PLYNOVÁ CHROMATOGRAFIE (GC) Dělení látek mezi stacionární a mobilní fázi na základě rozdílů v těkavosti a struktuře (separované látky vykazují rozdílnou chromatografickou afinitu) Metoda vhodná pro látky: - termostabilní a nereaktivní s ostatními látkami - s přijatelnou těkavostí - při 350 C musí být alespoň částečně v plynném stavu (horní hranice těkavosti, možnost derivatizace) - není vhodná pro většinu anorganických sloučenin (lze použít pro H 2 O, plyny apod.) http://web.vscht.cz/poustkaj 1
Molekulová hmotnost Odhad vhodnosti sloučeniny pro GC: GC Polarita http://web.vscht.cz/poustkaj 2
TECHNICKÁ REALIZACE PLYNOVÉ CHROMATOGRAFIE Nástřik - Injektor Split/splitless, on-column, pulzní techniky Nástřik velkých objemů (PTV, on-column-sve) Desorpční techniky Separace - kolona Náplňové a kapilární kolony Paralelní a vícerozměrná GC Detekce - detektor Retenční čas, spektrum T1 T2 Kvantifikace - software Odezva detektoru - plocha nebo výška píku T3 http://web.vscht.cz/poustkaj 3
GC SEPARACE - teorie I Po vstupu do kolony dochází k rozdělování molekul analytů mezi stacionární (SF) a mobilní fázi (MF), systém se blíží rovnovážné distribuci mezi SF a MF, což lze popsat pomocí distribuční konstanty K D K pohybu molekul kolonou dochází pouze prostřednictvím mobilní fáze - všechny molekuly projdou stejnou dráhou v odlišných časech podle rozdílné velikosti afinity ke stacionární fázi. Každá molekula může vstoupit do stacionární fáze a zase z ní vystoupit. Pokud je pozice obsazena, molekula putuje dále až najde volné místo. Na uvolněné místo může vstoupit další molekula. Při velkém množství molekul (přesycení systému) může dojít k rozšiřování eluční zóny a snížení zádrže (retence) - tzv. peak fronting. http://web.vscht.cz/poustkaj 4
GC SEPARACE - teorie II Separace 2 látek nastává, pokud je distribuce jejich molekul mezi SF a MF rozdílná. Možnosti zvýšení separace: 1. Zvýšením rozdílů retenčních časů (termodynamický aspekt) - ovlivnění interakcí mezi analytem a SF změnou K D a teploty 2. Zúžením píků (kinetický aspekt) - rozměry kolony, rychlost MF, parametry SF apod. úzké eluční zóny potřebují pro separaci menší rozdíl retenčních časů http://web.vscht.cz/poustkaj 5
GC SEPARACE - teorie III HLAVNÍ FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ SEPARACI: - stacionární fáze - větší rozpustnost (afinita) analytu pro danou SF = větší retence - struktura analytu - 1. analyt rozpustnější (s vyšší afinitou) pro danou SF než 2. analyt - teplota - ovlivňuje distribuci molekul mezi SF a MF teplota molekul v MF t R užší eluční zóny s nižšími retenčními časy Další faktory: rozměry kolony, nosný plyn a jeho rychlost http://web.vscht.cz/poustkaj 6
GC SEPARACE - kapacitní faktor - k Závisí na: typu kolony - SF a rozměry, teplotě, lineární rychlosti MF Molekuly jakéhokoliv analytu projdou stejnou délkou (objemem) kolony, což je tzv. mrtvý (eluční) objem vyjádřený jako retenční čas analytu procházejícího systémem bez zádrže v čase t M redukovaný retenční čas (t R ) vyjadřující dobu strávenou v SF je pro daný analyt získán jako retenční čas (t R ) zmenšený o mrtvý retenční čas: t R = t R - t M, retenční časy analytů se tedy liší o rozdíl časů strávených ve SF Kapacitní faktor (retenční faktor) k: - poměr doby strávené analytem v SF (t R ) a v MF (t M ) k = t R / t M = (t R - t M )/ t M Měřítko zádrže jedné sloučeniny v SF v porovnání s druhou (k = 0 bez zádrže, k =1 slabá zádrž, k =10 silná zádrž) - charakterizace GC separace z hlediska rychlosti http://web.vscht.cz/poustkaj 7
