MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta

MENDELOVA ZEMĚDĚLSKÁ A LESNICKÁ UNIVERZITA V BRNĚ Agronomická fakulta Ústav morfologie, fyziologie a genetiky zvířat Určování a ověřování paternity u koní. Bakalářská práce Brno 2006 Vedoucí bakalářské práce: Prof. Ing. Josef Dvořák, CSc. Vypracovala: Jana Čermáková

Souhrn Předkládaná bakalářská práce pojednává o metodách ověřování paternity u koní. Hlavním cílem práce bylo tyto metody porovnat na základě poznatků z literárních zdrojů a následně vyhodnotit jejich vhodnost pro ověřování paternity u koní. Ověřování původu koní je nezbytnou součástí plemenářského programu v chovu koní a slouží pro sestavení správného rodokmenu. Existuje více metod ověřování původu koní, využívajících různých polymorfních systémů. Nejvíce používanými metodami ověřování původu je testování krevních skupin, polymorfismu proteinů a nově také molekulárně genetické technologie, testující polymorfismus DNA. V současné době se jako velice efektivní metoda ověřování paternity u koní jeví využití DNA mikrosatelitů. Summary The bachelor thesis discusses the methods of the horse paternity verification. The main goal of the study was to compare these methods and evaluation of their suitability for a paternity verification in horses. The parentage verification is necessary for horses breeding programmes and to record the correct pedigree. There are several methods for the parentage verification in horses, used to different polymorphic systems. The most common methods of the paternity testing are blood group and protein polymorphism tests (blood typing) and a new generation of genetic technologies involving testing of DNA polymorphisms. At present, the use of DNA-microsatellites has become a very effective method for the horse paternity verification.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma Určování a ověřování paternity u koní vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Brně, dne

Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucímu bakalářské práce panu Prof. Ing. Josefu Dvořákovi, CSc. a především Ing. Monice Burócziové za pomoc a odborné vedení při zpracovávání bakalářské práce. Srdečně děkuji svojí mamince a příteli nejen za podnětné připomínky a pomoc při psaní bakalářské práce, ale hlavně za podporu v životě.

6 OBSAH 1. ÚVOD...8 2. TRADIČNÍ METODY OVĚŘOVÁNÍ PATERNITY...11 2.1. HISTORICKÝ POHLED NA OVĚŘOVÁNÍ PATERNITY...11 2.1.1. Krevní skupiny a biochemický polymorfismus proteinů...11 2.1.2. Testování lymfocytů (histokompatibilní markery)...12 2.1.3. DNA metody ověřování původu koní...12 2.2. OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU POMOCÍ KREVNÍCH SKUPIN...14 2.3. OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU POMOCÍ BIOCHEMICKÝCH POLYMORFNÍCH ZNAKŮ...17 2.4. NESPRÁVNĚ EVIDOVANÝ PŮVOD ODHALOVANÝ POMOCÍ VÝŠE UVEDENÝCH METOD OVĚŘOVÁNÍ PATERNITY...19 3. METODY GENOMIKY V OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU...20 3.1. DNA ANALÝZY POUŽÍVANÉ PRO OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU...20 3.2. GENETICKÉ MARKERY VHODNÉ PRO OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU...20 3.3. ZPŮSOBY ZÍSKÁVÁNÍ BIOLOGICKÝCH VZORKŮ PRO DNA ANALÝZY...22 3.4. PRINCIP LABORATORNÍ DETEKCE MIKROSATELITŮ...22 4. OVĚŘOVÁNÍ PATERNITY KONÍ V EU...25 5. OVĚŘOVÁNÍ PATERNITY KONÍ V ČR...26 5.1. ZÁKONNÝ PODKLAD K OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU KONÍ V ČR...26 5.2. OPRÁVNĚNÉ OSOBY K STANOVOVÁNÍ GENETICKÉHO TYPU A OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU KONÍ V ČR...27 6. VÝZNAM OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU U KONÍ...28 7. ZÁVĚR...29 8. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY...30

7 Seznam tabulek TAB.1 POLYMORFNÍ SYSTÉMY KONÍ VHODNÉ K OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU NACHÁZEJÍCÍ SE V KREVNÍM SÉRU... 18 TAB. 2 POLYMORFNÍ SYSTÉMY KONÍ VHODNÉ K OVĚŘOVÁNÍ PŮVODU NACHÁZEJÍCÍ SE V ERYTROCYTECH... 18

8 1. Úvod Proč a jak se ověřuje paternita u koní Pod pojmem ověřování paternity se rozumí ověřování otcovství. Toto označení je spíše správné u lidí, protože zde nejvíce platí přísloví, že matka je vždy jistá, ale otec nejistý. Ale u hospodářských zvířat, tedy i u koní může dojít i k záměně matky, proto se často používá pojem ověřování rodičovství nebo původu. Původ koní se ověřuje v rámci plemenářského programu pro zajištění správné evidence. Podmínkou zapsání koně do příslušné plemenné knihy je zpravidla potvrzení o ověření paternity oprávněnou osobou. Ověření původu zabraňuje chybám vyplývajícím z nesprávné evidence, např. záměny dvou zvířat, zapsání nesprávného otce, nebo matky, nebo i obou nesprávně uvedených rodičů hříběte. Povinnost vést evidenci a ověřovat původ koní pro chovatele vyplývá ze zákona č.154/2000 Sb., o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat (plemenářský zákon), ve znění zákona č. 282/2003 Sb., včetně jeho prováděcích vyhlášek - č.471/2000 Sb. (šlechtění a plemenitba) a č. 136/2004 Sb. (označování a evidence). Ověřování původu koní provádí pouze oprávněné osoby, kterým k této činnosti udělilo souhlas Ministerstvo zemědělství. Vychází z Mendelových zákonů dědičnosti u sledovaných znaků (markerů). Původ se ověřuje porovnáním genotypů otce, matky a potomka. Polovinu genů dědí potomek po matce a druhou po otci. Každý dědičný faktor vyskytující se u potomka, ale nevyskytující se u matky, musí tedy pocházet od otce. Rodičovství nelze prokázat, ale je možné vyloučit nesprávně uvedené rodiče. Pokud nejsou žádné genetické neshody mezi faktory náležejícími otci, matce a hříběti, říkáme že původ souhlasí s uvedenými rodiči. Genotypy se zjišťují různými metodami, dále popsanými v této práci.

