Genotoxicita - úvod Genotoxicita: toxická látka ovlivňuje genetický materiál buňky (nukleové kyseliny) Při působení vyšších koncentrací genotoxických látek dochází k přímému úhynu buněk Nižší koncentrace způsobují poškození genetické informace Důsledkem nemusí být smrt buňky či organismu, ale neletální genetické změny, jež jsou trvalého charakteru Následně vznikají defektní buňky či mutanty organismů Genotoxicita Mgr. Klára A. Mocová, Ph.D. Ústav chemie ochrany prostředí VŠCHT Praha 1 2 Mutageneneze: základní terminologie Genotoxicita - rozdělení Mutageneze vznik chyby na DNA mutagen (chemická látka / záření) Karcinogeneze nádorové bujení nekontrolované množení buněk (předchází chyby na DNA anebo napadení virem) (proces) mutace (trvalá = dědičná změna v DNA) Teratogeneze vznik vady na vyvíjejícím se plodu (mechanismus nejasný, předpoklad chyby na DNA) Dělení mutací: genové, chromozomální, genomové 3 4 1
Rekombinace, segregace - nástroje genetické variability Meióza: rekombinace, segregace - nástroje genetické variability 5 Nejvýznamnější genotoxiny Mutageny 1) Fyzikální různé typy záření (UV, paprsky X ) 2) Chemické látky alkylující, silně oxidující, deaminující, analogy dusíkatých bází ) Mechanismus účinku mutagenů: Tvorba nestandardních chemických vazeb polymerace DNA podle matrice 6 znemožnění Nestandardní párování nukleotidů, změna nukleotidů v DNA sekvenci změna AMK sekvence proteinu Fragmentace DNA ztráta nebo přestavba částí chromosomů, změna intenzity proteosyntézy 7 alkylsulfáty N-nitrososloučeniny a halogennitrososloučeniny estery kyseliny metansulfonové yperit (sirný, dusíkatý) aldehydy epoxidy halogenderiváty alifatických uhlovodíků polycyklické aromatické uhlovodíky substituované polycyklické aromatické uhlovodíky aromatické a heterocyklické primární, sekundární a terciální aminy azobarviva akridinová barviva 8 2
Struktura DNA Genetický kód Kodón (triplet) = trojice sousedních nukleotidů Genetický kód je tripletový = 1 triplet nukleotidů kóduje Komplementační pravidla: 1 aminokyselinu Adenin Thymin (AT páry) Guanin Cytosin (GC páry) 3 stop kodóny 9 Adenin Uracyl (na RNA) 10 Translace = překlad z RNA do proteinu I. Mutace genové (bodové) 1) Záměnové a) samesense beze změny AMK sekvence b) missense vznik kodónu pro jinou AMK c) nonsense vznik stop kodónu 2) Posunové delece či inzerce NT (počet není násobkem 3 NT) Výsledkem je změna celého úseku genu od místa bodové mutace Často vznik stop kodónu uvnitř posunuté sekvence 11 Vysvětlivky: AMK aminokyselina, NT nukleotid 12 3
I. Genové mutace Tautomerismus bází Divoká alela (původní forma genu) M D D Q S M R L Q T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg cag act ctg gcc ggg gtg aac ctg... Deaminací Cytosinu vzniká Uracyl Neutrální mutace (3. báze) M D D Q S M R L Q T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg caa act ctg gcc ggg gtg aac ctg... Missense mutace M D D Q S M R L K T L A G V L N atg gac gat caa tcc agg atg ctg aag act ctg gcc ggg gtg aac ctg... Nonsense mutace M D D Q S M R L stop atg gac gat caa tcc agg atg ctg tag act ctg gcc ggg gtg aac ctg... Posun čtecího rámce vedoucí k předčasné terminace proteosyntézy M D D Q S M R L R L W P G stop atg gac gat caa tcc agg atg ctg aga ctc tgg ccg ggg tga acc tg... Analogy dusíkatých bází: 5BrU = 5-bromuridin -keto 2H-vazby s Adeninem -enol 3H-vazby s Guaninem 2AP = 2-aminopurin -amino 2H-vazby s Thyminem -imino 3H-vazby s Cytosinem 13 Stavba eukaryotického chromosomu 14 II. Chromosomální aberace = strukturní změny chromosomů Delece ztráta úseku chromosomu Inzerce vložení úseku chromosomu Duplikace zdvojení úseku chromosomu Inverze převrácení úseku chromosomu Translokace přesun úseku chromosomu na nehomologní chromosom a) prostá přesun pouze z jednoho na jiný chromosom b) reciproká vzájemná výměna mezi dvěma chromosomy ; zvl. případ je Robertsonova translokace (=centrická fúze dvou akrocentrických chromosomů) 15 16 4