GC SEPARACE - distribuční konstanta K D - I Distribuční konstanta K D : - poměr molární koncentrace analytu v SF (c S ) a v MF (c M ) - vyjadřuje distribuci analytu mezi SF a MF - konstantní pro daný analyt, SF a teplotu Analyty se rozdělí mezi SF a MF v závislosti na teplotě kolony, své struktuře a charakteru SF (chromatografické afinitě) K D = c S / c M = k = (t R / t M ) (r / 2 d f ), kde = r / 2 d f = V M / V S je fázový poměr. http://web.vscht.cz/poustkaj 8
GC SEPARACE - distribuční konstanta II K D = c S / c M = k = (t R / t M ) (r / 2 d f ), = r / 2 d f = V M / V S je fázový poměr, k = K D / = K D 2 d f / r - užitečné pro odhad vlivu změn parametrů kolony při optimalizaci metody na retenci a účinnost kolony - pro zvýšení k je nutné buď K D nebo β a naopak β k (při K D konst.) = r / 2 d f β r (tedy poloměr kolony) nebo d f (tedy tloušťka SF) Vztah obsahující délku kolony a MF (nosný plyn - typ a průtok) t R = t M (2 c S d f ) / (c M r) ; t M = L / u t R = (2 c S d f L) / (c M r u) = (c S /c M ) (2 d f /r) (L/u) K D 1/ t M http://web.vscht.cz/poustkaj 9
GC SEPARACE - distribuční konstanta III Vliv teploty na K D teplota K D retence - malá změna teploty = velká změna retence (při konst.) K D silnější spojení se SF = t R - vícekrát přenos hmoty = delší analýza = více analytu ve SF, kde se nepohybuje analyt vnášen do detektoru dlouho v rozmyté zóně = široké píky K D více analytu v MF = t R - rychlý přenos do detektoru = úzké píky K D se nemění pro všechny analyty stejně - vhodné programování teploty: - na začátku analýzy K D (nižší teplota) - zlepšuje separaci - na konci analýzy K D (vyšší teplota) = užší píky http://web.vscht.cz/poustkaj 10
GC SEPARACE - separační faktor, selektivita - Schopnost SF separovat 2 sloučeniny - - poměr retencí dvou píků - vzdálenost mezi vrcholy dvou píků - žádná informace o kvalitě rozdělení, - stejné pro široké (slité) i úzké píky = k 2 / k 1 = (t R2 - t M ) / (t R1 - t M ) - určena funkčními skupinami, závisí na specifických interakcích analytů se SF - pokud > 1, lze sloučeniny rozdělit (někdy pouze částečně) - je-li =1, pak v daném systému nelze sloučeniny rozdělit http://web.vscht.cz/poustkaj 11
GC SEPARACE - účinnost (výkonnost) - I Účinnost (efficiency výkonnost) = počet teoretických pater - n účinnost šířka eluční zóny separační potenciál užší eluční zóny = vyšší kapacita píků - bezrozměrná veličina spočítaná pro 1 analyt - vztah mezi retenčním časem a šířkou píku n = 16 (t R /w b ) 2 = 5,545 (t R /w h ) 2 w b - šířka píku na základně, w h - šířka píku v polovině výšky http://web.vscht.cz/poustkaj 12
