Vybrané parametry neurodegenerace u animálních modelů i lidí Psychiatrické centrum Praha RNDr. Jan Říčný MUDr. Aleš Bartoš MUDr. Anna Kubešová Mgr. Michala Kolářová Mgr. Lenka Hromádková
MUDr. Anna Kubešová
Rozsah neurodegenerace způsobené intrahipokampální aplikací NMDA nebo hypoxickoischemickým poškozením mozku Role neuroaktivních steroidů při prevenci poškození
Stanovení rozsahu degenerace Histochemické barvení fluorescenčními barvami Fluoro-Jade B v kombinaci s Hoechst 33258 Imunochemická analýza aktivace mikroglie protilátkou anti-cd11b Měření objemu hipokampu Stanovení BDNF
Histochemické zpracování mozků Mozky nakrájeny na kryostatu na tloušťku řezu 40μm. Každý řez od rostrálního začátku mozku do konce hipokampu uchován ve 24-jamkové destičce v kryoprotektivním roztoku. Řezy skladovány při teplotě -40ºC.
Každý 6. řez od rostrálního začátku mozku po konec hipokampu natažen v PBS na želatinovaná sklíčka a přes noc sušen při 37 ºC, následně obarven v 0,001% Fluoro-Jade B v 0,1% kyselině octové a pak v 0,001% Hoechst 33254. Preparáty po obarvení opláchnuty v destilované vodě, přes noc usušeny a pak odvodněny v Neo-Clearu (Merck) a překryty krycími sklíčky.
Řezy po nabarvení hodnoceny pomocí mikroskopu Zeiss Axio Imager Z1. Rozsah hipokampální léze analyzován v následujících oblastech: gyrus dentatus, CA1-2 a CA3. Závažnost poškození vyjádřena jako procento hodnocené hipokampální oblasti obsazené Fluoro-Jade B pozitivními buňkami. Pro porovnání rozsahu poškození hipokampu mezi jednotlivými skupinami použita škála 1-4 (v rozsahu 0-75%) podle Tsenova et al., 2003.
Aktivace mikroglie Pro stanovení výskytu aktivované mikroglie vyvolaného intrahipokampální aplikací NMDA barvení řezů imunohistochemicky protilátkou anti-cd11b.
Řezy (každý 12.) inkubovány v 1% H 2 O 2, poté blokovány v 10% goat sérum s 0,2% Triton X v PBS, inkubovány s primární protilátkou (anti- CD11b, AbD Serotec) inkubovány s biotinylovanou sekundární protilátkou (Goat anti-mouse IgG, Jackson Immuno Research) a nakonec s avidin-biotin peroxidázovým komplexem (Vectastain ABC Elite Kit). Po obarvení diaminobenzidinem nataženy na želatinovaná sklíčka, odvodněny v Neo-Clearu (Merck) a překryty krycími sklíčky.
Měření objemu hipokampu 13 řezů z každého hodnoceného mozku - každý 6.řez od objevení obou molekulárních vrstev gyrus dentatus, tj. cca 2,3 mm dorsálně od bregmy obarveno toluidinovou modří Objemy hipokampů měřeny pomocí softwaru Stereo Investigator (MBF Bioscience). Vkaždém řezu měřen průměrný objem gyrus dentatus, CA1-3 a celého hipokampu z obou hemisfér.
Stanovení BDNF Preparace prefrontálního kortexu a hipokampu Homogenizace tkáně, extrakce extrakčním pufrem, centrifugace Stanovení koncentrace BDNF ELISA kitem
Mgr. Michala Kolářová Mgr. Lenka Hromádková
Tauprotein andad Tau protein stabilizuje mikrotubulovou síť v axonech a přispívá k správné funkci neuronů Patologický tau protein (modifikovaný hyperfosforylací, zkrácením, oligomerizací...) se odděluje od mikrotubulů a agreguje do NFT => dochází k narušení funkce neuronů až jejich zániku Oddělený tau protein může procházet do MMM, kde dochází k dalším modifikacím
Příprava tau proteinu V bakteriích E. coli s transformovanou c-dna kódující lidský tau protein Extrakce z bakterií sonikací Purifikace: afinitní chromatografie;iontová chromatografie; gelová chromatografie Máme k dispozici c-dna pro "full-lenght" a 2 zkrácené formy
Varianty tau proteinu Tau se vyskytuje v mozku lidí s AD v různých formách: Zkrácené Nadměrně fosforylované Oligomerizované, agregované K dispozici máme c-dna pro 2 zkrácené formy tau. Hyperfosforylované a oligomerizované formy tau se dají připravit "in vitro"; navázána spolupráce s Univerzitou v Pardubicích (Mgr. Lenka Procházková) pro jejich přípravu (s použitím imobilizovaných enzymů na magnetických mikročásticích).
Aplikace (animální modely) Imunizace králíků suspenzí tau proteinu Imunopurifikace polyklonálních králičích protilátek pro stanovení tau v mozko-míšním moku Aplikace různých forem tau potkanům - simulace AD Měření kognitivních funkcí, změn exprese a aktivity machr, nachr, AChE, ChAT
Aplikace (biochemický marker) Pacienti s AN zvýšené hladiny tau v MMM Přítomnost modifikovaných forem tau u pacientů s AN/zdravých subjektů??? Výskyt specifických protilátek v séru proti tau proteinu u pacientů s AN???
Doc. MUDr. Aleš Bartoš, PhD
Spolupráce s AD centrem PCP, FNKV a 3LF UK Databáze cca 400 seniorů Repozitorium MMM a krevního séra
Databáze pacientů AD centra Cca 400 seniorů,různá neuropatologie nebo zdraví, z toho cca 20% s diagnózou AD Psychologická vyšetření (celková kognitivní výkonnost, paměťové schopnosti, řečové schopnosti a další symbolické funkce, vizuospaciální funkce, exekutivní funkce Zobrazovací metody (SPECT, EEG, MR) Biochemická vyšetření MMM (amyloid, tau, fosfo-tau) Post-mortem pitevní nálezy
Imunochemická vyšetření (auto)protilátek Zvýšený rozpad nervových buněk u AD vede ke změnám v koncentraci některých proteinů možná autoimunitní odpověď tau protein lehké řetězce neurofilamentů těžké řetězce neurofilamentů amyloid
Intrathekální syntéza IgG