II. Chromosomální aberace Klastogeneze, Klastogeny Klastogeny látky způsobující zlomy na chromosomech (klastogenezi) Klastogeny chemické analogy bází (bromuracil) látky interkalační (akridin oranž), látky deaminující báze (HNO2) Fyzikální (UV, X-paprsky ) delece inverze akridin oranž bromuracil translokace Cytogenetické vyšetření pacienta: šipkou vyznačeny některé aberace 17 18 III. Genomové mutace početní změny chromosomů III. Genomové mutace Ploidie počet chromosomových sad 1) Euploidie změna počtu celých chromosomových sad: haploidie (1), diploidie (2), triploidie (3), tetraploidie (4) atd. 2) Aneuploidie změna počtu jednotlivých chromosomů: nulisomie (0), monosomie (1) disomie (2, oba chromosomy však pocházejí od stejného rodiče = chyba!!!) trisomie (3), tetrasomie (4) atd. 19 Downův syndrom Triploidie u člověka 47,XY+21 69,XXY 20 5
III. Genomové mutace Shrnutí klasifikace mutací Způsobeny nondisjunkcí (chybou) chromosomů při jaderném dělení Příklady mutagenů: - kolchicin, oryzalin (vznik polyploidie), užívají se záměrně při šlechtění a při mikroskopickém pozorování chromosomů - koffein u rostlin brání vzniku buněčné stěny při dělení buněk - uvedené látky působí na genetický materiál nepřímo vazbou na cytoskeletární struktury (vlákna buněčné kostry ), které mají funkci při dělení buňky (DNA i dalšího materiálu) 1) Mutace genové (bodové) mění kvalitu genu a potažmo proteinu 2) Mutace chromosomální (chromosomální aberace) přestavby chromosomů způsobují změnu genové exprese (intenzitu syntézy proteinů), v některých případech ztrátu či změnu genů 3) Mutace genomové způsobují disbalanci genových produktů (proteinů), potíže s reprodukcí, sterilitu, smrt - u člověka jsou zpravidla letální (triploidie a tetraploidie v potratech), některé aneuploidie jsou životaschopné Down, Turner 21 - pro rostliny zpravidla nejsou genomové mutace letální, některé plodiny jsou šlechtěny na polyploidii (např. gigantické kedlubny, ovocné stromy, obiloviny) 22 Mutace přítel nebo nepřítel? Mutageneze a reparace DNA - Neustále dochází ke změnám na DNA - K opravě vzniklých chyb slouží různé reparační systémy - Pokud rychlost mutageneze (genové mutace) přesáhne kapacitu reparačních systémů, mutace se zakonzervují - Mutace v genech odpovědných za reparaci těžké postižení - Např. onemocnění Xeroderma pigmentosum postižení postrádají funkční opravný systém vůči následkům UV záření, silně pigmentovaná kůže (pihy), nemocní se nesmí vystavovat slunečnímu záření 23 Nepřítel: mutace způsobují méně či více závažné poškození organismu, znemožňují reprodukci, smrt organismu Přítel: mocný nástroj evoluce v důsledku genových duplikací vznik genových rodin, vznik nových genů (alel), které se uplatnily v nových přírodních podmínkách, vznik nových biologických druhů Závěr: Postiženému jedinci mutace zpravidla mnoho radosti nepřinese, avšak z pohledu velkého časového měřítka pomáhá biologickým druhům v boji o přežití Výhodné pro mikroorganismy s krátkou generační dobou soutěž kdo s koho parazit pomocí mutací bojuje proti vývoji imunitních reakcí hostitele (tedy odolností) 24 6
Malárie a srpkovitá anemie Testy genotoxicity: Amesův test Testovací organismus: bakterie Salmonella typhimurium Kmen bakterie vyžadující přítomnost určité látky v mediu (aminokyselina) = auxotrofní; zde konkrétně vyžaduje histidin + Živné medium tuto látku neobsahuje Naočkování bakterií, přidání testované chemikálie Normální červené krvinky Výsledky: malárie Plasmodium Srpkovitá anemie Bakterie nerostou chemikálie nezpůsobuje genové mutace Heterozygoti pro srpkovitou anemii (60% normálního Hb + 40% HbS) jsou vůči malárii odolní Bakterie rostou látka je mutagenní, ač je bakterie závislá na přísunu urč. látky (AMK), která není v mediu přítomna, je schopna života = PROBĚHLA MUTACE, díky níž se objevila schopnost bakterie syntetizovat potřebnou AMK 25 Amesův test Ames-test hodnotí reverzní mutace 26 Muta-chromoPlate test Obdoba Amesova testu uzpůsobená pro mikrotitrační destičky Slouží ke stanovení mutagenních účinků látek přítomných v kapalných, pevných i plynných vzorcích. Testovací organismus: Salmonella typhimurium Žlutá - mutagenní 27 Červená - negativní 28 7
