Roční zpráva 2012 o postupu prací na projektu QJ1220218 Vývoj efektivních opatření eliminujících dopad invaze Chalara fraxinea v lesním školkařství a v navazujících aspektech lesního a vodního hospodářství Ludmila Havrdová Karel Černý Karel Dohnal Miloň Dvořák Vladimír Foltánek Šárka Gabrielová Božena Gregorová Markéta Hejná Libor Jankovský Zuzana Kolářová Ondřej Koukol Marcela Mrázková Kateřina Novotná Dagmar Palovčíková Vítězslava Pešková Veronika Strnadová Petra Štochlová Michal Tomšovský 30. 12. 2012 0
V průběhu řešení v roce 2012 probíhaly práce celkem na 6 dílčích cílech (C001, C002, C003, C004, C006, C007) a šesti aktivitách (A1201 A1206) podle plánu a v předpokládaném rozsahu. Obsah Dílčí cíl C001 Aktivita A1201... 3 Výskyt a význam Chalara fraxinea... 3 Dílčí cíl C002 Aktivita A1202... 5 Izolace kmenů C. fraxinea.. 5 Dílčí cíl C003 Aktivita A1203 7 A. Výběr fungicidů, testování fungicidů in vitro 7 B. Testování metodiky pokusů.... 7 Dílčí cíl C004 Aktivita A1204... 8 Studium mykoflóry jasanu... 8 Dílčí cíl C006 Aktivita A1205... 9 Biologie patogena jako základ efektivních ochranných a obranných opatření... 9 Dílčí cíl C007 Aktivita A1206 12 A. Ověření metodiky testů rezistence.... 12 B. Ověření metodiky výběru fenotypově více odolných jedinců.. 13 C. Ověření metodiky odběru, uchování a napěstování materiálu.. 14 Přehled výsledků RIV.. 15 Hospodaření v r. 2012... 15 Změny v r. 2012. 16 Postup prací v r. 2013... 16 1
2
Dílčí cíl C001 A1201 Výskyt a význam Chalara fraxinea. (Ludmila Havrdová a kol.) Aktivita proběhla podle plánu. V letošním roce byla stanovena metodika sběru dat pro C001 - rozšíření C. fraxinea v ČR. Na základě znalostí výskytu patogenu a jeho kvantifikace bude možné vyhodnotit význam infekce pro jednotlivé zájmové okruhy (školkařství, lesní hospodářství, vodohospodářství, ochranu krajiny atp.) V rámci cíle C001 byla v roce 2012 vytvořena mapa, která rozděluje území ČR na čtvercovou síť 5 x 5 km, celkem se jedná o cca tři tisíce čtverců. Území ČR bylo na základě přírodních podmínek (členitost reliéfu, nadmořská výška, průměrné roční srážky a teploty) rozděleno do pěti typů krajiny potenciálně ovlivňujících rozšíření jasanu a C. fraxinea (Obr. 1). Pro ověření výskytu a významu patogenu bude náhodně vybráno cca 300 čtverců, které budou v následujících letech detailně prozkoumány. Při výběru čtverců určených k bližšímu hodnocení bude zohledňována četnost čtverců v jednotlivých typech krajiny a dodrženo rovnoměrné rozložení čtverců po celém území ČR. Aby na čtverci 5 x 5 km bylo redukován vliv lokální heterogenity, bude každý vždy rozdělen do 4 částí, které budou samostatně hodnoceny, zjištěné hodnoty za tyto části zprůměrovány a průměry použity do vyhodnocení za celý čtverec. Každý čtverec (včetně částí) bude hodnocen dle přiložené tabulky (Tab. 1). V každé části čtverce se budou hodnotit 3 typy porostu (lesní porost, břehový porost, roztroušená výsadba) za každý čtverec bude tak hodnoceno minimálně 12 porostů. V případě, že v jednotlivých částech čtverce bude nalezeno více porostů daného typu, budou hodnoceny všechny a za příslušnou část bude použita jejich průměrná hodnota. Pro hodnocení lesních porostů na vybraných plochách se v současné době s LČR, s.p. vyjednává případná pomoc revírníků. Pro každý vybraný čtverec bude vytvořena speciální ortofotomapa propojená s údaji o výskytu jasanů v lesních porostech, hranici lesa, vodních tocích a komunikacích (Obr. 2). Geostatistická data o výskytu jasanu v lesních porostech ČR byl získán z ÚHÚL Brandýs nad Labem, pobočka Brno. Jedná se o kompletní přehled lokalizace a kvantifikace jasanových porostů v lesích ČR. Výskyt jasanů v břehových porostech, volné krajině, či intravilánu obcí bude nutné vždy ověřit na místě šetření. Intravilány měst, nebudou do výzkumu zahrnovány. 3
