-FAM BTG BTY BTR BTO Za účelem vytvoření vhodných matricových souborů bude provedeno pět elektroforéz za stejných podmínek, jaké platí i pro zkoušky a alelické laddery testovací sady. Pro pět různých fluorescenčních barviv 6-FAM, BTG, BTY, BTR a BTO musí být vždy proveden vlastní elektroforézový běh.

18 Tabulka 12 Sestava matricového standardu BT5 single pro vytvoření matrice na genetickém analyzátoru ABI 310 Matricový vzorek Složky Obsah Matricový vzorek 1 Matricový vzorek 2 Matricový vzorek 3 Matricový vzorek 4 Matricový vzorek 5 Hi-Di Formamide 12,0 µl Matricový standard 6-FAM 1,0 µl Hi-Di Formamide 12,0 µl Matricový standard BTG 1,0 µl Hi-Di Formamide 12,0 µl Matricový standard BTY 1,0 µl Hi-Di Formamide 12,0 µl Matricový standard BTR 1,0 µl Hi-Di Formamide 12,0 µl Matricový standard BTO 1,0 µl Denaturujte vzorky při 95 C po dobu 3 min. v cycleru PCR, zchlaďte vzorky v zařízení na 4 C Vložte vzorky k analýze do nádoby podle návodu k použití od výrobce zařízení Vytvořte seznam vzorků Sample Sheet, vyberte 5 Dyes a označte vzorky Seznam vstřiků pro vytvoření matrice Tabulka 13 Parametry pro vytvoření matrice na genetickém analyzátoru ABI 310 Parametr Nastavení Module File GS STR POP-4 (1 ml) G5 Matrix File NONE Size Standard* NONE Injection [s] 5 Injection [kv] 15.0 Run [kv] 15.0 Run [ C] 60 Run Time [min] 24 * Matricové standardy je třeba vždy připravit bez standardu délky DNA (BTO)

19 Analýza matricových vzorků Spuštění softwaru GeneMapper TM File Add Samples to Project (Otevřít složku příslušného běhu) Klepněte na složku vzorků v levé části obrazovky Označení matricového vzorku Raw Data (v pravé části obrazovky) Ohodnoťte, zda je k dispozici stabilní základní linie. Jak je ukázáno na Obrázek 1, mělo by být v každém matricovém vzorku identifikovatelných minimálně 1 000-4 000 RFU (osa Y) (optimální rozsah: 2 000-4 000 RFU) 2900 Data Points (X) 5400 Obrázek 1 Elektroferogram nezpracovaných dat standardní matrice BT5 single na genetickém analyzátoru ABI 310 Výběr analytického rozsahu se stabilní rovnou základní linií Pokud je základní linie příliš neklidná, vstříkněte matricový vzorek ještě jednou Zaznamenejte počáteční a koncové body (Data Points) oblasti výběru, např. počáteční hodnota 2 900, koncová hodnota 5 400 Vypočtete rozdílovou hodnotu, např. 5 400-2 900 = 2 500 Data Points Vytvoření nové matrice Tools GeneMapper Manager Matrices New Název matrice např. Matrice BT5 v Matrix Settings importujte matricové vzorky pro každou barvu (B, G, Y, R, O) (klepnutím na barevný symbol)

20 Obrázek 2 Výběr matricových vzorků s počátečním bodem a zadáním rozdílové hodnoty Při Start At uveďte příslušný počáteční bod, např. 2 900 Vypočtenou rozdílovou hodnotu, např. 2 500 zaznamenejte u Points Obrázek 3 Hotově vložené matricové soubory a velikost kroku

21 pomocí Create se vypočte nová matrice pomocí OK bude nová matrice uložena Kontrola matrice Zkontrolujte prosím novou matrici pomocí svých aktuálních vzorků. File Add Samples to Project (Otevřít složku příslušného běhu) Add Sample Files v tabulce Sample vyberte nově vygenerovanou matrici proveďte novou analýzu vzorků S novou matricí by nemělo docházet k průsvitu (Pull-up Peaks) mezi různými barevnými panely (B, G, Y, R, O). 9.1.2 Příprava vzorků Tabulka 14 Sestava směsi pro standard velikosti formamidu na každou reakci kapilární gelové elektroforézy Složky Hi-Di Formamide 12,0 µl DNA Size Standard 550 (BTO) 0,5 µl Objem na reakci Předložte 12 µl směsi z Tabulka 14 pro všechny vzorky Do každé jamky přidejte ke směsi 1 µl produktu PCR (popř. zřeďte) nebo alelický ladder Denaturujte vzorky při 95 C po dobu 3 min. v cycleru PCR, zchlaďte vzorky v zařízení na 4 C Vložte vzorky k analýze do nádoby podle návodu k použití od výrobce zařízení Teplota místnosti může vlastnosti běhu produktů PCR silně ovlivnit a příliš nízká teplota způsobí výskyt dvojitých píků (Split Peaks). Podle okolností ovlivní teplota i rychlost běhu fragmentů. Dbejte prosím na to, aby byla dodržena pracovní teplota doporučená výrobcem zařízení. Optimální jsou stabilní pokojové teploty >22 C. Možnosti zvýšení intenzity signálu: Snížení podílů standardu délky DNA 550 (BTO) tak, aby byla výška píků cca 500 relativních fluorescenčních jednotek (RFU)

22 Přečištění produktů PCR před analýzou 9.1.3 Nastavení softwaru Data Collection Vytvořte seznam vzorků Sample Sheet a vzorky označte Seznam vstřiků Tabulka 15 Parametry při sestavování seznamu vstřiků genetického analyzátoru ABI 310 pro analýzu vzorků Parametr Module File Matrix File Size Standard Injection [s]* 5 Injection [kv] 15.0 Run [kv] 15.0 Run [ C] 60 Run Time [min]** 28 Nastavení GS STR POP-4 (1 ml) G5 např. Matrix BT5 např. SST-BTO_60-550bp * Na rozdíl od standardního nastavení může doba vstřiku v závislosti na vzorku činit 1-20 s. U referenčních vzorků s velmi vysokou výškou píku může být zvolena kratší doba vstřiku, aby se zabránilo průsvitům. V případě menšího množství cdna nebo u kritického materiálu pacienta může být nutností až 20 s. ** V závislosti na podmínkách analýzy by měla být doba běhu pro upravena tak, aby bylo možné analyzovat fragmenty o délce až 550 bp. 9.2 Elektroforéza na genetickém analyzátoru ABI PRISM 3100-Avant/3100 Obecné pokyny k analytickému zařízení, spektrální kalibraci a použití softwaru ABI PRISM 3100 Data Collection, verze 1.01 nebo 1.1 i softwaru GeneScan jsou uvedeny v příslušné uživatelské příručce pro genetický analyzátor ABI PRISM 3100-Avant/3100. Systémy se softwarem Data Collection 2.0 nebo 3.0, viz kapitola 6. Systém se 4 kapilárami se jmenuje ABI 3100-Avant a systém s 16 kapilárami se jmenuje ABI 3100. Pro kombinované použití pěti fluorescenčních barviv 6-FAM, BTG, BTY, BTR a BT0 je určeno použití virtuální sady filtrů G5 (matricový standard je dále označen jako BT5).

