Fakulta životního prostředí v Ústí nad Labem Pokročilé metody studia speciace polutantů (prozatímní učební text, srpen 2012)
Obsah kurzu: 1. Obecné strategie speciační analýzy. a. Úvod do problematiky b. Definice speciační analýzy a frakcionace c. Problémy k řešení d. Strategie speciace e. Formy prvků a pole zájmu ve speciační analýze 2. Odběr, uchování a zpracování environmentálních vzorků. a. Zásady odběru vzorku pro speciační analýzu b. Metody in situ c. Zpracování vzorku pro speciační analýzu d. Izolační a prekoncentrační postupy 3. Přímé metody speciační analýzy kovů. 4. Hybridní metody speciační analýzy kovů. 5. Modelování speciace prvků. 6. Speciační analýza prvků ve složkách životního prostředí. a. Speciační analýza kovů v atmosféře b. Speciační analýza vody c. Speciační analýzy půdy, sedimenty d. Speciační analýzy biologický materiál 7. Trendy a vývoj speciační analýzy. a. Vývoj ve zpracování a úpravě vzorku b. Vývoj v přístrojových technikách i. Pro přímé metody speciační analýzy ii. Pro hybridní metody speciační analýzy Doporučená studijní literatura: 2
1. Chemical speciation in the environment. Edited A. M. Ure and C. M. Davidson, 2- nd ed., Blackwell Science Ltd., ISBN 0-632-05848-X, 2002 2. Trace element speciation: Analytical methods and problems. Edited by G. E. Batley, CRC Press, Inc., ISBN 0-8493-4712-2, 2000 3. Handbook of elemental speciation: techniques and methodology. Edited by R. Cornelis, Wiley, ISBN 0-471-49214, 2003 4. Handbook of elemental speciation II. Species in the environment, food, medicine and occupational health, techniques and methodology. Edited by R. Cornelis, Wiley, ISBN 10-470-85598-3, 2005 5. J. Szpunar and R. Lobinski, A.Prange: Hyphenated techniques in speciation analysis, Camridge, ISBN 0-85404-545-7, 2003 1. Obecné strategie speciační analýzy 3
a. Úvod do problematiky Speciace, slovo vypůjčené z biologických věd, se stalo novým pojmem v analytické chemii poté, co byly prokázány různé toxikologické, biochemické a fyziologické účinky jednotlivých chemických forem prvků. S formou prvku souvisí jeho mobilita, nutriční hodnota, transformace v jednotlivých složkách životního prostředí a následně jeho koloběh v přírodě, vstupy do potravních řetězců, lékařské aspekty a mnoho dalších dějů. Stanovení celkového obsahu prvku proto často nevypovídá o jeho vlivu na živé organizmy, zásadní vliv mnohdy má pouze některá jednotlivá forma prvku a to i při velmi nízkých koncentracích. Vybraným příkladem mohou být cín a rtuť. Anorganické formy těchto prvků jsou buď velmi málo toxické, či vůbec, zatím co alkylované formy jsou velmi toxické. Na začátku 20. století se analytičtí chemici zabývali vývojem metod stopové analýzy, od roku 1960 se hlavním zájmem analytiků stala stopová speciační analýza vedoucí k určení formy prvku nebo frakce, ve které se v daném materiálu nachází. b. Definice speciační analýzy a frakcionace Z důvodu sjednocení používané terminologie ve speciační analýze vydala Mezinárodní unie pro čistou a aplikovanou chemii (The International Union for Pure and Applied Chemistry IUPAC) v roce 2000 doporučení, které prezentuje definice pojmů souvisejících se speciační analýzou a chemickými speciemi. Odlišuje frakcionaci od speciační analýzy a navrhuje třídění specií podle izotopického složení, oxidačního a elektronového stavu, komplexní a molekulové struktury Chemická specie specifická forma prvku definovaná izotopovým složením, elektronovým nebo oxidačním stavem nebo molekulovou strukturou Speciační analýza analytická činnost vedoucí k identifikaci nebo stanovení specií Speciace prvku distribuce prvku mezi jednotlivé specie v systému Frakcionace proces klasifikace analytů na základě fyzikálních (velikost, rozpustnost) nebo chemických (vazby, reaktivita) vlastností 4
Často není možné stanovit koncentraci jednotlivých chemických specií, protože nejsou v dané matrici stabilní, v praxi se proto identifikují jednotlivé frakce prvkových specií. Templeton, D. M., Arbese, F., Cornelis R., Danielson, L., G.,Muntau, H., Van Leeuwen, H. P. and Lobinski, P., Pure Appl. Chem., 72, 1453 (2000) c. Problémy k řešení Hlavní otázky speciační analýzy: Které specie chceme měřit? Co o nich víme? Jak odebrat vzorek a izolovat z něho studované specie beze změny jejich složení? Máme dostatečně citlivou analytickou metodu pro stanovení ultrastopových koncentrací těchto specií? Jak kalibrovat? Standardy nejsou povětšinou komerčně dostupné. Jak validovat použitou metodu, aby