Obr. 1: Typy krajiny potenciálně ovlivňující význam C. fraxinea. Tab. 1: Tabulka používaná pro terénní hodnocení významu C. fraxinea ve čtvercích 5 x 5 km. číslo plochy xxx plocha je 5 x 5 km část plochy A, B, C, D typ porostu BP / RV / LP výskyt jasanu ANO / NE výskyt chalary ANO / NE kvantifikace jasanů nejčastější poškození šířka toku plocha 5x5 km je rozdělena na 4 části (2,5 x 2,5 km) - A,B,C,D číslo plochy BP - břehový porost / RV - roztroušená výsadba / LP - lesní porost lokalita 1 / 10 / 100 <10 / 10-25 / 25-50 / >50 ks jednotky / desítky / stovky - za část plochy sečíst (max. 3 porosty) % za část plochy průměrovat (max. 3 porosty) <1 / 1-10 / >10 m jen pro hodnocení břehových porostů část plochy typ porostu výskyt jasanu výskyt chalary kvantifikace jasanu A, B, C, D, BP / RV / LP ANO / NE ANO / NE lesní správa revír 1 / 10 / 100 nejčastější poškození <10 / 10-25 / 25-50 / >50 <1 / 1-10 / >10 [ks] [%] [m] 4 šířka toku Datum šetření Vyhotovil
Obr. 2: Příklad ortofotomapy čtverce používané pro terénní hodnocení významu C. fraxinea. Dílčí cíl C002 A1202 Izolace kmenů C. fraxinea. (Ondřej Koukol a kol.) V rámci cíle byly pro izolace kmenů C. fraxinea vybrány 4 lokality lišící se nadmořskou výškou pro primární otestování, zda se diverzita genotypů odlišuje podle nadmořské výšky. Deštné u Dubé a Ploužnice (Liberecký kraj) s výškou 240 290 m n. m. a Lovečkovice a Krásné Pole (Liberecký, resp. Ústecký kraj) s výškou 440 m n. m. Z obou lokalit bylo izolováno po 20 kmenech C. fraxinea z několika výhonů na různých stromech. Z kmenů byla izolována DNA a metodou RAMS (ISSR) byly získány profily amplifikovaných úseků. Některé kmeny nebylo možné použít kvůli kontaminaci v kultuře, u některých kmenů byla znečištěna DNA po izolaci, takže na jednu lokalitu vycházelo ve finále 11-20 kmenů. PCR reakci a gelovou elektroforézu bylo nutno nejprve optimalizovat. Z pěti testovaných primerů se podařilo získat amplifikované úseky pouze ze čtyř, u gelové elektroforézy byla na základě kombinací různých agaróz a pufrů dosaženo dostatečné stability gelu. Každá reakce byla provedena dvakrát kvůli reproducibilitě výsledků. Na získaných profilech byly naskórovány proužky a v získané matici byly analyzovány podobnosti profilů na lokalitách pomocí metody PCoA (Principal Coordinates Analysis) v programu PAST (index similarity Dice). Lokalita Krásné Pole se od ostatních tří lokalit výrazně odlišovala 5
složením genotypů C. fraxinea, což zřejmě odpovídá největší geografické izolovanosti od ostatních lokalit (Obr. 3). V roce 2012 byla k původně plánovanému cíli C002 provedena analýza DNA z herbářových položek z území ČR, což je nadstavba cíle. Tuto metodu jsme zvolili kvůli větší spolehlivosti při určování ve srovnání s klasickou morfologií. Rádi bychom potvrdili, že druh Hymenoscyphus pseudoalbidus nahrazuje původní druh H. albidus a je znám z našeho území až z 90. let 20 stol. Pro tento účel jsme získali 9 položek z herbáře Národního Muzea z let 1925 2011. U většiny z nich se podařilo amplifikovat oblast ITS rdna z DNA izolované z plodničky a potvrdilo se, že před rokem 2000 byl na našem území sbírán pouze druh H. albidus. Jedním z cílů bylo vybrat na základě populační struktury kmeny pro další navazující testy (C003 - testy fungicidů, C005 - antagonistické reakce, C007 - testy rezistence na fenotypově více odolnějších jedincích). Dle publikovaných údajů neodpovídají bohužel genotypy odlišené pomocí ISSR nebo mikrosatelitů i kmenům s rozdílnými fyziologickými vlastnostmi a virulencí a proto budou kmeny C. fraxinea výše uvedené navazující testy vybírány náhodně a jako zástupci z jednotlivých lokalit. Obr. 3: Porovnání genotypů C. fraxinea ze čtyř lokalit v ČR. 6