23 Tabulka 16 Potřebné materiály pro provoz genetického analyzéru ABI 3100 Materiál Vlastnost Kapilára* 36 cm Capillary Array for 3100-Avant/3100 Polymer* POP-4 Polymer for 3100 Pufr 10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA *jsou možná jiná nastavení zařízení 9.2.1 Spektrální kalibrace / vytvoření matrice Před provedením fragmentační analýzy je nejprve nutné provést spektrální kalibraci na genetickém analyzátoru ABI PRISM 3100-Avant/3100. Tímto způsobem bude vytvořena matrice, která koriguje překrytí barevně specifických spekter fluorescenčních emisí. Spektrální kalibrace zahrnuje tyto kroky: Příprava matricového standardu pro spektrální kalibraci Nanesení standardu na 96jamkovou destičku (každá kapilára jeden vzorek) Zadání složení destičky Provedení běhu pro spektrální kalibraci a kontrola matrice Příprava matricového standardu pro spektrální kalibraci Připravte směs HiDi TM formamidu a matricového standardu BT5 multi. Tabulka 17 Sestava matricového standardu BT5 multi pro genetický analyzátor ABI 3100 Objem pro 4 kapiláry Objem pro 16 kapilár Složky (ABI 3100-Avant) (ABI 3100) Hi-Di Formamide 60,0 µl 204,0 µl Matricový standard BT5 5,0 µl 17,0 µl Pozice A1-D1 A1-H1 a A2-H2 Naneste 12 µl směsi na 96jamkovou destičku (specifická pozice viztabulka 17) Denaturujte vzorky při 95 C po dobu 3 min. v cycleru PCR, zchlaďte vzorky v zařízení na 4 C Vložte vzorky k analýze do nádoby podle návodu k použití od výrobce zařízení

24 Provádění spektrální kalibrace Aby bylo možné provést úspěšnou kalibraci pomocí softwaru Data Collection, verze 1.0.1 nebo 1.1, je nejprve nutné jednorázově změnit parametry spektrální kalibrace pro DyeSetG5. Spektrální parametry Změna nastavení parametrů pomocí cesty: D:\AppliedBio\Support Files\Data Collection Support Files\ CalibrationData\Spectral Calibration\ ParamFiles Pro otevření souboru PAR zvolte MtxStd{Genescan_SetG5} Změna rozmezí podmínek na [1.0;20.0] Pro uložení souboru parametrů pod novým názvem zvolte File Save As, např. MtxStd{Genescan_SetG5_BT5}.par Pro spektrální kalibraci pomocí matricového standardu Biotype BT5 vždy použijte právě vytvořený soubor parametrů. Editor destiček pro spektrální kalibraci (I) Připravenou 96jamkovou destičku vložte do autosampleru Otevření softwaru ABI PRISM 3100 Data Collection V Plate View softwaru 3100 Data Collection klepněte na New. Otevře se dialog Plate Editor Zadejte název destičky Vyberte Spectral Calibration Jako typ destičky vyberte96-well a zvolte Finish Editor destiček pro spektrální kalibraci (II) Tabulka 18 Parametry v editoru destiček pro spektrální kalibraci Parametr Sample Name Dye Set Spectral Run Module Spectral Parameters Nastavení Pojmenování vzorků matrice G5 Default (např. Spect36_POP4) MtxStd{GeneScan_SetG5_BT5}.par (parametr vytvořen dříve)

25 Celý sloupec vyberte klepnutím na buňku tabulky zcela nahoře, pomocí Edit Fill Down přidejte informace k vybraným matricovým vzorkům a potvrďte pomocí OK Spojte 96jamkovou destičku s právě vytvořeným označením s autosamplerem a spusťte běh Po běhu zkontrolujte v Spectral Calibration Result, zda byly všechny kapiláry úspěšně zkalibrovány (identifikátor A). V případě identifikátoru X je nutné se řídit pokyny v uživatelské příručce genetického analyzátoru ABI PRISM Pro potvrzení běhu klepněte na OK Kontrola matrice Pro kontrolu spektrální kalibrace každé kapiláry zvolte Tools Display Spectral Calibration Dye Set G5 Každá kapilára by měla mít hodnotu kvality (Q Value) minimálně 0,95 a číslo podmínky (C Value) mezi 1 až 20. Obě hodnoty se musejí nacházet v předem stanoveném rozmezí Ohodnoťte, zda je k dispozici stabilní základní linie. V každé kapiláře musí být možné identifikovat pět píků s výškou 1 000-5 000 RFU (osa Y) (optimální rozsah: 2 000-4 000 RFU) Zkontrolujte prosím novou matrici pomocí svých aktuálních vzorků. S novou matricí by nemělo docházet k průsvitům (Pull-up Peaks) mezi různými barevnými panely (B, G, Y, R, O) Pokud všechny kapiláry úspěšně prošly kalibrací, musí být ručně aktivován aktuální kalibrační soubor pro Dye Set G5 v Tools Set Active Spectral Calibration. Přejmenování je možné pomocí Set Matrix Name (např. BT5_Datum kalibrace) Pokud kalibrace nebyla úspěšná, pokuste se vzorky znovu nastříknout s vyšší dobou vstřiku nebo intenzitou proudu. K tomu je třeba změnit Spectral Run Module. Vzorky lze znovu nastříknout až třikrát. Případně použijte více matricového standardu pro kalibraci. 9.2.2 Příprava vzorků Tabulka 19 Sestava vzorku pro přípravu na kapilární gelovou elektroforézu Složky Objem na reakci Hi-Di Formamide 12,0 µl DNA Size Standard 550 (BTO) 0,5 µl Předložte 12 µl směsi z Tabulka 19 pro všechny vzorky Do každé jamky přidejte ke směsi 1 µl produktu PCR (popř. zřeďte) nebo alelický ladder

26 Denaturujte vzorky při 95 C po dobu 3 min. v cycleru PCR, zchlaďte vzorky v zařízení na 4 C Vložte vzorky k analýze do nádoby podle návodu k použití od výrobce zařízení Protože se injekce uskuteční na všech kapilárách současně, je třeba vždy 4 nebo 16 vzorků napipetovaných do destičky. Je-li měřeno méně vzorků, musejí být pozice bez vzorků naplněny 12 µl Hi-Di formamidu. Pro zajištění spolehlivých výsledků na multikapilárním zařízení by mělo být nezávisle na počtu vzorků spuštěno několik alelických ladderů. Teplota místnosti může vlastnosti běhu produktů PCR produktů na multikapilárních zařízeních silně ovlivnit a příliš nízká teplota způsobí výskyt dvojitých píků (Split Peaks). Podle okolností ovlivní teplota i rychlost běhu fragmentů. Dbejte prosím na to, aby byla dodržena pracovní teplota doporučená výrobcem zařízení. Optimální jsou stabilní pokojové teploty >22 C. Možnosti zvýšení intenzity signálu: Snížení podílu standardu délky DNA 550 (BTO) tak, aby byla výška píků cca 500 relativních fluorescenčních jednotek (RFU) Přečištění produktů PCR před analýzou 9.2.3 Nastavení softwaru Data Collection Před prvním během musí být předběžně nastavený modul běhu jednorázově editován v Dye Set G5: Klepněte na Module Editor a otevřete dialogové okno Z tabulky GeneScan vyberte příslušný Run Module jako předlohu Změňte napětí (Injection Voltage) na 3 kv a dobu vstřiku (Injection Time) na 10 s