9 Proč jsem si vybrala ověřování paternity u koní Ačkoli stavy koní v České republice v průběhu padesátých let 20. století s rozvojem zemědělské techniky značně poklesly, přesto se koně v současné době stále těší zájmu chovatelů. Místo tažných chladnokrevných koní se chovají především koně pro jezdecké a sportovní účely a jejich počty se naopak zvyšují. Cena kvalitního koně s vysokou výkonností bývá značně vysoká. Na ceně se významně podílí i původ koně, výkonnost jeho předků zapsaných v rodokmenu. Spolehlivé ověřování původu koní je neodmyslitelným požadavkem pro účinný plemenářský program, který se neobejde bez přesné evidence zvířat. V plemenitbě koní se rozvíjejí techniky umělé inseminace a embryotransferu, vzrůstá mezinárodní obchod s koňmi, stejně jako transport sportovních koní mezi zeměmi na místo konání soutěže. Proto je zde aktuální a rostoucí potřeba účinných a spolehlivých metod pro kontrolu původu a identity u koní. Cílem práce je podat výstižnou řešerži různých metod v současné době používaných pro ověřování původu u koní, na základě zjištěných informací tyto metody porovnat a vyhodnotit nejvhodnější metody pro rutinní ověřování paternity u koní. Použité termíny Alela je to jedna z různých forem genu nebo sekvence DNA. Alely se nacházejí v lokusech homologických chromozomů a ovlivňují činnost jednoho produktu (RNA nebo proteinu). Amplifikace proces, jehož výsledkem je zmnožení molekul. Fenotyp je vnější projev celého genotypu organizmu, na jehož vytváření se v menší či větší míře podílí vliv vnějšího prostředí. Gen - je základní fyzikální a funkční jednotka dědičnosti, která nese genetickou informaci z jedné generace do další (DVOŘÁK, VRTKOVÁ, 2001). Genetické markery - alely genů nebo polymorfizmy DNA používané jako experimentální sondy k zjištění informací o jedinci, tkáni, buňce, jádře, chromozomu nebo genu (DVOŘÁK, VRTKOVÁ, 2001). Genotyp - soubor genů daného jedince nebo specifičtěji konkrétní sestava alel na konkrétním lokusu nebo více lokusech.

10 Heterozygot - má dvě různé alely pro jednu konkrétní vlastnost na obou homologních chromozomech. Homozygot má dvě identické alely pro jednu konkrétní vlastnost na obou homologních chromozomech. Kodominance označení genů, kde obě alely páru jsou plně vyjádřeny v heterozygotním genotypu (DVOŘÁK, VRTKOVÁ, 2001). Lokus místo na chromozomu, kde je umístěn určitý gen. Jednotlivé alely genů se nachází na shodných lokusech v homologních chromozomech. Maternita je to mateřství. Mikrosatelity (syn. STR short tandem repeats) jsou krátké tandemové repetice DNA, vyznačují se vysokým stupněm polymorfismu., někdy se označují také jako SSR (simple sequence repeat) jednoduché sekvenční repetice nebo STRs (simple tandem repeats) jednoduché tandemové repetice. Multiplex více reakcí najednou. Parentita je to rodičovství nebo také původ. Paternita je to otcovství. Původ v souvislosti s ověřováním původu lze tento termín upřesnit jako vztah mezi rodiči a potomkem.

11 2. Tradiční metody ověřování paternity Metody ověřování původu využívají k určení genotypů rodičů a potomka různých polymorfních systémů. K praktickému využití pro ověřování původu jsou vhodné jen ty polymorfní znaky (systémy), u nichž jsou alely v kodominantním genetickém vztahu, jejich genotyp se nemění během života jedince a dají se snadno testovat bez ohrožení životních funkcí jedince (DOSTÁL, 1995). Pro rutinní ověřování původu koní se používají především metody testování krevních skupin, biochemického polymorfismu proteinů a nově také metody testování mikrosatelitních markerů a SNPs. 2.1. Historický pohled na ověřování paternity 2.1.1. Krevní skupiny a biochemický polymorfismus proteinů Donedávna se otázky určování původu řešily klasickým testováním krevních skupin, sérových bílkovin a izoenzymů, avšak v mnohých případech aplikace zmíněných typů polymorfismu neumožňovala definitivní závěry. Ve většině laboratoří provádějících tradiční ověřování původu ze vzorků krve se používá dvou rozdílných druhů testů: serologické testy, které jsou založeny na určení antigenů červených krvinek (krevně skupinové faktory) a na elektroforetických testech, které jsou založeny na stanovení genetických variant některých proteinů v krvi (proteinový polymorfismus). Už v šedesátých letech 20. století se k ověřování paternity využívaly krevní skupiny a rozvoj metod určování krevních skupin a biochemických polymorfních znaků probíhal především mezi lety 1960 a 1985. Toto testování, prováděné kvalifikovanými laboratořemi celého světa, bylo zdokonaleno k vysoké přesnosti, opakovatelnosti a cenové dostupnosti chovatelů čistokrevných koní. Testování krevních skupin a polymorfismu proteinů je při řešení otázek paternity a určení nesprávně označeného původu efektivní, ale má tři nevýhody. První, testy lze provádět pouze z čerstvé krve, což vylučuje možnost použití jiných druhů vzorků, především takových, které jsou k dispozici od již uhynulých zvířat. Druhou nevýhodou je, že obvykle odběr krve musí provádět veterinární lékař, jsou nutné speciální přepravníky a

12 mezinárodní transport vzorků je problematický. Náročnější odběr vzorků zvyšuje náklady na ověření původu. Navíc odběr krve působí na koně jako stresový faktor a u některých zvířat je použití injekční jehly opravdu problematické. Za třetí, pokud nelze vydat rozhodnutí na základě běžné analýzy krevních typů, například vyloučit jednoho ze dvou plemeníků, kteří byli připuštěni na klisnu během jedné připouštěcí sezony, nejsou k dispozici další efektivní testy pro rozšíření testování. Výhodou ověřování původu prostřednictvím krevních skupin a biochemického polymorfismu proteinů jsou relativně nízké náklady a technologicky jednoduché postupy. 2.1.2. Testování lymfocytů (histokompatibilní markery) Komplex, geneticky kontrolovaný systém tkáňových antigenů, nazvaný major histocompatibility komplex (MHC) je velmi efektivní v případě imunitního odmítnutí transplantované tkáně mezi nepříbuznými zvířaty. Výzkum lidského lymfocytního antigenu (HLA) se rozvíjel v letech 1970 a 1980 a tento systém se osvědčil jako vhodný pro porovnání tkání příjemce a kompatibilního dárce při transplantaci. Dále HLA byly využívány jako vysoce efektivní systém pro určení původu a lze je použít ke zjištění predispozice k určitému autoimunitnímu onemocnění. Vývoj testování koňských lymfocytních antigenů (ELA systému, Equine Lymphocyte Antigens) koní probíhal zejména na počátku let 1980, především pro potřeby ověřování původu a studiu chorob. Byly definovány 2 lokusy systému ELA: ELA-A a ELA-B. Tyto systémy by bylo možné využívat pro ověřování původu, ale neosvědčily se být tak vhodné jako testování krevních skupin, proteinového nebo DNA polymorfismu. 2.1.3. DNA metody ověřování původu koní V 80. letech 20. století byl vypracován soubor molekulárně genetických metod pro ověřování původu, které se využívají stále častěji a pravděpodobně nahradí původní metody testování prostřednictvím krevních skupin a biochemického polymorfismu proteinů. Výhodou molekulárně genetických metod je, že DNA vzorky pro genetickou analýzu mohou pocházet z jiných tkání než jen z čerstvé krve, jako jsou například chlupy nebo materiál z těl uhynulých zvířat, DNA lze uchovávat po dlouhou dobu a je tak možné provést i opakované analýzy, technologie DNA testování umožňuje rozšířit počet genetických markerů, neboť díky vysokému polymorfismu DNA poskytují množství