Dílčí cíl C003 A1203 Výběr fungicidů, testování metodiky pokusů. (Markéta Hejná a kol.) A. Výběr fungicidů, testování fungicidů in vitro Na testování in vitro bylo celkem vybráno 30 fungicidů s různými účinnými látkami. Základem výběru jsou fungicidy povolené v ČR pro lesní hospodářství. Testování probíhá na Petriho miskách s živným médiem (malt extract agar) s přidaným fungicidem - 6 koncentrací účinné látky od 0,1% po 0,000001%. Pro testování byly vybrány tři dobře rostoucí izoláty Chalara fraxinea ze tří různých lokalit. Pokusy jsou prováděny ve 3 opakováních. V současnosti je testováno prvních pět fungicidů (Aliette 80 WG, Dithane DG Neotec, Horizon 250 EW, Syllit 65 WP a Zato 50 WG). Misky s izoláty jsou uloženy v termostatu při 20 c a růst kolonií je hodnocen po 10 a 20 dnech od inokulace. Účinnost fungicidů je hodnocena podle rychlosti růstu kolonií na médiích s přidanými fungicidy v porovnání s koloniemi na médiu bez fungicidů. Z testovaných fungicidů byl po prvním hodnocení nejúčinnější přípravek Zato, který již v koncentraci 0,000001% účinné látky výrazně potlačoval růst kolonií. Oproti tomu nejméně účinný byl přípravek Aliette, který ani v koncentraci 0,01% účinné látky růst kolonií výrazně nepotlačil. Všechny ostatní přípravky v koncentracích 0,1% a 0,01% růst výrazně potlačily, nebo zcela inhibovaly. B. Testování metodiky pokusů V prvním roce řešení (2012) byla vyvíjena metodika umělé infekce jasanů ve skleníkových podmínkách. Inokulace stromků byla provedena suspenzí askospor H. pseudoalbidus, nebo myceliem s konidiemi C. fraxinea. V době výskytu plodniček na opadlých (loňských) řapících jasanových listů a dozrávání askospor (červenec) byly na lokalitách s hojným výskytem patogenu nasbírány řapíky s plodničkami. Před vlastním zpracováním plodniček byla nahodile mikroskopováním zkontrolována zralost askospor. Suspenze askospor pro inokulaci byla získána rozdrcením plodniček. Suspenze mycelia s konidiemi byla získána setřením mycelia z narostlých izolátů C. fraxinea na Petriho miskách. Pokus probíhal ve fytopatologickém skleníku, inokulovány byly dvouleté zdravé jasanové stromky. Obě suspenze byly nastříkány rozprašovačem na listy, stromky zakryty na 2 dny igelitovými sáčky pro zvýšení vlhkosti (Obr. 4). Inokulováno bylo na přelomu července/srpna 31 stromků + 4 stromky ponechány jako kontrola. Koncem srpna nebyly pozorovány téměř žádné projevy infekce, proto na přelomu srpen/září proběhla další vlna inokulací tentokrát v klimatizovaném boxu s řízenou mírou vzdušné vlhkosti. Na konci října byly hodnoceny symptomy napadení (Obr. 5). Na 27 stromcích ze 31 inokulovaných byly zaznamenány alespoň malé jednotlivé skvrny. Na 12 stromcích byly skvrny velké a vícečetné. Na 12 stromcích byly pozorovány skvrny nejen na listech, ale také na řapících listů. Některé stromky přezimují ve skleníku, několik stromků ve venkovním prostředí. Na jaře bude zhodnocen jejich zdravotní stav zda došlo k proniknutí infekce do výhonů, či nikoliv. Na rozvoj infekce mají velký vliv klimatické podmínky, proto bude v příštím roce pokus zopakován ve venkovním prostředí. Schopnost spolehlivě navodit řízenou infekci by nám pomohla při hodnocení účinnosti fungicidů, protože bychom nemuseli spoléhat pouze na přirozenou infekci. 7
Obr. 4: Inokulace jasanů patogenem Obr. 5: Výsledek umělé inokulace C. fraxinea v in vitro podmínkách. nekróza listů a řapíků. Dílčí cíl C004 A1204 Studium mykoflóry jasanu. (Koukol a kol.) Pro studium mykoflóry jasanů s ohledem na patogen C. fraxinea byly zvoleny jednoleté výhony. Pro odběr vzorků jasanových výhonů byly vybrány dvě lokality: horská lokalita Luž Horní Světlá (650 m n. m., Lužické hory, typ porostu roztroušená výsadba - linie jasanů kolem sjezdovky) a lokalita ve středních polohách Heřmanice (418 m n. m., České středohoří, typ porostu roztroušená výsadba - linie jasanů kolem pastviny). Na těchto lokalitách, které jsou obě dlouhou dobu vystaveny infekčnímu tlaku, byly vybrány 3 dvojice přibližně 60-ti letých jasanů. Vybraní jedinci byli vystaveni stejným klimatickým a geomorfologickým podmínkám, rostli vedle sebe, nebo v těsné blízkosti. Jeden ze dvojice byl vždy infikovaný druhem Chalara fraxinea a druhý byl zdravý, či minimálně infikovaný. Z každého stromu bylo teleskopickými zahradními nůžkami odebráno 8 zdravých jednoletých výhonů přibližně ve výšce 4 m. Odběry byly provedeny 19. a 20. 7. 2012 a následující den zpracovány v laboratoři. Vodou omyté výhony byly rozděleny na kůru a dřevní část a z těchto částí byly připraveny segmenty o velikosti cca 5 3-4 mm do vzdálenosti 10 cm od vrcholu. Kůra byla sterilizována třepáním 30 s v ethanolu (96%), 1 min v chlornanu sodném (0,5 %), 30 s v ethanolu, opláchnuta ve sterilní deionizované vodě. Dřevo bylo sterilizováno třepáním 10 s v ethanolu (96%), 10 s v chlornanu sodném (0,5 %), 10 s v ethanolu a opláchnuto ve sterilní deionizované vodě. Následně bylo 5 kousků kůry a 5 kousků dřeva z jednoho výhonu vyseto 8