GC SEPARACE - účinnost (výkonnost) - II Účinnost = počet teoretických pater - n - n je dáno výběrem sloučeniny - píku použitého k výpočtu: je vyšší pro dříve se eluující sloučeniny a s rostoucím retenčním časem klesá (eluční zóny = píky se rozšiřují) - správná charakterizaci kolony - pík s k > 5 (lineární závislost n a k) - porovnání účinnosti kolon - použité píky identické k - vypočtené n ve skutečnosti popisuje účinnost celého analytického systému (injektor, průtok nos. plynu, teplota kolony, ) - zúžení píků programováním teploty - zásadní vliv na hodnotu n http://web.vscht.cz/poustkaj 13
GC SEPARACE - účinnost (výkonnost) - III Účinnost = počet teoretických pater - vliv teploty účinnost šířka eluční zóny izotermní X programovaná teplota http://web.vscht.cz/poustkaj 14
GC SEPARACE - účinnost (výkonnost) - IV Výška ekvivalentní teoretickému patru (h, HETP) h n účinnost - část kolony, ve které dojde jednou k ustavení rovnováhy - počet teoretických pater - celkový nebo na metr délky kolony h (HETP) = L / n - změna počtu teoretických pater v čase kontrola po definovaném počtu analýz = úředně uznatelný důkaz změny vlastností kolony - např. při akreditovaných analýzách zkrácení X výměna kolony http://web.vscht.cz/poustkaj 15
GC SEPARACE - rozlišení R Míra separace mezi dvěma píky s ohledem na šířku píků - měřítko kvality rozdělení sloučenin R je dáno účinností (n tvar píku), selektivitou stacionární fáze ( ) a retenčním časem (k) R = 1/4 n 1/2 ((α-1)/α) (k/(k+1)) nebo R = 1,18 (t R2 - t R1 ) / (w h1 + w h2 ) R < 1,5 (částečný) překryv píků; nižší n a R = 1,5 píky rozdělené bez baseline mezi sebou R > 1,5 píky rozdělené s odstupem; vyšší n a http://web.vscht.cz/poustkaj 16
GC SEPARACE - van Deemterova teorie - I Vlivy na eluční zóny (tvar píků) - rozšiřování a jiné deformace Teorie vytvořená pro náplňové kolony (následně zjednodušena pro kapilární kolony) 1. VÍŘIVÁ (turbulentní) DIFUZE v MF - H F Rozdílné proudění MF mezi částicemi sorbentu z důvodu rozdílných vzdáleností mezi nimi (tvoří se různé kanálky) molekuly analytů postupují v MF různě rychle 2. MOLEKULÁRNÍ (axiální nebo longitudinální) DIFUZE v MF - H L Analyt je na začátku kolony v úzké zóně o vysoké koncentraci při postupu kolonou na obou koncích zóny koncentrační gradient difuze molekul z místa o vyšší konc. do místa o nižší konc. (Fick. z.) - projevuje se méně s u http://web.vscht.cz/poustkaj 17
GC SEPARACE - van Deemterova teorie - II 3. ODPOR PROTI PŘENOSU HMOTY VE SF - H S Molekuly difundují z MF do SF a zpět a různě hluboko rozdílná zádrž Molekuly v MF předběhnou molekuly ve SF (SF je obsazena) rozšíření eleuční zóny 4. ODPOR PROTI PŘENOSU HMOTY V MF - H M Proud MF v koloně (v kanálcích mezi částicemi) nejednotný u stěny (povrchu sorbentu) minimální X ve středu toku maximální molekuly postupují různou rychlostí. Difuzní přestup molekul mezi proudy vyrovnání rozdílů. - projevuje se více s u H = H F + H L + H S + H M = A + B/u + (C S +C M ) u H = A + B/u + C u http://web.vscht.cz/poustkaj 18
GC SEPARACE Volba parametrů k dosažení požadovaného rozlišení 1. Programování teploty, programování tlaku, různé délky a průměry kolony, různé tloušťky SF - vliv na šířku píků, retenční čas (může dojít ke změně elučního pořadí), kapacitu píků, rozložení píků na chromatogramu 2. Volba stacionární fáze - rozdílnost charakteru a velikosti retence, rozdílnost selektivity - dochází ke změně elučního pořadí, rozdílný vliv na rozdílné analyty - aplikace paralelní chromatografie na dvou různých SF 3. Volba mobilní fáze - různé nosné plyny - rozdíly v rychlosti průtoku http://web.vscht.cz/poustkaj 19