13 variant, například mikrosatelitních sekvencí či SNPs, což zvyšuje pravděpodobnost vyloučení nesprávně uvedeného původu, umožňují využít automatizace a vyhovují požadavkům pro sériové zpracování. Nevýhodou DNA metod ověřování původu jsou vyšší náklady na přístroje a chemikálie a vyšší náročnost technologií, takže provedení testu bývá dražší než při testování krevních skupin a biochemického polymorfismu proteinů. Důležitou metodou pro ověřování rodičovství u koní je v současné době využití DNA mikrosatelitů. Do budoucna je předpovídáno rozsáhlé využívání jednonukleotidových polymorfismů tzv. SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). Podstatou vzniku SNPs je změna sekvence DNA vznikající delecí, substitucí, inverzí nebo inzercí jednoho nukleotidu. Tyto záměny se vyskytují v kódujících i nekódujících částech savčího genomu s četností 1 SNP na každých 50-500 bp (HORÁK, DVOŘÁK, 2004). SNPs jsou navrhovány jako další generace markerů pro identifikaci lokusů spojených s komplexem onemocnění a které umožní unifikaci kandidátního genu představujícího základ přesného mapování k identifikaci žádaných genů (CIVÁŇOVÁ, KNOLL, 2004). Některé SNPs mohou tedy určovat predispozici k onemocnění. V důsledku vzrůstajícího významu SNPs jako molekulárně genetických markerů se stále častěji objevují nové metodiky pro jejich detekci. Metody pro detekci SNPs mají mnoho variant. Opakovanými tématy jsou jednoduchost a progresivní technologie. Většina procedur zahrnuje sekvenční PCR amplifikaci (HGVbase, 2002). Jednou z metodik pro detekci SNPs je technika microarray, která je postavena na principech hybridizace nukleových kyselin. Ty samozřejmě vycházejí ze základních pravidel komplementarity nukleotidových bází. Klasické hybridizační techniky, které byly vyvinuty v 70. letech, využívaly pružné membrány, např. nitrocelulózu nebo nylon. Charakteristickým rysem těchto materiálů je jejich poréznost, která je příčinou některých nevýhodných vlastností těchto materiálů. Technika microarray využívá pevné povrchy, které nejsou porézní, především sklo. K detekci hybridních produktů byla v minulosti využívána autoradiografie. V současné době se využívá fluorescenčních sond. Největší výhodou techniky microarray je její miniaturizace. Pevné povrchy neporézních materiálů umožňují vytvářet tzv. biochipy. Aplikována jsou velmi malá množství biologického materiálu (KREJSEK, 2004). Za nejspolehlivější metodu SNP detekce je dnes považována determinace přímé sekvence automatickým sekvenováním. Je velmi důležité, že tato metodika umožňuje stanovení heterozygotního genotypu z výsledků jedné sekvenační reakce. Jejími výhodami jsou vysoká automatizovatelnost, spolehlivost a reprodukovatelnost výsledků (CIVÁŇOVÁ, KNOLL, 2004).

14 2.2. Ověřování původu pomocí krevních skupin Tradiční metodou pro ověřování původu a identifikaci koní je testování krevních skupin. Krevní skupiny objevil Landkriner u lidí. O skupině lidí, u kterých nalezl na erytrocytech stejný antigen říkal, že mají stejnou krevní skupinu. Jednalo se o krevní skupiny A, B a 0. Později byly objeveny další krevní skupiny (např. M a N), proto byl zaveden termín: krevně skupinový systém. Pro označení krevně skupinových systémů se používají velká písmena abecedy (DVOŘÁK, PUTNOVÁ, VRTKOVÁ, 2002). Lidské krevní faktory jsou dobře známé jako dědičné rozdíly, na jejichž základě je nutné rozlišovat a třídit darovanou krev pro krevní transfuze, ale jsou také preventivně zjišťovány kvůli problému krevní inkompatibility matky a plodu Rh faktor a na jejich základě lze získat odpověď na otázky původu či identifikace osoby, podezřelé z trestního činu, z krevních skvrn na místě činu. Krevní skupiny koní jsou obdobné jako krevní skupiny u lidí, jen u hospodářských zvířat rozlišujeme větší počet krevně skupinových systémů. Testování krevně skupinových faktorů koní má stejné možnosti užití jako u lidí, ale nejdůležitější je pro ověřování původu. Krevně skupinové faktory a varianty krevních proteinů používané pro identifikaci, kontrolu původu a řešení problémů sporného mateřství nebo paternity mají následující společné charakteristiky. Jsou to kvalitativní vlastnosti s jednoduchou a přímou dědičností, což naznačuje že jsou to dominantní nebo kodominantní charakteristické vlastnosti; jsou plně vyvinuté při narození nebo krátce po něm a setrvávají nezměněné po celý život jedince; jsou řízeny pouze dědičně a nejsou ovlivňovány změnami vnějšího prostředí a jsou detekovatelné objektivními a spolehlivými testy. Základem spolehlivosti je postup při provádění testů a interpretace osobou která je plně kvalifikovaná jak vzděláním, tak zkušenostmi s použitými metodami (SANDBERG, 1996). Testy ověřování původu pomocí krevních skupin jsou založeny na principu genetického vyloučení. Nejprve se z krve matky, potomka a potenciálních otců stanoví fenotypy vybraných krevně skupinových systémů. Podle fenotypů se určí konkrétní genotypy. Z genotypů na základě znalostí přenosu genetické informace na potomstvo se určí zda původ souhlasí, či nesouhlasí s uvedenými rodiči.

15 Standardní názvosloví pro krevně skupinové faktory koní V roce 1996 bylo mezinárodně rozpoznáno celkem 34 koňských krevně skupinových faktorů. Tyto faktory náleží 7 genetickým systémům. Každý systém obsahuje od 2 do 25 uznaných alel. V některých laboratořích jsou do testu zařazeny také nové, pokusné faktory. Tyto faktory a antiséra, která je detekují, nejsou ještě mezinárodně uznána a mají provizorní označení (SANDBERG, 1996). Krevní systémy koní vhodné k ověřování původu EAD tento systém má největší heterogenitu, zahrnuje 26 známých alel a 11 antigenních faktorů EAA obsahuje 12 identifikovaných alel a 7 antigenních faktorů EAP obsahuje 8 identifikovaných alel a 4 antigenní faktory EAQ obsahuje 7 alel a 3 antigenní faktory EAC, EAK, EAU vykazují 2 alely a vždy jen 1 antigen (DVOŘÁK, PUTNOVÁ, VRTKOVÁ, 2002). Narozdíl od relativně jednoduchého lidského AB0 systému je tedy u koní uváděno 7 systémů, z nichž každý obsahuje několik specifických krevních faktorů. Díky různorodosti možných kombinací u těchto 7 systémů je typizace červených krvinek velmi informativní pro určení původu. Pro každý testovaný krevní faktor nebo antigen červených krvinek je potřeba použít specifickou reagencii nebo protilátku k detekci tohoto faktoru. Reagencie pro serologické testování krevních skupin koní Krevně skupinové reagencie (antiséra) jsou vyráběny pro každý druh (lidi, skot, koně a další) pečlivě plánovanou prací. Antiséra pro detekci koňských krevně skupinových faktorů lze získat injekcí malého množství krve od vybraného koně - dárce koni příjemci. Dárce a příjemce jsou vybráni na základě rozdílných krevních faktorů, preferován je jeden rozdílný faktor, takže je stimulována přirozená tvorba monospecifického krevně skupinového antiséra v organismu příjemce. Antisérum poskytuje činidlo, které může být potenciálně použito k testování několika tisíc koní, protože pro každý test je potřeba jen velmi malé množství a řádně uskladněné reagencie lze využívat po více let (BOWLING, 1996).