na 9 cm Petriho misku s 2 sladinovým agarem. Takto upravené vzorky byly inkubovány v Petriho miskách při 20 C v termostatu po dobu 6 týdnů. Kolonie vyrostlé z kousků dřeva a kůry byly rozčleněny do morfotypů podle fenotypových znaků a byla zaznamenána jejich četnost výskytu. Každý morfotyp byl založen do mykologické sbírky VÚKOZ, v.v.i. na šikmé kultuře ve třech opakováních. Identifikace morfotypů probíhala na základě porovnání shody morfologických a molekulárních znaků a bude pokračovat i v roce 2013. Získané morfotypy jsou kultivovány dle potřeby na různých kultivačních médiích pro tvorbu charakteristických morfologických znaků a na jejich základě jsou určovány. Z většiny morfotypů byla také izolována DNA pomocí Ultra Clean Microbial DNA Isolation Kit. Pro sekvenování DNA je používána oblast ITS rdna, u problematicky určitelných druhů také oblast LSU rdna nebo TEF-1α. Sekvence DNA jsou srovnávány s databází GenBank, popřípadě s databází Fusarium ID. Na 960 fragmentech jasanových výhonů bylo celkově zaznamenáno 384 kolonií hub, které byly rozčleněny do 52 morfotypů. Po molekulární identifikaci bylo 13 morfotypů sloučeno, neboť se jednalo o shodné druhy. Dva morfotypy se nepodařilo kultivovat. Ze zbylých 37 morfotypů je 15 identifikováno do druhu, 5 do rodu a 7 do řádu. Nejčastějšími (četnost alespoň 5 %) jsou druhy Aureobasidium pollulans, dva blíže neurčené druhy kvasinek, Phoma macrostoma var. incolorata, Phomopsis sp., Fusarium lateritium, Phoma macrostoma a blíže neurčený druh řádu Pleosporales sp. Dílčí cíl C006 A1205 Biologie patogena jako základ efektivních ochranných a obranných opatření. (Miloň Dvořák a kol.) V roce řešení 2012 byly plánovány pouze přípravné práce. V rámci řešitelského týmu ale vznikla již v tomto roce potřeba znát některá základní data o bionomii patogenu. Zejména období, kdy se začínají vyskytovat ve vzduchu spory, kterými se patogen šíří. Počátek výskytu spor je zásadní moment fenologie patogenu, který určuje načasování ochranných zásahů při kontrole infekce např. aplikace fungicidů. Z tohoto důvodu bylo zatím na jedné lokalitě provedeno pozorování výskytu patogenu a byly odchytávány spory H. pseudoalbidus. Sledování bionomie patogenu bylo realizováno pomocí zařízení na odchyt spor se současnou instalací meteorologické staničky. Spory H. pseudoalbidus byly odchytávány od začátku června do konce října 2012 automatickým sedmidenním lapačem spor (Amet) Burkardova typu (Hirst, 1952) (Obr. 6). Lepové pásky se sporami byly vyhodnocovány mikroskopicky. Meteorologická data byla zaznamenávána automatickou klimatickou stanicí SIGNALIZÁTOR (Amet), která v hodinových intervalech zaznamenávala teplotu a vlhkost vzduchu, rosný bod a ovlhčení listů (prostřednictvím měření napětí mezi sadou elektrod propojenou exponovaným filtračním papírem). Měření bylo prováděno na lokalitě Hackerova školka na území Školního lesního podniku Masarykův les Křtiny, GPS: 49 19'23.962"N, 16 44'39.419"E, 470 m n. m. Lapač byl umístěn 30 cm nad zemí, 10 m od paty kmene asi 40 letého jasanu ztepilého s jasnými příznaky infekce nekrózou jasanu už v předchozích dvou letech. Dle možností bylo při 9