27 Run Module 3kV_10s_550bp Tabulka 20 Nastavení modulu běhu pro analýzu vzorků Parametr Run Temperature [ C] Cap Fill Volume Maximum Current [A] Current Tolerance [A] Run Current [A] Voltage Tolerance [kv] Pre Run Voltage [kv] Pre Run Time [s] Injection Voltage [kv] 3.0 Injection Time [s]* 10 Run Voltage [kv] Number of Steps Voltage Step Interval Data Delay Time [s] Run Time [min]** 26 Nastavení Default Default Default Default Default Default Default Default Default Default Default Default * Na rozdíl od standardního nastavení může doba vstřiku v závislosti na vzorku činit 1-20 s. U referenčních vzorků s velmi vysokou výškou píku může být zvolena kratší doba vstřiku, aby se zabránilo průsvitům. V případě menšího množství cdna nebo u kritického materiálu pacienta může být nutností až 20 s. ** V závislosti na podmínkách analýzy by měla být doba běhu pro upravena tak, aby bylo možné analyzovat fragmenty o délce až 550 bp. Klepněte na Save As, zadejte název nového modulu (např. 3kV_10s_550bp) a potvrďte pomocí OK Chcete-li opustit editor modulu běhu, klepněte na Close Spuštění běhu Připravenou 96jamkovou destičku vložte do autosampleru Otevření softwaru ABI PRISM 3100 Data Collection V Plate View softwaru 3100 Data Collection klepněte na New. Otevře se dialog Plate Editor Vyberte GeneScan

28 Jako typ destičky vyberte 96-Well a klepněte na Dokončit editor destiček Tabulka 21 Parametry editoru destiček pro analýzu dat Parametr Sample Name Dyes Color Info Project Name Dye Set Run Module* Analysis Module 1 Nastavení Pojmenování vzorků O Ladder nebo sample např. 3100_Project1 G5 3kV_10s_550bp DefaultAnalysis.gsp * parametry viz výše Zvolte doplnění tabulky v Plate Editor a OK Abyste vybrali celý sloupec, klepněte na buňku tabulky zcela nahoře, a zvolte Edit Fill Down pro přiřazení informací ke zvolenému vzorku Spojte 96jamkovou destičku s právě vytvořeným označením s autosamplerem a spusťte běh Po běhu lze data najít jako Color Data v Array View softwaru 3100 Data Collection nebo jako Analyzed Sample Files pomocí cesty D:/AppliedBio/3100/DataExtractor/ExtractRuns 9.3 Elektroforéza na genetickém analyzátoru ABI PRISM 3130/3130xl Obecné pokyny k analytickému zařízení, spektrální kalibraci a použití softwaru ABI PRISM Data Collection, verze 3.0 a softwaru GeneMapper TM ID/ID-X najdete v příslušném návodu ABI PRISM 3130/3130xl Genetic Analyzers Getting Started Guide. Systém se 4 kapilárami nese označení ABI 3130, systém se 16 kapilárami se jmenuje ABI 3130xl. Pro kombinované použití pěti fluorescenčních barviv 6-FAM, BTG, BTY, BTR a BT0 je určeno použití virtuální sady filtrů Any5Dye (standardní matrice je dále označena jako BT5).

29 Tabulka 22 Potřebné materiály pro provoz genetického analyzéru ABI 3130 Materiál Vlastnosti Kapilára* 36 cm Capillary Array for 3130/3130xl Polymer* POP-4 Polymer for 3130 Pufr 10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA *jsou možná jiná nastavení zařízení 9.3.1 Spektrální kalibrace / vytvoření matrice Před provedením fragmentační analýzy musí být nejprve provedena spektrální kalibrace pomocí fragmentů PCR příslušných pěti fluorescenčních barviv 6-FAM, BTG, BTY, BTR a BTO pro příslušné analytické zařízení. Tímto způsobem bude vytvořena matrice, která koriguje překrytí barevně specifických spekter fluorescenčních emisí. Spektrální kalibrace zahrnuje tyto kroky: Příprava matricového standardu pro spektrální kalibraci Nanesení standardu na 96jamkovou destičku (každá kapilára jeden vzorek) Vytvoření protokolu přístroje pro spektrální kalibraci (Protocol Manager) Stanovte složení destičky v editoru destiček (Plate Manager) Provedení běhu pro spektrální kalibraci a kontrola matrice Příprava matricového standardu pro spektrální kalibraci Tabulka 23 Sestava matricového standardu BT5 multi pro genetický analyzátor ABI 3130 Objem pro 4 kapiláry Objem pro 16 kapilár Složky (ABI 3130) (ABI 3130xl) Hi-Di Formamide 60,0 µl 204,0 µl Matricový standard BT5 5,0 µl 17,0 µl Pozice A1-D1 A1-H1 a A2-H2 Naneste 12 µl směsi na 96jamkovou destičku (specifická pozice viztabulka 23) Denaturujte vzorky při 95 C po dobu 3 min. v cycleru PCR, zchlaďte vzorky v zařízení na 4 C Vložte vzorky k analýze do nádoby podle návodu k použití od výrobce zařízení

30 Provádění spektrální kalibrace Připravenou 96jamkovou destičku vložte do autosampleru V Protocol Manager softwaru Data Collection klepněte v okně Instrument Protocol na New a otevřete Protocol Editor Protokol přístroje pro spektrální kalibraci Tabulka 24 Nastavení pro spektrální kalibraci na genetickém analyzátoru ABI 3130 Protocol Editor Název Typ Dye Set Polymer* Array Length* Chemistry Run Module* Nastavení User (např. Spectral36_POP4_BT5) SPECTRAL Any5Dye User (např. POP4) User (např. 36 cm) Matricový standard Default (např. Spect36_POP4_1) * Řídí se podle typu použitého polymeru a délky kapilár Zvolte OK a opusťte Protocol Editor V Plate Manager softwaru Data Collection klepněte na New a otevřete dialog New Plate

31 Editor destiček pro spektrální kalibraci (I) Tabulka 25 Nastavení v editoru destiček pro spektrální kalibraci Dialog New Plate Název Application Plate Type Owner Name / Operator Name Nastavení např. Spectral_BT5_date Spectral Calibration 96-Well Zvolte OK. Tímto způsobem se automaticky otevře nová tabulka v editoru destiček Editor destiček pro spektrální kalibraci (II) Tabulka 26 Pojmenování vzorků pro spektrální kalibraci Parametr Nastavení Sample Name Pojmenování vzorků matrice Priority např. 100 Instrument Protocol 1 Spectral36_POP4_BT5 (nastavení popsáno dříve) Celý sloupec vyberte klepnutím na buňku tabulky zcela nahoře, pomocí Edit Fill Down přidejte tuto informaci k vybraným vzorkům matrice a potvrďte pomocí OK V Run Schedule klepněte na Find All, pak zvolte Link, abyste spojili 96jamkovou destičku s právě vytvořeným označením s autosamplerem (pozice A nebo B). Poté spusťte běh