výsledky byly spolehlivé? Klíčový ve speciační analýze je vývoj nových vysoce citlivých analytických metod, zvláště pro stanovení specií v přirozených nekontaminovaných vzorcích. Současným trendem je vývoj počítačově kontrolovaných automatických systémů, které by byly ohromnou výhodou pro rutinní analýzy. Přednost mají metody jednoduché, robustní, levné a ty, které je možno použít přímo v terénu. Mimo to sehrají v rychlé detekci specií a odhadu jejich koncentrace v budoucnu nejrůznější senzory. K zabezpečení správných a přesných výsledků je nutná dobrá laboratorní praxe a validace používaných metod. S tím souvisí produkce certifikovaných referenčních materiálů a vznik legislativy. Produkt, který splňuje legislativní limit pro celkový obsah prvku, může obsahovat stopové množství jeho velmi toxické specie. Jako opačný příklad může sloužit arsen v potravinách. Celkový obsah arsenu v rybích produktech překračuje často povolený limit, ale potravina není nebezpečná, protože arsen je v ní přítomen ve formě netoxického arsenobetainu. d. Strategie speciace 5
Před vlastní analýzou je třeba shromáždit všechny dostupné znalosti o studované specii, její prvkové složení, hmotnost, bio- a environmentální cykly, její stabilitu, transformace, interakce s živou a neživou hmotou. Bohužel, u mnoha prvků nejsou dosud známy žádné podrobnosti o jejich speciích, zvláště pak o speciích s biologickými ligandy, výjimečně je známo pouze několik málo nejistých informací. Celkový obsah prvku v životním prostředí je možno považovat za neměnný, obsah specií se naopak může rychle dynamicky měnit ve vztahu k okolnímu prostředí, v závislosti na chemických parametrech jako je ph, koncentrace potenciálních ligandů, redoxní potenciál, fyziologický stav v buňkách atd. a na fyzikálních parametrech jako je teplota, vlhkost, UV záření, přítomnost organické hmoty atd. Je třeba brát v úvahu nejen termodynamickou ale i kinetickou stabilitu specie v životním prostředí. Např. specie v atmosféře jsou vysoce nestabilní a jejich stanovení vyžaduje speciální přístup. Na druhé straně specie v živých organizmech jsou poměrně stabilní, vázané v kovalentních vazbách v buňkách (např. Co ve vitaminu B12). Porozumění koloběhu prvků v bio-geochemickém cyklu hraje ve speciační analýze zásadní roli. Prvky, které se do životního prostředí a živých organizmů dostávají buď z přírodních nebo antropogenních zdrojů, zůstávají pouze z velmi malé části ve formě volných iontů. Většina vytvoří komplexy s anorganickými a organickými ligandy a podléhá řadě reakcí. Převládajícím jevem je v přírodním prostředí methylace. Vzniklé specie mohou být mnohem toxičtější v případě methylrtuti, nebo méně toxické v případě arsenu. Koncentrace iontové rtuti ve vodách je velmi nízká (řádově jednotky ng/l) a sotva 1% celkového obsahu tvoří methylrtuť. Avšak v organizmech predátorů díky akumulaci tvoří methylrtuť 90 100% celkové rtuti. Dalším z nejvýraznějších příkladů je skupina alkyl-, butyl- a fenyl derivátů cínu. Používají se jako vysoce účinné lodní nátěry, fungicidy, insekticidy, stabilizátory PVC, prostředky proti bakteriím. I když tvoří jen nepatrnou část celkového množství cínu (převážně oxidy cínu), jsou v současnosti detekovatelné v rybích produktech a dokonce v zelenině v kontaminovaných oblastech. V živých organizmech mají dlouhý poločas života a vážně poškozují endokrinní žlázy. Stopová speciační analýza se stává velmi důležitou ve všech oblastech života, v průmyslu, v procesu poznávání, v státních orgánech a legislativě. e. Formy prvků a pole zájmu ve speciační analýze 6
Specie, které jsou v hlavním zájmu analytiků můžeme rozdělit do tří skupin: Různé redoxní formy prvku Organokovové sloučeniny (obsahují vazbu uhlík-kov nebo uhlík metaloid) Komplexní sloučeniny Na obrázku č. 1. jsou uvedeny hlavní specie vyskytující se v životním prostředí, které jsou v zájmu analytiků. Obr. 1. Mezi tzv. klasické metody speciační analýzy patří určení antropogenních organometalických sloučenin a produktů jejich degradace v životním prostředí, jako jsou methylrtuť, alkyl-, butyl- a fenyl deriváty cínu, jednoduché organoarsenové a organoselenové sloučeniny a organosloučeniny olova. Pro tyto dobře definované sloučeniny jsou komerčně dostupné standardy a speciační analýza je usnadněna tím, že je kovový prvek vázán na uhlík a sloučenina je relativně stabilní v průběhu přípravy vzorku a dostatečně těkavé pro možnost použití plynové chromatografie. Zcela jiná je situace při měření endogenních specií v biologických materiálech. Miliony let vývoje života na Zemi vedly k vzniku obrovského množství biologických ligandů 7