každotýdenní údržbě lapače zkontrolováno několik řapíků listí opadlého v loňském roce. Sledován byl výskyt plodnic H. pseudoalbidus a v několika případech byl mikroskopován jejich fyziologický stav stupeň dozrání askospor. Průběh meteorologických veličin v denních průměrech a časově příslušné počty spor v denních úhrnech jsou znázorněny v grafech. První spory byly zachyceny 5. července 2012 po několika dnech s vysokými teplotami a ovlhčenými listy (Obr. 7, 8). Poslední spory byly zjištěny již 10. srpna. Zřejmě z důvodu suchého pozdějšího léta a podzimu hodnoty ovlhčení listů byly velmi nízké již od 28. července, až do 4. října. V rámci dne se spory vyskytovaly především v ranních hodinách, maximum výskytu mezi 5 9h. Výskyt apothecií byl prvně pozorován 13. června (Obr. 9), askospory však ještě nebyly vytvořeny. Mikroskopováním apothécií z 28. června bylo zjištěno, že spory jsou již ve zralém stavu. Obr. 6: Automatický sedmidenní lapač spor (Amet) 10
Obr. 7: Počty zachycených spor za den (No. spores) a průběh průměrného ovlhčení (AVG Leaf Wet.) Obr. 8: Počty zachycených spor za den (No. spores) a průběh průměrné denní teploty (AVG Temp.) 11
Obr. 9: Apothecia H. pseudoalbidus, 13. 6. 2012, Hackerova školka Dílčí cíl C007 A1206 Ověření metodiky testů rezistence. Ověření metodiky výběru fenotypově více odolných jedinců odběru, uchování a napěstování materiálu. (Kateřina Novotná a kol.) A. Ověření metodiky testů rezistence Infekční testy byly prováděny na segmentech větví odebraných ze dvou stromů Fraxinus excelsior. Stejný den byly převezeny do laboratoře, kde z nich byly nařezány segmenty, ty ponořeny distálním koncem do deionizované vody a drženy na chladném místě. Druhý den byly segmenty inokulovány patogenem. Vlastní inokulace proběhla 30. 7. 2012. Jednotlivé segmenty byly povrchově sterilizovány lihem v místě inokulace ve flow-boxu. Na bezsukém místě byly po jednom na každém vzorku vyraženy otvory s pomocí razidla o průměru 5 mm. Do vzniklého otvoru byl na obnažené dřevo následně umístěn stejně velký segment agaru SL2% vyražený z okraje aktivně rostoucí kolonie čerstvého izolátu C. fraxinea tak, aby se myceliem dotýkal dřeva. Na každý segment byl vždy použit jediný izolát C. fraxinea, přičemž byl každý ze dvou genotypů jasanů inokulován jedním ze tří izolátů C. fraxinea. Izoláty byly izolovány v různých oblastech ČR a jsou uloženy ve sbírce VÚKOZ, v.v.i.. Poté byla rána ovázána Parafilmem. Inokulované segmenty větví byly ponořeny distálním koncem cca 10 mm v deionizované vodě a v náhodném rozmístění vloženy do 12
termostatu a kultivovány ve tmě při teplotě T = 20 C. Tři týdny po inokulaci se okometricky porovnávaly plochy jednotlivých nekróz. V rámci předběžného testování citlivosti jedinců F. excelsior vůči C. fraxinea byl zjištěn rozdíl v citlivosti a to jak mezi jednotlivými genotypy tak i při použití jednotlivých izolátů. Inokulace segmentem mycelia se proto zdá být vhodnou metodou pro infekční testy, které budou probíhat v dalších letech. V rámci cíle C003 byla v letošním roce otestována také inokulace kapkou suspenze askospor, která se za současných znalostí zdá nevhodnou metodou pro testování citlivosti jedinců F. excelsior vůči C. fraxinea. B. Ověření metodiky výběru fenotypově více odolných jedinců V rámci terénních šetření, která proběhla v letošním a předešlém roce se zjistilo, že nejdůležitější kritérium pro výběr fenotypově více odolných jedinců je najít zdravého jedince, který se vyskytuje v bezprostřední blízkosti již infikovaných jasanů (tzn. je již delší dobu vystaven infekčnímu tlaku) a má stejné či přibližné stanovištní podmínky. V letošním roce bylo označeno 5 jedinců (Tab. 2), kteří splňovali výše uvedené kritérium a vykazovali vyšší odolnost vůči C. fraxinea. Všechny lokality byly zaměřeny pomocí GPS. Tab. 2: Vytipovaní jedinci vykazující vyšší odolnost vůči infekci C. fraxinea. Poř. Číslo Lokalita Okres Typ porostu Souřadnice Nadm. Výška Přibl. stáří 1 Horní Světlá Česká Lípa linie 50º 50.386' S, 14º 39.060' V 626 60 2 Valeč Karlovy Vary solitér 50º 9.955' S, 13º 14.169' V 584 40 3 Vranovice Brno - venkov linie 48º 56.748' S, 16º 36.088' V 172 50 4 Novosedlo Česká Lípa les 50º 41.699' S, 14º 22.439' V 388 50 5 Lada v Podještědí Liberec 6 Dolní Světlá Česká Lípa roztroušený výskyt 50º 46.427' S, 14º 44.832' V 318 80 roztroušený výskyt 50º 49.511' S, 14º 40.062' V 445 40 V letošním roce také byly navštíveny 4 provenienční jasanové plochy (Tab. 3) z původních 11, nyní existujících 6-ti ploch založených v roce 1999 RNDr. Václavem Buriánkem (VÚLHM, v,v,i, Strnady). Hodnota provenienčních ploch pro výzkum C. fraxinea je především v délce trvání pokusu, v množství testovaných proveniencí (33 proveniencí F. excelsior a 2 provenience F. angustifolia), v umístění ploch v různých klimatických a geomorfologických podmínkách, které jsou po stejně dlouhou dobu vystaveny infekčnímu tlaku patogenu a lze tedy porovnat případné rozdíly, popř. vytipovat nejvhodnější provenienci pro další pokusy. 13