32 Obrázek 4 Elektroferogram spektrální kalibrace na genetickém analyzátoru ABI 3130 s matricovým standardem BT5 multi Kontrola matrice Každá kapilára by měla mít hodnotu kvality (Q Value) minimálně 0,95 a číslo podmínky (Condition number range) mezi 1 a 20 (Obrázek 4). Ohodnoťte, zda je k dispozici stabilní základní linie. V každé kapiláře musí být možné identifikovat pět píků s výškou 1 000-5 000 RFU (osa Y) (optimální rozsah: 2 000-4 000 RFU), viz obrázek. Zkontrolujte prosím novou matrici pomocí svých aktuálních vzorků. S novou matricí by nemělo docházet k průsvitům (Pull-up Peaks) mezi různými barevnými panely (B, G, Y, R, O). Pokud všechny kapiláry prošly úspěšnou kalibrací, bude automaticky aktivován kalibrační soubor pro Any5Dyes v Spectral Viewer. Přejmenování je možné pomocí Rename (např. BT5_Datum kalibrace). Pokud kalibrace nebyla úspěšná, opakujte vstřik s vyšší dobou vstřiku nebo vyšším napětím vstřiku. Za tím účelem musejí být na modulu běhu pro spektrální kalibraci provedeny změny. Stejné vzorky je možné až třikrát nastříknout znovu. Případně použijte více matricového standardu pro opětovnou spektrální kalibraci.

33 9.3.2 Příprava vzorků Tabulka 27 Sestava denaturační směsi pro přípravu kapilární gelové elektroforézy Součást Objem na reakci Hi-Di Formamide 12,0 µl DNA Size Standard 550 (BTO) 0,5 µl Předložte 12 µl směsi z Tabulka 27 pro všechny vzorky Do každé jamky přidejte ke směsi 1 µl produktu PCR (popř. zřeďte) nebo alelický ladder Pokud denaturujete vzorky při 95 C po dobu 3 min. v cycleru PCR, zchlaďte vzorky v zařízení na 4 C Vložte vzorky k analýze do nádoby podle návodu k použití od výrobce zařízení Protože se injekce uskuteční na všech kapilárách současně, je třeba vždy 4 nebo 16 vzorků napipetovaných do destičky. Je-li měřeno méně vzorků, musejí být pozice bez vzorků naplněny 12 µl Hi-Di formamidu. Pro zajištění spolehlivých výsledků na multikapilárním zařízení by mělo být nezávisle na počtu vzorků spuštěno několik alelických ladderů. Teplota místnosti může vlastnosti běhu produktů PCR produktů na multikapilárních zařízeních silně ovlivnit a příliš nízká teplota způsobí výskyt dvojitých píků (Split Peaks). Podle okolností ovlivní teplota i rychlost běhu fragmentů. Dbejte prosím na to, aby byla dodržena pracovní teplota doporučená výrobcem zařízení. Optimální jsou stabilní pokojové teploty >22 C. Možnosti zvýšení intenzity signálu: Snížení podílů standardu délky DNA 550 (BTO) tak, aby byla výška píků cca 500 relativních fluorescenčních jednotek (RFU) Přečištění produktů PCR před analýzou 9.3.3 Nastavení softwaru Data Collection Před prvním zkušebním během musí být modul běhu editován následujícím způsobem: V Module Manager softwaru Data Collection klepněte na New a otevřete Run Module Editor.

34 Run Module 3kV_10s_550bp Tabulka28 Nastavení modulu běhu na genetickém analyzátoru ABI 3130 Parametr Oven Temperature [ C] Poly Fill Volume Current Stability [µa] PreRun Voltage [kv] PreRun Time [s] Injection Voltage [kv] 3.0 Injection Time [s]* 10 Voltage Number of Steps Voltage Step Interval Data Delay Time [s] Run Voltage [kv] Nastavení Default Default Default Default Default Default Default Default Default Run Time [s]** 1560 * Na rozdíl od standardního nastavení může doba vstřiku v závislosti na vzorku činit 1 až 20 s. U referenčních vzorků s velmi vysokou výškou píku může být zvolena kratší doba vstřiku, aby se zabránilo průsvitům. V případě menšího množství cdna nebo u kritického materiálu pacienta může být nutností až 20 s. ** V závislosti na podmínkách analýzy by měla být doba běhu pro upravena tak, aby bylo možné analyzovat fragmenty o délce až 550 bp. Klepněte na Save As, zadejte název nového modulu (např. 3kV_10s_550bp) a potvrďte pomocí OK Chcete-li opustit editor modulu běhu, klepněte naclose Spuštění běhu Připravenou 96jamkovou destičku vložte do autosampleru V Protocol Manager softwaru Data Collection klepněte v okně Instrument Protocol na New a otevřete Protocol Editor

35 Protokol přístroje Tabulka29 Parametry protokolu přístroje na genetickém analyzátoru ABI 3130 pro analýzu vzorků Protocol Editor Název Typ Run Module* Dye Set Nastavení např. Run36_POP4_BT5_26min REGULAR 3kV_10s_550bp Any5Dye * parametry viz výše Pro opuštění editoru protokolů zvolteok Před každým zkušebním během je nutné následujícím způsobem vytvořit měřenou destičku: V Plate Manager softwaru Data Collection klepněte na New a otevřete dialog New Plate Editor destiček (I) Tabulka30 Nastavení na editoru destiček Dialog New Plate Název Application Plate Type Owner Name / Operator Name Nastavení např. Plate_BT5_Date zvolte aplikaci GeneMapper 96-Well Zvolte OK. Tímto způsobem se automaticky otevře nová tabulka v editoru destiček

36 Editor destiček (II) Tabulka 31 Pojmenování vzorků v editoru destiček Parametr Sample Name Priority Sample Type Size Standard Panel Analysis Method Snp Set - User-defined 1-3 - Results Group 1 Instrument Protocol 1 Nastavení Pojmenování vzorku např. 100 (default) Sample or allelic ladder např. SST-BTO_60-550bp např. AMLplex_Panels_v2 např. AMLplex_HID_3130_200rfu (vybrat Results Group) Run36_POP4_BT5_26min (nastavení popsáno výše) Celý sloupec vyberte klepnutím na buňku tabulky zcela nahoře, pomocí Edit Fill Down přidejte tuto informaci k vybraným vzorkům a potvrďte pomocí OK. V Run Schedule klepněte na Find All, pak na Link, abyste spojili 96jamkovou destičku s právě vytvořeným označením s autosamplerem (pozice A nebo B). Poté spusťte běh. Kvalita nezpracovaných dat může být při běhu sledována pro každou jednotlivou kapiláru v Capillaries Viewer nebo Cap/Array Viewer. Případná hlášení chyb (Error Status) se objeví v Event Log. Přehled dat zkušebního běhu se zobrazí v Run History nebo Cap/Array Viewer softwaru Data Collection. Data běhu vzorků jsou ukládána v Run Folder předem zvolené Results Group. 9.4 Elektroforéza pomocí genetického analyzátoru ABI PRISM 3500/3500xL Obecné pokyny k analytickému zařízení, spektrální kalibraci a použití softwaru Applied Biosystems 3500 Series Data Collection, verze 3.0, a softwaru GeneMapper ID-X, verze 1.4, jsou uvedeny v příslušné uživatelské příručce genetického analyzátoru Applied Biosystems 3500/3500xL. Systém s 8 kapilárami nese označení AB 3500, systém se 24 kapilárami se jmenuje ABI 3500xL.