GC SEPARACE Rozměry kolony - účinnost a rozlišení R = 1/4 n 1/2 ((α-1)/α) (k/(k+1)) t R = (2 c S d f L)/( c M r u) = (c S / c M ) (2d f / r) (L / u) n = L / h; n = 16 ( t R / w b ) 2 Délka kolony: L n 2x L R ale jen o 25-35 % Vnitřní průměr kolony: r n 4x r 2x R Tloušťka filmu SF: d f retence Velmi těkavé sl. (k < 5): d f n Méně těkavé sl. (k > 5): d f n (eluce za vyšších T rozšiřování píků) http://web.vscht.cz/poustkaj 20
GC SEPARACE Teplota - účinnost a rozlišení teplota retence Vliv na rozlišení není jednoznačný, ale je významný - teplota ovliňuje nejen retenci, ale i šířku píku, tj. účinnost. Významnou roli hraje programování teploty - buď lineárně nebo v různých rampách a gradientech - lze ovlivnit i pořadí eluce analytů (podle významnosti vlivů - tbv, afinita) a rozlišení. DĚLENÍ ČLENŮ HOMOLOGICKÝCH ŘAD: změna teploty má podobný vliv na retenci všech analytů DĚLENÍ SLOUČENIN RŮZNÉHO CHARAKTERU: změna teploty má zásadní vliv na dělení Minimální změna teploty může mít významnější vliv na dělení než změna tloušťky filmu či délky kolony http://web.vscht.cz/poustkaj 21
GC SEPARACE Nosný plyn I - účinnost a rozlišení Inertní, neovlivňuje sorpce-desorpce ani selektivitu Jeho typ a rychlost průtoku ovlivňují účinnost a dobu analýzy Lineární rychlost - u (cm/s) - rychlost nosného plynu při postupu kolonou - není stejná v celé koloně - používá se průměrná Van Deemterova křivka - vztah u a účinnosti vyjádřené jako h (výška ekvivalentní teor. patru) - pro h min je dosaženo nejvíce teor. pater tedy nejvyšší účinnosti h = A + B / u + C u http://web.vscht.cz/poustkaj 22
GC SEPARACE Nosný plyn II - účinnost a rozlišení Golayova rovnice pro kapilární kolony - neobsahuje A (sorbent): h = B / u + C u u = malá rychlost analytu v koloně = více přenosů hmoty mezi MF a SF velká longitudinální difuze (zóny se smývají) u = minimální longitudinální difuze pouze omezený počet přenosů hmoty OPTIMÁLNÍ LINEÁRNÍ RYCHLOST je proto kompromisem pro tyto protichůdně působící jevy. http://web.vscht.cz/poustkaj 23
GC SEPARACE Dusík jako nosný plyn - N 2 Nejvyšší účinnost (h min ) Hodnota optimální u - nízká (malé průtoky) a velice úzký rozsah vysoké retenční časy - křivka velmi strmá malé zvýšení rychlosti = velká změna účinnosti - není-li aplikován konst. průtok, dochází k eluci při neoptimální lin. rychl. - levný a dostupný - možnost výroby - generátor http://web.vscht.cz/poustkaj 24
GC SEPARACE Helium jako nosný plyn - He Přijatelně vysoká účinnost (h min ) - nižší než u N 2 Hodnota optimální u - dostatečně vysoká a větší rozsah nižší retenční časy- křivka není tak strmá zvýšení rychlosti = malá změna účinnosti - drahý a omezeně dostupný dochází k nárůstu ceny http://web.vscht.cz/poustkaj 25
GC SEPARACE Vodík jako nosný plyn - H 2 Vysoká účinnost (h min ) - mezi N 2 a He Hodnota optimální u - vysoká a velký rozsah nižší retenční časy- křivka je plochá zvýšení rychlosti = minimální změna účinnosti - přijatelná cena a dostupnost - možnost výroby - generátor http://web.vscht.cz/poustkaj 26