16 Serologické testy pro identifikaci krevně skupinových faktorů koní K detekci erytrocytárních antigenů (a tím i krevních skupin) krevního séra se využívají imunologické metody. Základem imunologických reakcí je specifická reakce protilátky s příslušným antigenem. Pomocí těchto testů pro detekci erytrocytárních antigenů lze identifikovat genetické rozdíly mezi jednotlivci. Ke stanovení krevních faktorů u koní se používá dvou typů serologických reakcí. Je to přímá aglutinace a hemolýza. Každý faktor je identifikován pomocí monospecifického antiséra, obsahujícího jeden soubor protilátek reagujících pouze s tímto faktorem. Taková činidla nejsou komerčně dostupná a mají být produkována plánovanou imunizací nebo příležitostně sbírány od klisen imunizovaných krví jejich vlastních plodů (SANDBERG, 1996). V analytických testech jsou červené krvinky testovaného koně zředěny v solném roztoku a smíchány s monospecifickým antisérem. Přítomnost faktoru se za přítomnosti komplementu projevuje buď shlukováním (aglutinace) nebo hemolýzou červených krvinek. Obvykle se používá králičí sérum jako zdroj komplementní enzymatické kaskády, která rozpozná červené krvinky v komplexu s protilátkami a následně dochází k rupturám buněčné membrány a uvolňování hemoglobinu, nastává tedy aglutinace nebo hemolýza červených krvinek. Nereaktivní vzorky jsou vyhodnoceny jako negativní pro daný faktor. Frekvence krevních skupin je rozdílná mezi plemeny (BOWLING, 1996).

17 2.3. Ověřování původu pomocí biochemických polymorfních znaků Dalšími tradičními metodami ověřování paternity jsou metody zjišťující polymorfismus proteinů (biochemický polymorfismus). Polymorfismus proteinů studuje Biochemická genetika. Testování proteinového polymorfismu Pro ověřování původu se testuje polymorfismus sérových proteinů a erytrocytů. Podstatou proteinového polymorfismu je záměna aminokyselin nebo vazba různých chemických postranních skupin. Proteinový polymorfismus se zjišťuje prostřednictvím elektroforézy. Elektroforéza je technika využívající elektrického proudu k separaci molekul vložených do nosného média, což je škrob, agarózový či polyakrylamidový gel. Touto technikou jsou proteinové varianty separovány podle jejich elektrické vodivosti, isoelektrických bodů a molekulární velikosti a tvaru pod vlivem elektrického proudu. Vzdálenost, na kterou protein migruje za standartních podmínek, je genetickou vlastností závisející na elektrickém náboji, velikosti a tvaru proteinů, což je vše podmíněno sekvencí jejich aminokyselin, kterou určuje pořadí nukleotidových bází v DNA. Sérové vzorky a rozpadlé červené krvinky jsou komplexní směs, z níž jsou elektroforeticky vytříděny proteiny, které lze poté vizualizovat prostřednictvím proteinspecifických barviv. Výsledné pásy representují proteinové produkty genů (BOWLING, 1996). Testuje se více různých systémů proteinových variant, poté se výsledky zkombinují a je z nich určen profil individuálního koně, který může být podle krevních typů porovnán se svým otcem a matkou. Pokud nejsou žádné neshody mezi faktory náležejícími otci, matce a hříběti, říkáme že původ souhlasí s uvedenými rodiči. ISAG rozlišuje 16 systémů proteinových variant. Tyto systémy byly vybrány jako spolehlivé pro ověřování původu. Vysoce polymorfní jsou TF (transferin) a PI (proteasový inhibitor) (BOWLING, 1996). Rozeznatelné rozdíly každého systému jsou označeny písmennými názvy užívanými mezinárodně akceptovanou nomenklaturou.

18 Tab.1 Polymorfní systémy koní vhodné k ověřování původu nacházející se v krevním séru Polymorfní systém Počet známých alel Transferin TF 15 Proteasový inhibitor PI2 25 A1B Glykoprotein A1BG 3 Albumin ALB 3 Karboxylesteráza ES 10 Vitamín D vázající protein GC 2 Tab. 2 Polymorfní systémy koní vhodné k ověřování původu nacházející se v erytrocytech Polymorfní systém Počet známých alel Hemoglobin HBA 5 Fosfoglukomutása PGM 3 Glukofosfát isomeráza GPI 5 6 fosfoglukonát dehydrogenasa PGD 3 (DVOŘÁK, PUTNOVÁ, VRTKOVÁ, 2002) Zajímavá, ale nevysvětlená otázka je, proč koně mají tolik detekovatelných genetických variant pro na železo vázaný krevní protein - transferin. Jednou možností je, že detekční metody jsou vysoce vhodné pro snadnou identifikaci genetických variant transferinu, ale nejsou tak efektivní pro identifikaci variant proteinů v dalších lokusech, jako je například albumin, který má pouze 2 nebo 3 alely (BOWLING, 1996). Vzácné varianty jsou charakteristické pro vysoce polymorfní systémy. Některé vzácné varianty uvnitř plemene mohou být následkem nezaznamenaného křížení v předchozí generaci. Další mohou být pozůstatkem po zakladatelích plemene, jejichž základní linie nebyly převládajícími přispěvateli do současné genetické výbavy daného plemene (BOWLING, 1996).

19 2.4. Nesprávně evidovaný původ odhalovaný pomocí výše uvedených metod ověřování paternity Účinnost jednotlivého systému nebo lokusu odhalit nesprávně uvedený původ závisí na počtu alel, jejich frekvenci a zda genotypy lze přímo determinovat z fenotypu. Nejefektivnější jsou lokusy mající 5 nebo více alel se značnou frekvencí a bez nulových (recesivních) alel (BOWLING, 1996). Účinnost standartních testů detekovat nesprávně uvedeného otce či matku, když ostatní rodiče jsou označeni správně je asi 97 99 %, záleží na plemeni a použitém systému testování (BOWLING, 1996). Paralelně probíhající testy 4803 rutinních případů ověření původu u Quarter Horse, využívající 15 lokusů krevních skupin a proteinového polymorfismu a 11 dinukleotidových repeticí mikrosatelitů vykázaly aktuální účinnost 97,3 % pro krevní testy a 98,2 % pro DNA testy. Nicméně v praxi ověření původu může dosáhnout vyšší spolehlivosti než udává zkušební panel. Přesto, že využívá méně lokusů, DNA testování se jeví efektivnější a přesnější, než testování krevních skupin a biochemického polymorfismu proteinů (BOWLING, et al., 1997). Canadian Arabian Horse Registry udává na svých internetových stránkách účinnost DNA testů 99,99 %, ve srovnání s 98 % pro testování krevních typů.