37 Pro kombinované použití pěti fluorescenčních barviv 6-FAM, BTG, BTY, BTR a BT0 je určeno použití virtuálního Filter Sets AnyDye (matricový standard je dále označován jako BT5). Tabulka32 Potřebné spotřební materiály na genetickém analyzátoru ABI 3500 Materiál Kapilára* Polymer* Pufr Vlastnost 36 cm Capillary Array for 3500/3500xL POP-4 Polymer for 3500/3500xL 10x Genetic Analyzer Buffer with EDTA for 3500/3500xL *jsou možná jiná nastavení zařízení 9.4.1 Spektrální kalibrace / vytvoření matrice Před provedením fragmentační analýzy musí být nejprve provedena spektrální kalibrace pomocí fragmentů PCR příslušných pěti fluorescenčních barviv 6-FAM, BTG, BTY, BTR a BTO pro příslušné analytické zařízení. Tímto způsobem bude vytvořena matrice, která koriguje překrytí barevně specifických spekter fluorescenčních emisí. Spektrální kalibrace zahrnuje tyto kroky: Příprava matricového standardu pro spektrální kalibraci Nanesení standardu na 96jamkovou destičku (každá kapilára jeden vzorek) Příprava nástroje pro vytvoření Dye Set BT5 Provedení běhu pro spektrální kalibraci a kontrola matrice

38 Příprava matricového standardu pro spektrální kalibraci Tabulka33 Sestava matricového standardu BT5 multi pro spektrální kalibraci na genetickém analyzátoru ABI 3500 Objem pro 4 kapiláry Objem pro 24 kapiláry Součást ABI 3500 ABI 3500xl Hi-Di Formamide 108,0 µl 300,0 µl Matricový standard BT5 9,0 µl 25,0 µl Pozice A1-H1 A1-H1 A1-H1, A2-H2, A3-H3* * Při použití 384jamkové destičky by mělo být 10 µl směsi dáno na pozice 1, 3 a 5 řad A, C, E, G, I, K, M, a O. Naneste 12 µl směsi na 96jamkovou destičku (specifická pozice viztabulka33) Denaturujte vzorky při 95 C po dobu 3 min. v cycleru PCR, zchlaďte vzorky v zařízení na 4 C Vložte vzorky k analýze do nádoby podle návodu k použití od výrobce zařízení Příprava nástroje Prosím zajistěte, aby se před spektrální kalibrací uskutečnila prostorová kalibrace. Tento krok je nutný jen po namontování nového kapilárního pole. Proces je podrobně uveden v uživatelské příručce Applied Biosystems 3500/3500xL Genetic Analyzers. Příprava Dye Set BT5 Před spektrální kalibrací musí být dye set nastaven pro matricový standard BT5. 1. V Library zvolte Analyze a Dye Sets a poté klepněte na Create. 2. V Dye Set Name dye set pojmenujte, např. BT5. 3. Zvolte matricový standard jako Chemistry a AnyDye Template jako templát dye set. 4. Deaktivujte Purple v poli Arrange Dyes. Přesvědčte se, že jsou aktivovány všechny ostatní barvy. 5. V Calibration Peak Order musejí být přiřazeny všechny barvy, jak je uvedeno níže: 5 modrá (blue), 4 zelená (green), 3 žlutá (yellow), 2 červená (red), a 1 oranžová (orange). 6. V poli Parametry nemusejí být provedeny žádné změny. 7. Pro potvrzení změn klepněte na Save.

39 Obrázek 5 Nastavení pro spektrální kalibraci dye setu BT5 Provádění spektrální kalibrace Umístěte multimikrotitrační destičku, obsahující směs pro spektrální kalibraci, v autosampleru a spusťte spektrální kalibraci. 1. Zvolte Maintenance na panelu softwaru 3500 Series Data Collection a otevřete obrazovku Spectral Calibration. 2. Je nutné definovat počet jamek multimikrotitrační destičky a její polohu v přístroji. 3. Zvolte matricový standard jako Chemistry Standard a BT5 pro dye set (vytvořeno dříve). 4. Aktivujte Allow Borrowing (volitelně). 5. Klepněte na Start Run.

40 Obrázek 6 Elektroferogram spektrální kalibrace pomocí matricového standardu BT5 multi na genetickém analyzátoru ABI 3500 Kontrola matrice Každá kapilára by měla mít hodnotu kvality (Q Value) větší než 0,8 a číslo podmínky (Condition number range) mezi 1 a 20. Ohodnoťte, zda je k dispozici stabilní základní linie. V každé kapiláře musí být možné identifikovat pět píků s výškou 1 000-5 000 RFU (osa Y) (optimální rozsah: 2 000-4 000 RFU), viz Obrázek 6. Úspěšná kalibrace se pro každou kapiláru zobrazí v Overall v zelené barvě. Po úspěšné kalibraci všech kapilár klepněte na Accept Results V případě neúspěšné kalibrace klepněte na Reject Results. V takovém případě odkazujeme na kapitolu spectral calibration troubleshooting uživatelské příručky genetického analyzátoru Applied Biosystems 3500/3500xL. 9.4.2 Příprava vzorků Tabulka 34 Denaturační sestava na každou reakci v přípravě na kapilární gelovou elektroforézu Součást Objem na reakci Hi-Di Formamide 12,0 µl DNA Size Standard 550 (BTO) 0,5 µl Předložte 12 µl směsi z Tabulka 34 pro všechny vzorky Do každé jamky přidejte ke směsi 1 µl produktu PCR (popř. zřeďte) nebo alelický ladder Denaturujte vzorky při 95 C po dobu 3 min. v cycleru PCR, zchlaďte vzorky v zařízení na 4 C Vložte vzorky k analýze do nádoby podle návodu k použití od výrobce zařízení

41 Protože se injekce uskuteční na všech kapilárách současně, je třeba vždy 8 nebo 24 vzorků napipetovaných do destičky. Je-li měřeno méně vzorků, musejí být příslušné pozice naplněny 12 µl Hi-Di formamidu. Pro zajištění spolehlivých výsledků na multikapilárním zařízení by mělo být nezávisle na počtu vzorků spuštěno několik alelických ladderů. Teplota místnosti může vlastnosti běhu produktů PCR produktů na multikapilárních zařízeních silně ovlivnit a příliš nízká teplota způsobí výskyt dvojitých píků (Split Peaks). Podle okolností ovlivní teplota i rychlost běhu fragmentů. Dbejte prosím na to, aby byla dodržena pracovní teplota doporučená výrobcem zařízení. Optimální jsou stabilní pokojové teploty >22 C. Možnosti zvýšení intenzity signálu: Snížení podílů standardu délky DNA 550 (BTO) tak, aby byla výška píků cca 500 relativních fluorescenčních jednotek (RFU) Přečištění produktů PCR před analýzou 9.4.3 Nastavení pro spuštění Pro první běh s aplikací musejí být vytvořeny specifické protokoly v rámci softwaru 3500 Series Data Collection. Vytvoření protokolu přístroje V Library zvolte Analyze / Instrument protocol a klepněte nacreate Změňte parametry, jak je uvedeno v tabulce níže:

42 Protokol přístroje pro Tabulka 35 Nastavení protokolu přístroje na genetickém analyzátoru ABI 3500 Parametr Nastavení Application Type HID or Fragment Capillary Length Default Polymer Default Dye Set BT5 Run Module Default Protocol Name např. Mentype AMLplex QS Oven Temperature [ C] Default Run Voltage [kv] Default Injection Voltage [kv] 3.0 Run Time [s]** 1560** PreRun Time [s] Default Injection Time [s]* 8* Data Delay Time [s] Default Advanced Options Default * Na rozdíl od standardního nastavení může doba vstřiku v závislosti na vzorku činit 1-20 s. U referenčních vzorků s velmi vysokou výškou píku může být zvolena kratší doba vstřiku, aby se zabránilo průsvitům. V případě menšího množství cdna nebo u kritického materiálu pacienta může být nutností až 20 s. ** V závislosti na podmínkách analýzy by měla být doba běhu pro upravena tak, aby bylo možné analyzovat fragmenty o délce až 550 bp. Pro potvrzení nastavení klepněte na Save. Nastavení pro standard délky V Library zvolte Analyze / Size Standards a klepněte na Create Změňte parametry, jak je uvedeno v Tabulka36 níže: Tabulka36 Nastavení standardu velikosti na genetickém analyzátoru ABI 3500 Parametr Size Standard Dye Color Nastavení BTO_550 oranžová

43 DNA Size Standard 550 (BTO) musí být používán s těmito délkami fragmentů: 60, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 425, 450, 475, 500, 525, a 550 bp. Pro potvrzení nastavení klepněte na Save. Nastavení QC nebo protokolu Size Calling V Library zvolte Analyze / QC nebo Size Calling Protocol a klepněte na Create Změňte parametry, jak je uvedeno v tabulce níže: Tabulka37 Nastavení QC, resp. protokolu Size Calling na genetickém analyzátoru ABI 3500 Parametr Protocol Name Size Standard Sizecaller Nastavení Název BTO_550 (předem nastavený) Size Caller v.1.1.0 V Analysis Settings / Peak Amplitude Treshold zvolte disable Purple. Všechny ostatní barvy musejí být aktivovány. Všechna ostatní nastavení zůstanou na Default. Pro potvrzení nastavení klepněte na Save. Vytvoření vzorku V Library zvolte Manage / Assays a klepněte na Create Změňte parametry, jak je uvedeno v tabulce níže: Tabulka 38 Parametry vzorku na genetickém analyzátoru ABI 3500 Parametr Assay Name Color Application Type Instrument Protocol QC (Size Calling) Protocol Nastavení např. Mentype AMLplex QS Default HID nebo fragment např. Mentype AMLplex QS např. BTO_550

44 Pro potvrzení nastavení klepněte na Save. Spuštění běhu Připravenou multimikrotitrační destičku vložte do autosampleru Na panelu softwaru Data Collection klepněte na Create New Plate V Define Plate Properties zvolte Plate Details Změňte parametry, jak je uvedeno v Tabulka 39 níže: Podrobnosti o destičkách Tabulka 39 Podrobnosti o destičkách na genetickém analyzátoru ABI 3500 Parametr Název Nastavení Number of Wells 96 or 384 Plate Type* Capillary Lenght Polymer např. Mentype AMLplex QS HID nebo fragment 36 cm POP4 Pro potvrzení nastavení klepněte na Assign Plate Contents Definujte pozici každé jamky, obsazené vzorkem od pacienta nebo alelickým ladderem, pro sběr dat a vyhodnocení Každé pojmenované jamce přiřaďte jeden vzorek (potřebné), konvenci pro pojmenování souboru a výslednou skupinu Klepněte na Link the plate for Run a zadejte název běhu. Klepněte na Start Run

45 10. Vyhodnocení dat 10.1 Software a předlohy pro vyhodnocení Vyhodnocování dat se provádí pomocí softwaru GeneMapper TM ID nebo GeneMapper TM ID-X (Applied Biosystems TM ). Pro jednoduché vyhodnocení dat nabízí firma Biotype GmbH na www.biotype.de hotová nastavení (Tabulka 40), která mohou být importována do příslušné verze GeneMapper TM a nahrazují manuální vytvoření analytických parametrů. Upozornění: Import a přiřazení alel pomocí nabízených předloh vyhodnocení může být garantováno jen pro software GeneMapper TM ID/ID-X. Pokud byste použili GeneMapper TM, může dojít k problémům při importu některých předloh vyhodnocení. Upozornění: Dostupné předlohy pro biny a sadu panelů definují délku jednotlivých fragmentů. Následkem mírných rozdílů ve výkonů jednotlivých přístrojů pro kapilární gelovou elektroforézu může dojít k lehkým odchylkám mezi přístroji. Společnost Biotype GmbH může biny a panely specificky upravit. Za tím účelem nás prosím kontaktujte na support@biotype.de. Tabulka 40 Přehled dostupných předloh pro import do GeneMapper TM ID/ID-X Předloha Název Panely AMLplex_Panels_v2/v2x Nebo vyšší verze BinSets AMLplex_Bins_v2/v2x Nebo vyšší verze Size Standard SST-BTO_60-550bp Analysis Method AMLplex_HID_310_200RFU AMLplex_HID_3130_200RFU Doporučeno Doporučeno Plot Settings PlotsBT5_4dyes Table Setting Table for 10 Alleles Table for 22 Alleles Pokud by byla analytická metoda vytvořena manuálně, je třeba zvolit tyto parametry (Tabulka 41):

46 Tabulka 41 Parametry pro manuální vytvoření analytické metody v GeneMapper TM ID/ID-X Parametr Peak Detection Algorythm Allele Ranges Smoothing and Baselining Size Calling Method Peak Detection Peak Quality Nastavení Advanced No specific stutter ratio, set all to 0.0 Amelogenin cut off: 0.0 Analysis: Full Range Sizing: All Sizes Smoothing: Světlo Baseline Window: 51 pts Local Southern Method Peak Amplitude Thresholds B: 200; Y: 200; G: 200; R: 200; O: 50 Min. Peak Half Width: 2 pts Polynominal Degree: 3 Peak Window Size: 15 pts* Slope Thresholds: 0.0 Heterozygote Balance: 0.0 Max expected alleles: 22 * Pokud je to třeba, je možné zmenšit velikost okna píku na 11 pts. 10.2 Postup při vyhodnocování dat 10.2.1 Všeobecné minimální požadavky při vyhodnocování dat Soubory fsa kapilární gelové elektroforézy jsou kvalitativně vyhodnocovány. To znamená, že je u nich kontrolována přítomnost amplifikátových píků. Platí, že pík musí dosáhnout minimální výše 200 RFU a přitom by měl být alespoň třikrát tak velký jako hluk pozadí základní linie. Tato kritéria platí pro kontrolní píky (kontrola QS a ABL) i pro píky genových fúzí. Jedinou výjimku tvoří standard velikosti Size Standard 550 (BTO), zde je třeba dosáhnout minimální výšky píku 50 RFU.