SOS chromotest Waxy mutační test na kukuřici speciální kmen bakterie Detekce genové mutace Waxy gen podmiňuje přítomnost amylózy v pylových zrnech kukuřice, ječmene a rýže Dominantní forma (Wx) amylopektin + amylóza; při reakci s jódem modré zbarvení (normální škrob) Recesivní forma (wx) pouze amylopektin; při reakci s jódem červené zbarvení pyl. zrna ( waxy škrob) Zea mays waxy test sleduje v pylových zrnech kukuřice pomocí jodidové zkoušky frekvenci zpětných mutací z wx na Wx Využití sporadické časově náročné (je třeba získat pyl z kvetoucích rostlin) Escherichia coli genotoxický vzorek způsobuje změnu zbarvení možnost použití automatických čtecích spektrofotometrů srovnatelné s Amesovým testem Další obdoby Amesova testu: - Arabinózový test - Ampicilínový test 29 30 Test somatické mozaiky na sóje Waxy kukuřice (Vosková kukuřice) Sleduje změnu barvy skvrnitých listů kódovanou genem Y11 Dominantní homozygoti Y11Y11 - tmavě zelené listy (vlivem mutací se na nich mohou tvořit světlé nebo velmi tmavé skvrny) Heterozygoti Y11y11 světle zelené listy (vlivem mutací: tmavě zelené, žluté nebo dvojité skvrny; dvojitou skvrnou se myslí vznik žluté a tmavě zelené skvrny v těsné blízkosti) Recesivní homozygoti y11y11 - žluté listy (mutace způsobují světle zelené skvrny) Indukce barevně kontrastních skvrn u homozygotů způsobena bodovými mutacemi v genu Y11; u heterozygotů i díky somatickému crossing-overu nebo chromozomálním aberacím Test se provádí na semenech / semenáčcích, trvá 4-5 týdnů, hodnotí se počet a typ skvrn na listech 31 32 8
Mikrojaderné testy na rostlinách Somatický crossing-over Micronucleus = mikrojádro Probíhá při meióze při tvorbě pohlavních buněk K somatickému crossing-overu dochází v ostatních tělních buňkách ale je to chyba Semena bobu (Vicia faba), nebo cibule (Allium cepa) se nechají vyklíčit v roztoku s testovanou chemikálií (výluh půdy apod.). Test se provádí také na pylových zrnech tradeskancie (Tradescantia). Testu předchází test inhibice elongace kořene Příprava mikroskopických preparátů z kořenové špičky Mikroskopické pozorování buněčných jader Mikrojádro = fragmenty chromosomů, obalené jaderným obalem (membránou) Přítomnost mikrojader chemikálie mutagenní Nepřítomnost mikrojader nelze tvrdit, že vzorek není mutagenní; mikrojaderný test nehodnotí např. genové mutace ani všechny chromosomální aberace 33 Mikrojaderný test 34 Teratogeneze Vznik poškození u plodu (malformace = znetvořené orgány, vrozené vývojové vady) Př. malformace polydaktylie (mnoho prstů), rozštěp rtu Faktory způsobující malformace = teratogeny Teratogeny chemické (rozpouštědla, léky...), fyzikální (RTG záření, vysoká teplota u člověka) i biologické (choroby viry, toxoplasmosa) Potencionálními teratogeny mohou být i mutagenní látky (např. těžké kovy) 35 36 9
Test teratogenity FETAX Test FETAX Drápatka vodní Xenopus laevis Test probíhá na vajíčkách a v raných embryonálních stádiích. Sledované znaky: úhyn, malformace Testovací organismus: drápatka vodní, Xenopus laevis Velikost: samice až 13 cm, samci 7-8 cm Počet embryí v jedné misce: 25 Sledovaná odezva: úhyn, malformace Opakování: 2 Objem testované koncentrace: 10 ml Teplota: 24±2 C Doba expozice: 96 hodin Osvětlení: světelný cyklus 16 h / 8 h (světlo / tma) Pomůcky a zařízení: binokulární lupa zvětšující 30krát, inkubátor 37 38 Index teratogenity Genotoxické účinky vyvolávají látky i ve velmi nízkých koncentracích. Index teratogenity (TI) U f (c t ) n U... účinek látky c... koncentrace látky t... doba působení látky exponent n... klasické jedy: 0-1 UV záření: cca 2 genotoxické látky: >5 U genotoxických látek účinek závislý především na délce expozice, zatímco u ostatních látek záleží hlavně na koncentraci Lze těžko hovořit o neškodné koncentraci genotoxické látky 39 TI LC 50 TC 50 LC50 letální koncentrace TC50 teratogenní koncentrace Hodnota LC50 se získá z měření úhynu embryí, TC50 z hodnocení malformací Čím je index teratogenity vyšší, tím vyšší představuje látka riziko, že bude mít v životním prostředí teratogenní účinky Předpokládá se, že látky s TI < 1,5 nepředstavují z hlediska teratogeneze závažné riziko 40 10