20 3. Metody genomiky v ověřování původu 3.1. DNA analýzy používané pro ověřování původu V současné době se pro ověřování paternity či parentity hospodářských zvířat v praxi používají metody molekulární genetiky, které v budoucnosti pravděpodobně nahradí tradiční metody ověřování původu, jako je testování krevních skupin a biochemického polymorfismu proteinů. Zjišťuje se polymorfismus DNA. Při výběru nejvýhodnější metody a genetického markeru pro určování paternity u koní jsou rozhodujícími požadavky přesnost, cena a účinnost testů detekovat nesprávně evidovaný původ. Důležitá je také rychlost získání výsledků, stanovený doporučený standard a jednoduchý přenos informací mezi laboratořemi. DNA testování původu zvířat musí zahrnovat kvality tradičního testování, jako je přesnost, efektivnost, nenákladnost, rychlost, možnost přenosu výsledků mezi laboratořemi a bude mít atraktivní budoucnost v důsledku možnosti vysoké automatizace a také díky tomu, že není limitováno na čerstvou krev. Nevýhodou všech metod testování molekulárně genetických markerů je vysoká cena, protože náklady na technické a materiální vybavení laboratoře jsou vysoké. 3.2. Genetické markery vhodné pro ověřování původu Genetický marker je vysoce polymorfní znak, který vykazuje mendelistickou kodominantní dědičnost, je snadno a jednoznačně detekovatelný. Molekulárně-genetické markery mají oproti klasickým morfologickým tyto výhody: jsou početné a relativně snadno identifikovatelné jsou vysoce informativní mohou být typovány z malého množství tkáně v libovolném věku jedince (včetně embryí nebo po smrti jedince) DNA může být dlouhodobě archivována a lze se tak k analýze opakovaně vracet i po několika letech lze zachytit nejvyšší stupeň genetické variability (na úrovni proteinů se projeví jen cca 1/3 polymorfizmů) jsou exaktně testovatelné (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002).

21 Markery můžeme rozdělit do tří základních kategorií: markery I. typu jsou to kódující sekvence DNA v genech. Mají nízkou úroveň polymorfismu, a proto jsou málo využitelné pro určování původu nebo diverzity populací. Jsou však nezbytné pro komparativní mapování genů. markery II. typu jsou vysoce variabilní mikrosatelitní sekvence, často též označované jako STRs (Short Tandem Repeats). Tyto markery jsou vysoce informativní pro studium původu, populací nebo pro využití v soudnictví. V savčím genomu je přes 100 000 nahodile roztroušených sekvencí mikrosatelitů. markery III. typu jedná se o tzv. SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Nachází se v kódujících oblastech, ale ještě častěji v intronech nebo mezigenových částech DNA. V lidském genomu se SNPs objevují každých 500 1000 bp. Při komparativním mapování genů jsou obvykle nevyužitelné, ale jsou výhodné např. pro detekci variability populací (O BRIEN et al., 1999). DNA markery, které lze pro genetické analýzy využít, zahrnují minisatelity (multilocus fingerprints), polymorfismus mitochondriálních sekvencí (mtdna), restrikční fragmenty délkového polymorfismu (restriction fragment length polymorphisms, RFLPs), biallelic systémy (single nucleotide polymorphisms, SNPs) a mikrosatelity, také označované jako short tandem repeats (STRs) nebo simple length repeats (SLRs). Pro ověřování otcovství či původu se stanovují především mikrosatelity, vyskytující se ve všech eukaryotických genomech. Minisatelitní DNA se používá zpravidla pro identifikaci jedinců v kriminalistice, soudním lékařství a ochraně vzácných zvířat. Techniky fingerprintigu jsou podrobně diskutovány ve vědeckých a populárních příspěvcích, ale nejsou uznávány pro programy testování původu pro chovatelské registry. Ačkoli fingerprinting může být aplikován při řešení individuálních případů, pro využití v živočišné výrobě vyžaduje příliš velké množství DNA, zabírá mnoho času ke zjištění a analýze výsledků, je příliš obtížné využít opakovaně získané výsledky a nelze použít výsledky ostatních laboratoří (BOWLING, 1996). RFLPs sdílí pro potřeby chovatelů podobné nevýhody jako fingerprinting, ačkoli jich lze také využít pro individuální případy a pro genetické mapování (BOWLING, 1996). Polymorfismus mitochondriální DNA je potenciální účinný nástroj pro vyloučení mateřství, ale nelze ho využít v řešení otázek paternity, protože mtdna dědí potomek pouze po matce, ne po otci.

22 Nejnovějšími molekulárně genetickými markery pro ověřování paternity jsou jednonukleotidové polymorfismy, tzv. SNPs. Určité biallelic systems jsou atraktivní, především proto, že pro detekci jejich variant není potřebná elektroforéza, ale laboratoře ověřující původ zvířat jednoznačně upřednostňují mikrosatelity protože vykazují nejlepší spektrum vlastností vhodných pro programy ověřování původu zvířat (BOWLING, 1996). 3.3. Způsoby získávání biologických vzorků pro DNA analýzy Výhodou molekulárně genetických metod pro ověřování rodičovství je možnost zjišťování polymorfismu DNA i z jiných biologických materiálů, než pouze ze vzorků čerstvě odebrané krve. Zdrojem pro DNA analýzy může být jakýkoli materiál obsahující živočišné jaderné buňky, například krev (i zmražená), chlupové cibulky, ejakulát, mléko, maso, stěry ze sliznic (nejčastěji ze sliznice dásní či pochvy), výkaly apod. Díky tomu je možné testovat zvířata v různé fázi života v době embryonálního vývoje i po smrti jedince. Volba nejvhodnějšího výchozího materiálu je ovlivněna jeho dostupností, časovou a přístrojovou náročností příslušné metodiky a požadavkem na množství a kvalitu získané DNA. Pro chovatele koní je snadný odběr vzorků chlupových cibulek. Při takovém odběru nemusí být přítomen veterinární lékař a je jednodušší transport vzorků do laboratoře než při odběru krevních vzorků. Hřívu či srst je nutné vytrhat, ne stříhat, aby chlupové cibulky zůstaly připojené, protože zbylá část chlupu neobsahuje jaderné buňky a nelze z ní tedy izolovat DNA. 3.4. Princip laboratorní detekce mikrosatelitů Mikrosatelity jsou úseky DNA tvořené krátkými tandemovými repeticemi a vyznačují se vysokým stupněm polymorfismu, který je dán množstvím opakování krátkých sekvencí, jejichž délka je obvykle 1 6 bp. Například jeden z prvních publikovaných mikrosatelitů u koní HTG6 sestává z řetězce repetic dvou DNA bází T a G. V koňském genomu je jeden z nejhojněji zastoupených repetičních motivů (TG)n motiv, který vykazuje značně velký stupeň polymorfismu. Oproti tomu frekvence (TC)n