47 10.2.2 Kontrola standardu délky Size Standard 550 (BTO) Stanovení přesných délek fragmentů amplifikovaných produktů je závislé na použitém standardu délky DNA. Z důvodu komplexnosti některých míst by k určení délky mělo být použito co nejvíce rovnoměrně rozložených referenčních bodů. Použijte standard délky DNA Size Standard 550 (BTO, Obrázek 7) s délkami fragmentů 60, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 250, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 425, 450, 475, 500, 525 a 550 bp. V elektroferogramu (oranžový kanál) všech vzorků zkontrolujte, že jsou k dispozici všechny alely standardu velikosti, mají dostatečnou výšku píku alespoň 50 RFU a byly správně přiřazeny (srv. Obrázek 7). Obrázek 7 Elektroferogram standardu velikosti Size Standard 550 (BTO), analyzovaný na ABI 3500, software GeneMapper TM ID-X 1.4, Template Files v3x, osa y: 55-560 bp, osa x: 0-1500 RFU Upozornění: Pokud by v různých vzorcích nebyly analyzovány všechny fragmenty standardu velikosti, mohou být alelický ladder a vzorky nedostatečně vyhodnoceny. Proto vždy zkontrolujte úspěšnou analýzu standardu velikosti. 10.2.3 Kontrola alelického ladderu/allelic Ladder Alelický ladder obsahuje všechny fragmenty, které lze prokázat pomocí (srv. Tabulka 1 a Obrázek 8). Tyto fragmenty musejí být v alelickém ladderu analogicky přítomné a mít prokazatelnou výšku alespoň 200 RFU. Fúzní geny a příslušné varianty transkriptů se vždy nacházejí v barevném kanálu (Tabulka42).

48 Tabulka42 Přehled rozložení genových fúzí na barevné kanály Modrý barevný kanál Zelený barevný kanál Žlutý barevný kanál CBFB-MYH11 DEK-NUP214 (DEK-CAN) PML-RARA BCR-ABL PICALM-MLLT10 (CALM-AF10) RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO) NPM1-MLF1 Kontrola QS a ABL KMT2A-MLLT4 (MLL-AF6) KMT2A-MLLT3 (MLL-AF9) KMT2A-ELL (MLL-ELL) KMT2A-PTD (MLL-PTD) Upozornění:Pokud by všechny fragmenty alelického ladderu nebyly při použití vyhodnocovacích vzorů (především binů a sad panelů) automaticky pojmenovány, obraťte se prosím na support@biotype.de, protože může být nutné přizpůsobit templáty vašemu nastavení. V takovém případě může chybět přiřazení píků ve vzorcích.

49 Obrázek 8 Elektroferogram alelického ladderu, analyzovaný na ABI 3500, vyhodnocení pomocí GeneMapper TM ID-X 1.4, Template Files v3x, osa y: 55-550 bp, osa x: 0-5500 RFU

50 10.2.4 Test Control cdna KAS-1 Sada obsahuje pozitivní kontrolu Control cdna KAS-1*, která je pozitivní pro genovou fúzi RUNX1-RUNX1T1 (AML1-ETO). Zkontrolujte, zda se vyskytují kontrolní píky QS-Control a ABL-Control s dostatečnou výškou. Zkontrolujte, zda se v elektroferogramu vyskytuje pík pro translokaci RUNX1-RUNX1T1 s dostatečnou výškou (Obrázek 9). Zkontrolujte, zda se v elektroferogramu nevyskytují žádné neočekávané vedlejší produkty. *Buněčná kultura pro vytvoření cdna byla odebrána od: DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Německo. Použití této cdna je určeno výhradně pro. Obrázek 9 Elektroferogram Control cdna KAS-1, analyzovaný na ABI 3500, GeneMapper TM ID-X 1.4, Template Files v3x, osa y 55-550 bp, osa x 0-8.000 RFU 10.2.5 Test negativní kontroly Zkontrolujte, zda se v elektroferogramu (kanál modrý, zelený, žlutý) nevyskytují píky specifické pro translokaci, které jsou větší než 200 RFU. No-Template Control:Zkontrolujte, zda se vyskytuje jen kontrolní pík QS-Control s dostatečnou výškou, nikoli však pík ABL-Control Peak (Obrázek 10). Obrázek 10 Elektroferogram Non Template Control, analyzovaný na ABI 3500, GeneMapper ID-X 1.4, Template Files v3x, osa y 0-10.000 RFU, osa x 55-550 bp

51 Negativní kontrolní vzorek:zkontrolujte, zda se v případě známé cdna, která je pro prokazatelné genové fúze a translokace negativní, vyskytují kontrolní píky QS-Control a ABL- Control s dostatečnou výškou (Obrázek 11). Obrázek 11 Elektroferogram negativního kontrolního vzorku, analyzovaný na ABI 3500, GeneMapperTM ID-X 1.4, Template Files v3x, osa y 0-10.000 RFU, osa x 55-550 bp 10.2.6 Vyhodnocení dat vzorků Po provedení kontroly standardů velikosti, alelického ladderu a kontrolních vzorků proběhne vyhodnocení dat vzorků. Upozornění: je čistě kvalitativní test. Kvantitativní vyhodnocení, např. v rámci MRD, výslovně není možné. Při použití vyhodnocovacích předloh od společnosti Biotype GmbH a úspěšném vyhodnocení alelického ladderu běhu budou detekované fragmenty PCR automaticky pojmenovány. Přehled délek fragmentů produktů PCR najdete v Tabulka 43. Upozornění:Byla provedena validace a certifikace na POP-4. Použití jiného polymeru (např. POP-7 nebo POP-6 ) může změnit vlastnosti běhu specifických produktů PCR. Podle okolností je nutná úprava templátů Biotype panelů a sady binů). Prosím obraťte se na naši technickou podporu (support@biotype.de). Dále byl pozorován zvýšený šum pozadí z důvodu změněných vlastností volných zbytků fluorescenčních barviv.