Tab. 3: Provenienční jasanové plochy v ČR. (červeně navštívené; škrtnuté neexistující). Č. Lesní správa Revír Lokalita Lesní oblast Veg. stup. Nadm. výška Ekotop 1 Litvínov Unčín Užín 2b - Mostecká pánev 1 180 rekultiv. sýpka 2 Teplá Klášter Křepkovice 3 - Karlovarská vrchovina 6 710 suťový 3 Nižbor Koněprusy Koněprusy 8b - Český kras 2 350 suťový - váp. 4 Kaplice Rychnov Bujanov 12b - Předhoří Novohr. hor 5 570 bývalá školka 5 Nymburk Kolín Veltrubský luh 17 - Polabí 1 190 lužní 6 Bystřice p. H. Kroměříž Záměček 34 - Hornomoravský úval 1 190 lužní 7 Židlochovice Tvrdonice Tvrdonice 35 - Jihomoravské úvaly 1 155 lužní 8 Strážnice Javorník Bůrová 38a - Bílé Karpaty 3 490 suťový 9 Frenštát Jindřichov Bělotín 29 - Nízký Jeseník 4 360 lužní - pahor. 10 Spálené Poříčí Bohutín Vysková 7 - Brdská vrchovina 3 625 11 Česká Lípa Dubá Zakšín 18a - Sev. písk. plošina 1 250 lužní - pahor. C. Ověření metodiky odběru, uchování a napěstování materiálu Pro ověření vegetativního množení bylinnými řízky u jasanu ztepilého byly použity letorosty odebrané z juvenilních a adultních jedinců. Při odběru bylo nutné brát zřetel na vyzrálost odebíraných letorostů. Odběr letorostů byl proveden ve třech termínech (Tab. 4). Na základě literárních podkladů bylo pro naše účely vybráno jako nejvhodnější způsob reprodukce jasanu ztepilého jeho vegetativní množení pomocí bylinných řízků. Z rostlinného materiálu byly v den odběru připraveny jednotlivé řízky. Použity byly pouze polovyzrálé části letorostů. Řízky byly připraveny tak, že cca 3 cm pod spodním očkem byl proveden lehce šikmý řez. Délka řízků byla různá v závislosti na délce jednotlivých internodií. Řízek byl zastřižen cca 0,5 cm nad vrchním očkem vybraného internodia. List vyrůstající u spodního očka byl odstraněn a vrchní listy byly zakráceny na polovinu. Takto připravené řízky byly preventivně ošetřeny opláchnutím ve světle růžovém roztoku manganistanu draselného, aby nedošlo k zavlečení případných patogenů přítomných na připravených řízcích na okolní kultury. Pro zakořeňování byl použit 1 % pudrový stimulátor IBA (kyselina 3-indolylmáselná). Řízky byly smočeny ve stimulátoru a následně napíchány do připravených sadbovačů se substrátem pro zakořenování. Takto připravené sadbovače s řízky byly přeneseny do skleníku, kde se teplota pohybovala okolo 22 C, pod jemně mlžící závlahu, která automaticky reaguje na změny vzdušné vlhkosti a vzdušné teploty. V takovýchto podmínkách nedochází k vysychání substrátu a díky vysoké vzdušné vlhkosti ani k uvadání listů. Po 8 týdnech od nařízkování následovalo vyhodnocení. Sadbovače byly odneseny ze skleníku a řízky opatrně vyndány z jednotlivých jamek. Jako zakořenělé byly brány řízky, u kterých byly viditelné kořeny. Při prvním termínu řízkování zakořenila čtvrtina řízků, naproti tomu ve druhém a třetím termínu nezakořenil prakticky ani jeden řízek (Tab. 4). Na základě získaných výsledků se jako nejvhodnější termín odběru řízků zdá začátek června. Tab. 4: Úspěšnost zakořeňování bylinných řízků F. excelsior. Datum Materiál Řízků [ks] Zakořenilo [%] 4.6.2012 juvenilní 77 26 18.6.2012 juvenilní 34 0 27.7.2012 adultní 67 1 14