23 repetic je vůči zmíněným (TG)n repeticím daleko nižší, i když jsou zhruba stejně polymorfní (HAMANOVÁ, 2005). Rozlišit určité mikrosatelitní jednotky v tomto množství nelze přirozeně, ani na základě charakteru motivu (ten je uniformní), ani na základě počtu repetic motivu (určitý počet se může v genomu opakovat třeba stokrát). Základní charakteristikou mikrosatelitů jsou proto jedinečné sekvence nukleotidů, přiléhající nebo vymezující mikrosatelitní sekvenci tzv. "flanking sequences". Tyto přiléhající sekvence určují jedinečnou pozici mikrosatelitů v genomu (HAMANOVÁ, 2005). Příklad mikrosatelitní repetice:...gacttagctagctacttcacacacacacacacacacacaccttatctcgacgga... V tomto příkladu mikrosatelitní vzor představuje 11 za sebou jdoucích "CA" motivů, lemovaných jedinečnou sekvencí písmen. Délka opakování je dědičná vlastnost, ale může být vysoce proměnlivá uvnitř plemene. Například systémy vybrané pro ověřování původu koní mají každý 8 až 16 délkových variant, v závislosti na plemeni (BOWLING, 1998-99). Mikrosatelity jsou velmi početné a hojně rozšířené po celém genomu jedince, především v nekódujících sekvencích DNA. Každý jedinec má dvě kopie každého mikrosatelitu, jeden zděděný po matce a druhý po otci. Biologická funkce mikrosatelitů v organismu dosud není přesně známá, ale jsou vhodné pro ověřování původu díky vysokému polymorfismu, že vykazují mendelistickou dědičnost a jsou snadno detekovatelné. Testování původu prostřednictvím mikrosatelitů je jednoduché v porovnání s tradičním testováním krevních skupin a proteinového polymorfismu, protože pro všechny systémy se používá pouze jedna technika. Polymorfismus mikrosatelitů může být rychle a spolehlivě testován pomocí PCR, PAGE a dnes zejména moderní metodou fragmentační analýzy. Proto jsou mikrosatelity vhodnými markery pro vazbové mapování genů a studium diverzity včetně určování otcovství (paternity) a rodičovství (parentity) (KNOLL, VYKOUKALOVÁ, 2002). Princip laboratorní analýzy mikrosatelitních lokusů Princip laboratorní detekce mikrosatelitů spočívá v detekci alel pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) s následnou elektroforetickou separací v DNA sekvenátoru. Při PCR je pomocí unikátních primerů amplifikována, tedy zmnožena do milionů kopií z velmi malého počátečního množství DNA, požadovaná část genomu, která je zodpovědná za sledovanou odchylku. Během amplifikačního procesu jsou do produktů

24 začleněna fluorescenční značkující barviva. Poté se produkty PCR všech amplifikovaných mikrosatelitních lokusů umístí do DNA sekvenátoru, kde probíhá elektroforetická separace fluorescenčně označených fragmentů dle jejich délkového polymorfismu. Souběžně s touto separací počítačový program (GeneScane software) shromažďuje signály, na jejichž základě stanoví velikost (bp) pro každý vzorek. Výsledkem je určení jednotlivých alel a následné stanovení genotypů v jednotlivých mikrosatelitních lokusech pro určité zvíře. Vícebarevné fluorescenční značení umožňuje naskládat do multiplexu více vzorků najednou a tím simultánní detekci délkových variant pro všechny testované mikrosatelity, i když se svou délkou překrývají. Souběžně s analýzou vzorků zpravidla běží interní standard, čímž je dosahována maximální přesnost při určování velikosti jednotlivých alel. Pro jednoduchost záznamu uchovávání a výměny dat mezi laboratořemi se alely označují velkými písmeny abecedy (dle ISAG). Alelová frekvence pro mikrosatelity se určuje přímým počítáním. Alelové frekvence poskytují kombinovanou PE hodnotu až 99.99 %. Původ se ověřuje porovnáním zjištěných genotypů otce, matky a potomka. Pokud nejsou zjištěny žádné nesrovnalosti mezi alelami náležejícími matce, otci a potomkovi, výsledek interpretovaný chovateli zní, že původ souhlasí s uvedenými rodiči. V případě že původ nesouhlasí s uvedenými rodiči, je v dokumentu ještě upřesněno zda nesouhlasí otec, matka nebo oba rodiče, případně že nelze určit, který z rodičů nesouhlasí.

25 4. Ověřování paternity koní v EU Pro ověřování paternity a původu a vzájemnou srovnatelnost výsledků různých laboratoří celého světa se mezinárodní společnost genetiky ISAG - (International Society for Animal Genetics) dohodla na mezinárodních "minimálních standardech", které udávají počet mikrosatelitních lokusů. ISAG zároveň organizuje mezinárodní srovnávací testy pro své členy. Většina laboratoří v EU provádějící ověřování paternity a původu koní využívá standardní řadu mikrosatelitů, které jsou zahrnuty v ISAG doporučeném panelu mikrosatelitů pro ověřování původu koní. Minimální doporučený panel zahrnuje 9 mikrosatelitů, k nimž mohou laboratoře přiřadit další mikrosatelity vhodné k ověřování původu. Čím větší je počet testovaných mikrosatelitů, tím vyšší je pravděpodobnost odhalení chyby z nesprávného uvedení hřebce nebo i obou rodičů. ISAG doporučený panel mikrosatelitů pro ověřování původu u koní: AHT4, AHT5, HMS6, HMS7, HTG4, VHL20; HTG10, ASB2, HMS3 Další mikrosatelity pro rutinní testování rodičovství koní jsou ASB17, ASB23, LEX33, HMS2, HTG6 AND HTG7 (ISAG, 2003).

26 5. Ověřování paternity koní v ČR 5.1. Zákonný podklad k ověřování původu koní v ČR Zákon č.154/2000 Sb. ( 12) přikazuje stanovovat genetický typ a ověřovat původ některých kategorií zvířat. Výsledek ověření původu nebo stanovení genetického typu se vyjadřuje podle 29, odstavce (2) vyhlášky č. 471/2000 Sb. Ze zákona č. 154/2000 Sb.(plemenářský zákon) Původ musí být ověřen u: všech hříbat narozených po inseminaci s výjimkou anglického plnokrevníka nebo po přenosu embryí s výjimkou anglického plnokrevníka a klusáka všech hříbat plemene anglický plnokrevník a klusák s výjimkou podle předchozího bodu. Vydávání potvrzení o původu upravuje 11 plemenářského zákona, který uvádí, že dokladem o identitě, původu, výkonnosti a hodnotě plemenných zvířat, dárců spermatu, embryí, vaječných buněk, je potvrzení o původu plemenných zvířat, které vydává na žádost chovatele příslušné uznané chovatelské sdružení na základě zápisu zvířete do plemenné knihy. Vyhláška 136/2004 Sb. stanovuje náležitosti osvědčení o ověření původu nebo stanovení genetického typu. Koně se označují: a) slovním a grafickým popisem se stanovením genetického typu, nebo b) slovním a grafickým popisem a výžehem. Plemenní koně se označují podle jednotlivých řádů plemenných knih koní. Každé hříbě koně, osla a jejich kříženců se označuje před odstavením, nejpozději však do 8 měsíců ode dne narození. U hřebců vybraných pro plemenitbu musí být stanoven genetický typ.