s koordinačním potenciálem pro stopové prvky. Prvky se tedy vyskytují v biologických materiálech vedle sloučenin s relativně nízkou molekulovou hmotností, jako např. i v elementární formě (Fe ve fortifikovaných potravinách), nebo ve formě volných nebo hydratovaných iontů kovů a nekovů v různých oxidačních stupních ( Na +, Cl -, As 2 O 3 ), v komplexech s relativně malými ligandy (citráty, vinany, šťavelany), v komplexech s peptidy (glutathion, fytochelatiny, metalothioneiny), s ostatními organickými ligandy (např. sloučeniny se sacharidy, organickými kyselinami, porfyriny, kyselinou fytovou atd.), jako kovalentní sloučeniny nekovových a polokovových prvků (např. sirné aminokyseliny a jejich selenová analoga, fytová kyselina), jako organokovové sloučeniny (např. methylrtuť), nebo jako minerální látky vázané na nerozpustné biopolymery (např. vazba na různé složky vlákniny), jsou součástí metaloproteinů a jiných komplexů s bílkovinami. Důležité jsou rovněž metaloenzymy, které jsou tvořeny v těle z různých prvkových forem přijímaných potravou. Z předcházejícího přehledu možných forem prvků je patrné, že speciační analýza stopových prvků v biologických materiálech je velmi náročná. Zejména je to dáno velkou různorodostí jednotlivých vazebných možností prvků a jejich malou stabilitou. Z tohoto důvodu je nutno věnovat v těchto případech velkou pozornost výběru vhodné metodiky. Speciační analýza hraje důležitou roli také v medicíně, v lékařské diagnostice. Některé prvky jsou známy jako toxické buď akutně (Hg) nebo chronicky (Pb), zatímco jiné (Mo, Mn, Fe, Co, Cu, Zn) jsou esenciální a nutné pro správné fungování živých organizmů, některé prvky (V, Cr, Ni) jsou při nízkých koncentracích esenciální, při zvýšených toxické a hranice mezi oběma stavy není vždy jasná. U některých prvků záleží na oxidačním stavu, Cr(III) nebo Se(IV) jsou esenciální, Cr(VI) nebo Se(VI) jsou naopak toxické. Některé prvky např. Co je esenciální v organické formě jako cyanocobalamin (vitamin B12), zatímco v ostatních formách je toxický. Na druhé straně As, notoricky známý toxický prvek, je neškodný ve formě arsenobetainu. Zvláštní skupinu tvoří prvky používané jako farmaka, sloučeniny platiny a ruthenia používané při chemoterapii, sloučeniny zlata při léčbě artritidy. Široká skupina sloučenin Tc (např. Tc-mercaptoacetyl glycin komplex) je používána k diagnostice. Prvky, zvláště přechodné, se v buňkách živých organizmů nevyskytují ve formě volných iontů, ale reagují s množstvím přítomných ligandů. Metaloidy (As, Se) se kovalentně vážou s uhlíkem a tvoří velké struktury (arsenocukry, selenoproteiny). Kovy v komplexech s proteiny vázané přes dusík nebo kyslík jsou zodpovědné za aktivitu řady enzymů, zatímco ty, vázané přes síru působí jako detoxikátory těžkých kovů. Kovy aktivující enzymy, např. nikotinamid syntetázu (Fe, Ni) nebo fytochelatin syntetázu (Cd), jsou obvykle komplexovány 8
metabolity nikotinaminu nebo fytochelatinu. Poměrně málo je známo o vazbě kovů na lipidy a cukry. Výzvou v této oblasti je identifikace produktů metabolizmu léčiv a porozumění vazby farmak obsahujících vázané kovy na transportní proteiny a DNA fragmenty. Značné problémy při výběru analytické strategie v tomto případě činí komplexnost matrice vzorku, malá těkavost specií, která vyžaduje použití kapalinové chromatografie a negativně ovlivňuje separační účinnost a mez detekce. Ve většině případů chybí znalosti o studovaných speciích. Na obr. 2 jsou shrnuty prvky, které prokazatelně hrají roli v biologických systémech. Obr. 2. Stopové prvky zajímavé pro medicínu a biologii (převzato z J. Szpunar, R. Lobinski, A. Prange: Hyphenated techniques in speciation analysis, Applied Spectroscopy, 57,3, 2003)) 9
Vývoj speciační analýzy je v současné době směrován od stanovení antropogenních specií a produktů jejich environmentální degradace endogenním a biologicky syntetizovaným speciím, jak je schématicky naznačeno na obr.3. Obr. 3. Vývoj konceptu speciační analýzy (převzato z J. Szpunar, R. Lobinski, A.Prange: Hyphenated techniques in speciation analysis, Applied Spectroscopy, 57,3, 2003) Konečnými cíli vývoje speciační analýzy jsou poznání mechanizmů resorpce, transportu a metabolizmu prvků v živých organizmech a porozumění mechanizmům kontrolujícím esencialitu a toxicitu prvků v biologických systémech na molekulární úrovni. 10