Přehled výsledků RIV V roce 2012 nebyly plánovány žádné výsledky. Pro rok 2013 také nejsou plánovány žádné výsledky, přesto předpokládáme vytvoření metodiky pro identifikaci C. fraxinea. Tuto metodiku budou moci využívat vlastníci lesa, povodí, ochrana přírody atp. Další výsledky (nehodnocené RIV) Havrdová Ludmila, Dvořák Miloň, Jankovský Libor, Procházková Zdeňka (2012): Situation with Ash in the Czech Republic. COST FRAXBACK November 13th 14th 2012, Vilnius, Lithuana. (abstract) Ostatní činnosti 2012 Prezentace na semináři MICROMYCO 11. 12. 9. 2012 České Budějovice. Havrdová Ludmila, Černý Karel (2012): Invaze Chalara fraxinea v CHKO Lužické hory předběžné výsledky výzkumu. Přednáška + terénní exkurze pro VLS, s.p., 13. 9. 2012 Valeč - vojenský újezd Hradiště. Havrdová Ludmila (2012) : Současné plošné odumírání jasanů v ČR. Přednáška + terénní exkurze pro CHKO Lužické hory (LCŘ, SRS, AOPK, POH, PLA, PVL, samospráva) 14. 9. 2012 Jablonné v Podještědí. Havrdová Ludmila (2012): Současné plošné odumírání jasanů v ČR. Prezentace na mezinárodní konferenci COST FRAXBACK 13. - 14. 11. 2012 Vilnius, Litva. Jankovský Libor, Dvořák Miloň, Havrdová Ludmila, Procházková Zdeňka, Maršík Petr (2012): Ash dieback in the Czech Republic. Hospodaření v r. 2012 Hospodaření v r. 2012 probíhalo v souladu s plánem. V souladu s pravidly Smlouvy o poskytnutí podpory na řešení projektu QJ1220218, v říjnu 2012 požádaly tři instituce (příjemce VÚKOZ v.v.i. a oba další účastníci projektu PLA, s.p. a Sdružení školkařů) poskytovatele (MZe ČR) o přesun mezi položkami vyšší než 20 tis. V případě VÚKOZ, v.v.i. bylo po konzultaci s ředitelkou odboru výzkumu, vzdělávání a poradenství, Ing. Chmelíkovou, přesunuto 45 tis. Kč z mzdových nákladů do položky HMM na obnovu části stereomikroskopu a úhrady části notebooku. O přesun bylo požádáno vzhledem k tomu, že v průběhu řešení projektu došlo ke zpoždění nástupu laborantky do řešitelského týmu. Vzhledem k tomu, že další účastníci projektu nejsou příjemci podpory (účelová podpora MZe 0,- Kč) byly ze strany MZe tyto změny vzaty na vědomí. Všechny navrhované přesuny byly povoleny. Ostatní přesuny mezi položkami jsou u všech příjemců účelové podpory i dalších účastníků v souladu s Všeobecnými podmínkami MZe (čl. 13.7.), kdy přesuny finančních prostředků mezi jednotlivými schválenými položkami uznaných nákladů u každého příjemce zvlášť činí v maximální částce 20 tis. Kč. Tyto přesuny budou za jednotlivé organizace detailně popsány v elektronické závěrečné zprávě (aplikace eprojekty). V případě příjemce Univerzita Karlova došlo k přečerpání mzdových prostředků, které bylo způsobeno dovolenými, jejichž hodnoty jsou obtížně predikovatelné, a 15
i když byl upraven mzdový výměr řešitele na konci roku, přesto se nepodařilo dosáhnout přesně plánované částky a kvůli odvodům tato částka přesáhla 4 tis. Kč. Tato částka byla naopak ušetřena v položce materiál, celkové vyúčtování příjemce tak činí 0,- Kč. V současné době (30. 12. 2012) zbývá dočerpat část mzdových prostředků za prosinec, část prostředků režijních (u v.v.i. a veřejných vysokých škol se z větší části rozpočítává na konci roku). V roce 2012 v rámci úsporných opatření nedošlo k dočerpání některých položek (v souladu s pravidly poskytovatele), které budou převedeny do fondů FÚUP jednotlivých příjemců dle pravidel Smlouvy. Změny v r. 2012 - doplnění řešitelského týmu výzkumnými pracovníky pro zajištění vybraných laboratorních prací (Mgr. Markéta Hejná, Mgr. Zuzana Kolářová) - změna v řešitelském týmu Mendlovy univerzity v Brně, novým řešitelem se stal Ing. Miloň Dvořák, Ph.D. - změna statutárního zástupce v projektovém týmu VÚLHM, v.v.i. - změna statutárního zástupce v projektovém týmu PLA, s.p. - změna statutárního zástupce v projektovém týmu VÚKOZ, v.v.i. Postup prací v r. 2013 Žádost o změnu v řešení projektu Vzhledem k publikovaným zahraničním studiím v letošním roce plánujeme pozměnit původní cíl C002 (V002) sledovat populační analýzu v rámci celé ČR. Dle těchto studií je obecně vysoká variabilita kmenů na všech dosud studovaných lokalitách v Evropě a lze předpokládat, že tomu bude stejně i v ČR a tudíž nelze předpokládat sníženou možnost pohlavního rozmnožování na některé z lokalit. Plánujeme se zaměřit na zjištění konkrétních souvislostí mezi kmeny C. fraxinea kolonizujících např. řapíky