27 5.2. Oprávněné osoby k stanovování genetického typu a ověřování původu koní v ČR 1) ČMSCH a.s., Laboratoř imunogenetiky 252 09 Hradištko pod Medníkem www.cmsch.cz 2) Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Ústav genetiky, LAMGen Zemědělská 1, 613 00 Brno www.mendelu.cz/af/genetika 3) GENSERVICE s.r.o. Palackého 1-3, 612 42 Brno Kontaktní osoba: MVDr. Alena Hovorková

28 6. Význam ověřování původu u koní Ověřování původu je důležitou součástí plemenářské práce v chovu koní. Cílem ověření původu je jednoznačně potvrdit příbuzenské vztahy mezi zvířaty uváděné chovatelem. Rozvoj technik umělé inseminace a embryotransferu v plemenitbě koní znamená pro chovatele zákonnou povinnost ověřovat původ takto narozených hříbat. Bez ověření původu nelze tato hříbata později zapsat do příslušné plemenné knihy (PK) a tedy ani uplatnit v plemenitbě. Cena koně bez původu bude rozhodně nižší než u koně jehož rodiče jsou zapsaní v plemenné knize. Zjištěný původ koně se ověřuje u všech hříbat narozených po inseminaci nebo embryotransferu na žádost chovatele, dále namátkově na žádost majitele hřebce-otce hříběte, majitele spermatu použitého k inseminaci, majitele klisny nebo kontrolního orgánu PK a také v případě různých nesrovnalostí nebo nejasností na žádost Kontrolní komise PK. Chovatelské registry koní by mohly požadovat genetické testování pouze pro koně narozené po umělé inseminaci čerstvým nebo mraženým spermatem, nebo po embryotransferu, ale mnoho orgánů rozšiřuje své požadavky také pro přirozené páření. Řád plemenné knihy anglického plnokrevníka nepovoluje využít v plemenitbě technik umělé inseminace a embryotransferu, plemenářský zákon proto ukládá povinnost ověřovat původ všech hříbat plemene anglický plnokrevník. Na základě rodokmenu lze u hříběte odhadnout jeho budoucí výkonnost, cena hříběte s dobrým rodokmenem bývá zpravidla také vyšší. Je proto nezbytné, aby v rodokmenu byli uvedeni správní rodiče. Chyby v rodokmenu se občas vyskytují u většiny chovů. Rychlý rozvoj nových a jednodušších metod molekulární genetiky přispívá k vyšší efektivnosti ověřování původu koní.

29 7. Závěr V této práci jsem se zabývala metodami, které se v současné době používají pro ověřování paternity u koní a snažila se tyto metody porovnat z hlediska jejich vhodnosti pro analýzy původu. Ověřování původu se provádí v rámci plemenářského programu koní a jeho cílem je jednoznačně potvrdit příbuzenské vztahy uváděné chovatelem. Význam ověřování původu vzrostl s rozvojem technik umělé inseminace a embryotransferu v plemenitbě hospodářských zvířat. Ověřování původu je založeno na principu genetického vyloučení. Tradičními metodami ověřování původu u koní je testování polymorfismu krevních skupin a biochemického polymorfismu proteinů, jejichž výhodou jsou relativně nízké náklady a technologicky jednoduché postupy. Významným omezením těchto metod je, že testy lze provádět pouze z čerstvé krve. Pokrok v efektivnosti ověřování původu přináší využívání molekulárně genetických markerů. DNA testy jsou poměrně nenáročné, vysoce citlivé, vyhovují požadavkům pro sériové zpracování a mnoho kroků v průběhu testování lze automatizovat. Technologie DNA testování umožňuje rozšířit počet genetických markerů, což zvyšuje pravděpodobnost vyloučení nesprávně evidovaného původu. Navíc DNA testy nejsou vázány výhradně na čerstvou krev, analýzy lze provádět i z jiných tkání obsahujících jaderné buňky, například z chlupových cibulek. DNA lze uchovávat dlouhou dobu a je tak možné provést opakované analýzy. Na druhé straně jsou ale vysoké náklady na technické a materiální vybavení laboratoře. Pro rutinní ověřování paternity a původu koní se v současné době jeví velice vhodné testování DNA mikrosatelitů. Mikrosatelity jsou krátké tandemové repetice DNA, vyznačující se vysokým stupněm polymorfismu. Spolehlivost ověřování původu prostřednictvím mikrosatelitního panelu se blíží 99,99 %. Do budoucna se, nejen pro potřeby ověřování původu hospodářských zvířat, předpokládá rozsáhlé využití jednonukleotidových polymorfismů tzv. SNPs. Ráda bych se problematice ověřování původu koní věnovala i v budoucnu a kromě nových informací získala i praktické zkušenosti v této oblasti.

30 8. Seznam použité literatury [1] 136 Vyhláška ze dne 19. března 2004, kterou se stanoví podrobnosti označování zvířat a jejich evidence a evidence hospodářství a osob stanovených plemenářským zákonem [online]. 2000, [cit. 2005-11-20]. Dostupné z: <http://www.podnikame.cz/zakony04/index.php3?co=z2004136> [2] American Paint Horse The Association: DNA Typing and Parentage Verification. [online]. Poslední revize 13. 10. 2005, [cit. 2006-01-27]. Dostupné z: <http://www.aphaonline.com/htmlhelp/dna_typing_and_parentage_verification.htm> [3] Asociace svazů chovatelů koní: Evidence koní. [online]. [cit. 2005-03-12]. Dostupné z: <http://www.aschk.cz/evidence.php> [4] BOWLING, A. T. Historical development and application of molecular genetic tests for horse identification and parentage control. [online]. 2001, [cit. 2005-09-23]. Dostupné z: <http://www.sciencedirect.com/science?_ob=mimg&_imagekey=b6t9b-44658kj- D- 1&_cdi=5110&_user=682557&_orig=search&_coverDate=11%2F30%2F2001&_sk =999279998&view=c&wchp=dGLbVzzzSkzk&md5=0072a5df100cc72833b06fc2ddd5a637&ie=/sdarticle.pdf> [5] BOWLING, A. T. DNA Tests for Parentage Verification in Horses. [online]. 1998-99, [cit. 2005-11-03]. Dostupné z: <http://www.horsequest.com/journal/health/partest.html> [6] BOWLING, A. T, et al. Validation of microsatellite markers for routine horse parentage testing. Animal Genetics, 1997, vol. 28, no. 8, p. 247 252. Dostupné z: <http://www.blackwell-synergy.com/doi/abs/10.1111/j.1365-2052.1997.00123.x> [7] BOWLING, A. T., Horse genetics. Cambridge: The University Press, 1996. 200 s. ISBN 0-85199-101-7. [8] BURÓCZIOVÁ, M., ČERMÁKOVÁ J., DVOŘÁK, J. Využitie DNA-mikrosatelitov pri overovaní pôvodu koní. [online]. MendelNet 05 Agro. 2005, [cit. 2005-12-02]. Dostupné z: <http://www.af.mendelu.cz/mendelnet2005/articles/bioziv/burocziova.pdf>