52 Tabulka43 Přehled délek fragmentů jednotlivých translokací v alelickém ladderu, stanovený za použití POP-4TM; pro variantu KMT2A-MLLT3_6A jsou očekávány dva amplikony; * Z důvodu proměnlivé délky amplikonu PML-RARA_bcr2 (cca 173 bp) nemůže být varianta automaticky přiřazena, lze ji však detekovat pomocí primerů Panel/translokace Velikost [bp] Panel/translokace Velikost [bp] Modrý kanál Zelený kanál CBFB-MYH11_TypeG 63 DEK-NUP214 78 CBFB-MYH11_TypeI 66 KMT2A-PTD_e9e3 87 QS-Control 72 KMT2A-MLLT3_6A_S 113 BCR-ABL_b2a3 107 KMT2A-MLLT3_6B 191 CBFB-MYH11_TypeJ 141 KMT2A-PTD_e10e3 218 CBFB-MYH11_TypeC 146 KMT2A-ELL_e10e3 242 CBFB-MYH11_TypeD 160 KMT2A-MLLT3_7A 245 CBFB_MYH11_TypeH 165 KMT2A-ELL_e10e2 289 CBFB_MYH11_TypeF 175 KMT2A-MLLT4 303 BCR-ABL_b3a3 183 KMT2A-PTD_e11e3 333 BCR-ABL_e1a3 206 KMT2A-MLLT3_8A 360 MLLT10_240-PICALM_2092 265 KMT2A-MLLT3_6A_L 498 CBFB-MYH11_TypeA 271 Žlutý kanál BCR-ABL_b2a2 282 PML-RARA_bcr1 220 RUNX1-RUNX1T1 301 PML-RARA_bcr3 288 BCR-ABL_b3a2 358 PML_RARA_bcr2* CBFB-MYH11_TypeE 365 MLLT10_240-PICALM_1987 371 BCR-ABL_e1a2 380 NPM1-MLF1 389 CBFB-MYH11_TypeB 486 ABL-Control 518

53 11. Řešení problémů Výše popsané vyhodnocení Post-PCR s automatickým přiřazením alel zaručuje přesné a spolehlivé rozlišení transkriptů genových fúzí a jejich variant. V každém běhu prosím zkontrolujte správné přiřazení alel v alelickém ladderu. 11.1 Detekční limit V experimentech s plazmidy byl v případě počtu 25 cyklů stanoven detekční limit 1 000 kopií pro 32 ze 34 variant transkriptů. Od nich se odlišují varianty transkriptů CBFB- MYH11_Type C a MLL-AF6. V případě počtu 28 cyklů může být určeno 1 000 kopií CBFB- MYH11_Type C a 10 000 kopií KMT2A-MLLT4 (MLL-AF6). Pokud jsou uvedené počty kopií k dispozici, může být dosaženo výšek píků >200 RFU. U této aplikace se jedná o screeningový nástroj, založený na PCR, který byl vyvinut, validován a certifikován pro klasifikaci subtypů AML. Tato aplikace není vhodná pro kvantifikaci nebo monitoring minimální reziduální choroby (MRD). 11.2 Průsvity (Pull-up Peaks) Pokud byla použita nevhodná matrice pro analýzu nebo jsou výšky píků produktu PCR mimo oblast lineární detekce zařízení, může dojít k průsvitům mezi barevnými panely. Objeví se ve stejné poloze jako specifické píky v jiných barevných panelech (zpravidla s nižší intenzitou signálu). Upozornění: Pokud je to nutné, nařeďte před kapilární gelovou elektroforézou produkty PCR, abyste získali výsledky, které lze jednoznačně vyhodnotit. V případě průsvitu navzdory optimálním výškám fluorescence by měla být matrice obnovena. 11.3 Přidání nukleotidů, které je nezávislé na vzoru Na základě své terminální transferázové aktivity přidává multi Taq DNA polymeráza přednostně na 3 -konec amplifikovaného fragmentu DNA adenosin. Pokud nemá systém PCR na extenzi dostatek času, nebo primární sekvence extenzi nepodporují, toto přidání se neuskuteční. Tento artefakt je identifikovatelný na základě výskytu fragmentu zkráceného o bázi (-1 bp pík). Všechny primery Biotype jsou upraveny tak, aby byla tvorba tohoto artefaktu minimalizována. Navíc je tvorba artefaktu omezena závěrečným extenzním krokem v protokolu PCR (68 C po dobu 10 min.). Výška píku artefaktu se v případě vysokého množství cdna zvyšuje. Pro hodnocení píků by měla každá analytická laboratoř stanovit vlastní limitní hodnoty. 11.4 Artefakty Teplota místnosti může vlastnosti běhu produktů PCR produktů na kapilárních zařízeních silně ovlivnit a příliš nízká teplota způsobí výskyt dvojitých píků (Split Peaks). Navíc může být negativně ovlivněno automatické přiřazení alel. Pokud by byly tyto efekty pozorovány, doporučujeme opětovné nastříknutí vzorků, případně i s více alelickými laddery na jeden

54 běh. Dbejte prosím na to, aby byla dodržena pracovní teplota doporučená výrobcem zařízení. Optimální jsou stabilní pokojové teploty >22 C. 11.5 Vliv typu polymeru Byla provedena validace a certifikace na POP-4. Použití jiného polymeru (např. POP-7 nebo POP-6 ) může změnit vlastnosti běhu specifických produktů PCR. Podle okolností je nutná úprava templátů Biotype panelů a sady binů). Prosím obraťte se na naši technickou podporu (support@biotype.de). Dále byl pozorován zvýšený šum pozadí z důvodu změněných vlastností volných zbytků fluorescenčních barviv.

55 12. Objednací informace Tabulka 44 Podrobné objednací informace o sadách Sada Velikost balení Objednací číslo 10 reakcí 45-31220-0010 25 reakcí 45-31220-0025 100 reakcí 45-31220-0100 400 reakcí 45-31220-0400

56 13. Reference Asou H, Tashiro S, Hamamoto K, Otsuji A, Kita K, Kamada N (1991) Establishment of a human acute myeloid leukemia cell line (Kasumi-1) with 8;21 chromosome translocation. Blood 77(9): 2031-2036. Beillard E, Pallisgaard N, van der Velden VHJ, Bi W, Dee R, van der Schoot E, Delabesse E, Macintyre E, Gottardi E, Saglio G, Watzinger F, Lion T, van Dongen JJM, Hokland P, Gabert J (2003) Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using real-time quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program. Leukemia 17:2474-2486. Van Dongen JJM, Macintyre EA, Gabert JA, Delabesse E, Rossi V, Saglio G, Gottardi E, Rambaldi A, DOtti G, Griesinger F, Parreira A, Gameiro P, Gonzalez Diaz M, Malec M, Langerak AW, San Miguel JF, Biondi A (1999) Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease - Report of the BIOMED-1 Concerted Action: Investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 13:1901-1928.

57 14. Značky a vyloučení ručení Registrované názvy, značky atd.. použité v tomto dokumentu, nelze považovat za nechráněné, i když nejsou jako registrované výslovně označeny: Biotype, Mentype (Biotype GmbH); ABI PRISM, GeneMapper TM, Hi-Di TM Formamide, POP-4 TM, POP-6 TM, POP- 7 TM, Applied Biosystems TM (Thermo Fisher Scientific Inc.); FAM (Life Technologies Ltd.). Sady jsou sady s označením CE podle evropské směrnice 98/79/ES pro diagnostika in vitro. Sady nejsou dostupné jako diagnostika in vitro mimo tuto regulační oblast.

58 15. Symboly Výrobce Datum výroby Označení šarže <N> Dostatečné pro testy <N> Dodržujte návod k použití (příručku) Lze použít do Omezení teploty Objednací číslo Diagnostika in vitro