a výhony, kde se předpokládá odlišnost. Dále bychom použili přesnější metodu založenou na sledování mikrosatelitů v genomu C. fraxinea. Tato metoda nemohla být využita v projektu dříve, neboť specifické primery pro C. fraxinea byly publikovány teprve v letošním roce. Předkládané změny nebudou mít dopad na úpravu rozpočtu. Plán prací na r. 2013 Na rok 2013 jsou plánovány práce na dílčích cílech C001 C004, C006, C007. C001: Bude probíhat mapování patogenu C. fraxinea v terénu dle předložené metodiky. C002: Budou zjišťovány konkrétní souvislosti mezi kmeny C. fraxinea kolonizujících např. řapíky a výhony, kde se předpokládá odlišnost. Plánujeme používat přesnější metodu založenou na sledování mikrosatelitů v genomu C. fraxinea. Hodláme pokračovat v započaté analýze DNA z herbářových položek z území ČR, což je nadstavba k původně plánovanému cíli C002. V roce 2013 předpokládáme zopakování odběrů řapíků s plodničkami na historických lokalitách a ověření, zda je zde i v současnosti možné najít H. albidus. 16
C003: Na jaře následujícího roku budou pokračovat pokusy in vitro s dalšími fungicidy, dle výsledků bude vybráno cca 5 fungicidů, které budou použity při polním pokusu ve školkařském provozu. Na vyčleněných stromcích budou na vybrané pokusné ploše na základě pokusů in vitro testovány vybrané fungicidy s ohledem na mechanismus účinku konkrétního fungicidu. Pokusy budou probíhat ve společnosti Školky Montano s.r.o., kde se infekce vyskytuje opakovaně každý rok, za použití jednoletých až dvouletých stromků. Přesto nebudeme spoléhat pouze na přirozenou inokulaci, ale pro větší infekční tlak použijeme suspenzi askospor a řapíky s plodničkami umístěné pod pokusné stromky. Každý fungicid bude testován na 100-120 stromcích. Přípravky budou aplikovány (koncentrace, načasování) dle pokynů výrobce. C004: Předpokládáme dokončení identifikace endofytů jasanových výhonů z letního odběru roku 2012 a vyhodnocení výsledků. Dále bude v lednu 2013 proveden zimní odběr jasanových výhonů, izolace kmenů a jejich následné určování pro porovnání se společenstvem endofytů z letního odběru. C006: Plánujeme rozšíření portfolia pokusných ploch o další 4 lokality. Lokality se navzájem liší svou geomorfologií, nadmořskou výškou a klimatickými podmínkami, proto bude možné lépe vystihnout variabilitu bionomie patogenu a projevu symptomů. Na každé z ploch budou měřeny dosavadní meteorologické veličiny a odchytávány spory pomocí automatických lapačů a v týdenních intervalech pozorovány symptomy onemocnění a výskyt plodnic H. pseudoalbidus. K obsluze ploch a k pomoci s vyhodnocováním dat byl pro řešení bakalářské práce přijat student bakalářského studijního programu Arboristika Vojtěch Kasal. Řešitel Miloň Dvořák, účastník projektu COST Fraxinus dieback in Europe: elaborating guidelines and strategies for sustainable management (FRAXBACK), podal žádost o absolvování STSM (krátkodobé vědecké stáže) ve Výzkumném institutu v Gembloux (Belgii). Od 8. července do 3. srpna 2013 se bude podílet na obsluze a vyhodnocování dat elektrostatických lapačů spor pomocí kvantitativní PCR. Díky nabytým znalostem a zkušenostem bude možné modifikovat a zefektivnit stávající metodiku odchytu spor a tím zpřesnit a zkvalitnit výstupy tohoto dílčího úkolu. C007: V roce 2013 bude zjišťován vliv in situ infekce C. fraxinea hostitele (zdravý jedinec, akutně infikovaný jedinec C. fraxinea). Dále plánujeme vyhodnotit vliv patogenu C. fraxinea na jasany na provenienční ploše Zakšín, která je v nejlepším technickém stavu. Plánujeme také hodnocení zdravotního stavu jasanů (z hlediska výskytu C. fraxinea) v jediném semenném sadu v ČR na území LS Jablunkov, revír Horní Lomná, založeného v roce 1997. Výsledky z vegetativního množení bude nutné ještě porovnat s výsledky roubování, které bude provedeno v dalším roce řešení projektu. Zjištěné výsledky poslouží k vybrání nejvhodnější metody k uchování genotypů jasanu s průkazně vysokou úrovní rezistence vůči C. fraxinea. Ludmila Havrdová a kol., 30. 12. 2012 17