31 [9] BURÓCZIOVÁ, M., DVOŘÁK, J. Overovanie pôvodu využitím mikrosatelitných markerov u koní. In Progres v biológii: Zborník referátov z medzinárodnej vedeckej konferencie 4. Biologické dni. Nitra: FPV UKF v Nitre, 2005. 508 s. ISBN 80-8050- 864-X. [10] Canadian Arabian Horse Registry: DNA information [online]. Poslední revize 27. 5. 2003, [cit. 2005-11-23]. Dostupné z: <http://www.cahr.ca/dna.htm> [11] CIVÁŇOVÁ K., KNOLL A. Zavedení SNAPSHOT metodiky pro detekci polymorfismů. [online]. MendelNet 04 Agro. 2004, [cit. 2005-12-03]. Dostupné z: <http://old.mendelu.cz/~agro/af/mendelnet2004/obsahy/bioziv/civanova.pdf> [12] CIVÁŇOVÁ K., PUTNOVÁ L. Hodnotenie informatívnosti mikrosatelitných markerov využívaných pri overovaní rodičovstva u hovädzieho dobytka. [online]. MendelNet 03. 2003, [cit. 2005-11-22]. Dostupné z: <http://old.mendelu.cz/~agro/af/mendelnet2004/obsahy/bioziv/civanova.pdf> [13] DOSTÁL, J.: Chov psů: Genetika v kynologické praxi. České Budějovice : Dona, 1995. 208 s. ISBN 80-85463-58-X. [14] DVOŘÁK J., PUTNOVÁ L., VRTKOVÁ I. Ověřování parentity u prasat, skotu a koní: Studijní text pouze pro studenty specializace,,genetika a šlechtění zvířat v akademickém roce 2002/2003. MZLU v Brně, Ústav genetiky, 2002. [15] DVOŘÁK J., VRTKOVÁ I. Varianty odběrů vzorků pro DNA testy u koní. LAMGen VII, Ústav genetiky MZLU v Brně, 2004. [16] DVOŘÁK J., VRTKOVÁ I. Určování genetického typu a parentita u koní. LAMGen VII, Ústav genetiky MZLU v Brně, 2003. [17] DVOŘÁK J., VRTKOVÁ I. Malá genetika prasat II. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2001. 91 s. ISBN 80-7157-521-6. [18] DVOŘÁK J., VRTKOVÁ I. Metody používané v LAMGenu. LAMGen VII, Ústav genetiky MZLU v Brně, 2001. [19] HAMANOVÁ, K. Polymorfismus DNA se zaměřením na mikrosatelity u koní (zkrácený obsah disertační práce podklad pro seminář určený pro chovatelskou veřejnost). [online]. Poslední revize 19. 6. 2005, [cit. 2005-11-20]. Dostupné z: <http://www.hucul.net/knihy/hucul_rk.htm> [20] HORÁK P., DVOŘÁK J. Hodnocení variability vybraných SNPs s ohledem na jejich využití pro testy parentity u psů. MendelNet 04 Agro. 2004, [cit. 2005-12-03]. Dostupné z: <http://old.mendelu.cz/~agro/af/mendelnet2004/obsahy/bioziv/horak.pdf>

32 [21] HORÁK P. Jednonukleotidové polymorfismy DNA u psů a jejich využití v chovatelské praxi. [online]. MendelNet 03. 2003, [cit. 2005-11-22]. Dostupné z: <http://www.af.mendelu.cz/mendelnet2003/obsahy/zoo/horak.pdf> [22] Human Genome Variation Database (HGVbase): SNPs : What they are and what they might they tell us. [online]. Poslední revize 13. 9. 2002, [cit. 2006-04-12]. Dostupné z: <http://hgvbase.cgb.ki.se/snpinfo.htm> [23] CHROMÝ V. Metodický doplněk k publikaci: Analytický význam nukleových kyselin a vybrané separační metody pro stanovení biomolekul. [online]. 2006, [cit. 2006-04-06]. Dostupné z: <https://www.zdravcentra.cz/cps/rde/xchg/zc/xsl/3141_1508.html> [24] ISAG: Recommended ISAG panels of markers for parentage verification. [online]. 2003, [cit. 2006-01-10]. Dostupné z: <http://www.isag.org.uk/journal/comparisonguide.asp> [25] KNOLL A., VYKOUKALOVÁ Z. Molekulární genetika zvířat: Metody detekce polymorfismů DNA genů. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2002. 100 s. ISBN 80-7157-616-6. [26] KOMOSNÝ M., URBAN T. Využití DNA mikrosatelitů používaných v panelu na určování rodičovství pro zhodnocení diverzity a distancí mezi plemeny prasat v ČR. [online]. MendelNet 05 Agro. 2005, [cit. 2005-12-02]. Dostupné z: <http://www.af.mendelu.cz/mendelnet2005/articles/bioziv/komosny.pdf> [27] KRAIC, J. Možná úloha nekódujúcich sekvencií v regulácii expresie génov. In Progres v biológii: Zborník referátov z medzinárodnej vedeckej konferencie 4. Biologické dni. Nitra: FPV UKF v Nitre, 2005. 508 s. ISBN 80-8050-864-X. [28] KREJSEK, J. Komentář k technice microarray. [online]. Poslední revize 3. 2. 2004, [cit. 2005-11-06]. Dostupné z: <http://www.tigis.cz/alergie/aler403/14.htm> [29] MURRAY, J. D. Horse genomics and reproduction. 2002. [cit. 2006-04-16]. Dostupné z: <http://66.249.93.104/search?q=cache:d4uklg64nesj:www.behav.org/00library/art icles/jc_2006/cikk_horse_genomics.pdf+++++++++++++horse+genomics+and+repr oduction+murray++++++++++++&hl=cs&ct=clnk&cd=1&client=firefox-a> [30] O BRIEN, S. J., et al. The Promise of Komparative Genomics in Mammals. Science. 1999, vol. 286, p. 458 481.

33 [31] Portál veřejné správy České republiky: Zákon č. 154/2000 Sb. o šlechtění, plemenitbě a evidenci hospodářských zvířat. [online]. 2003-2006, [cit. 2005-11-07]. Dostupné z: <http://portal.gov.cz/wps/portal/_s.155/701?number1=154&number2=&name=plem en%c3%a1%c5%99sk%c3%bd+z%c3%a1kon&text> [32] Portál veřejné správy České republiky: Zákon č. 282/2003 Sb. změna plemenářského zákona. [online]. 2003-2006, [cit. 2006-04-06]. Dostupné z: <http://portal.gov.cz/wps/portal/_s.155/701/.cmd/ad/.c/313/.ce/10821/.p/8411?pc_8 411_p=I&PC_8411_l=282/2003&PC_8411_ps=10#10821> [33] PŘIBÁŇOVÁ M. Českomoravská společnost chovatelů, a.s.: Archiv zpráv: 15. 6. 2005 Pár slov o našich testech. [online]. Poslední revize 6. 4. 2006, [cit. 2006-03-16]. Dostupné z: <http://www.cmsch.cz/cz/archiv.php?novinka_id=174> [34] Řád plemenné knihy plemene slovenský teplokrevník chovaný v České Republice. [online]. Poslední revize 6. 4. 2003.[cit. 2006-03-17]. Dostupné z: <http://www.studbookcs.cz/rpk.htm> [35] SANDBERG K. Quidelines for the interpretation of blood typing tests in horses. [online]. 1996, [cit. 2005-11-22]. Dostupné z: <http://www.isag.org.uk/isag/all/horseblood_typing.pdf> [36] SUN-YOUNG L., GIL-JAE CH. Parentage testing of Thoroughbred horse in Korea using microsatellite DNA typing. [online]. 2006. [cit. 2006-04-09]. Dostupné z: <http://www.vetsci.org/2006/pdf/63.pdf> [37] SVOBODOVÁ K. Analýza variability vybraných genetických markerů genomu psa. Brno: Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně, 2005. Vedoucí diplomové práce Prof. Ing. Josef Dvořák, CSc. [38] TOZAKI T., et al. Population Study and Validation of Paternity Testing for Thoroughbred Horses by 15 Microsatellite Loci. J. Vet. Med. Sci. 63(11): 1191 1197, 2001.