BÍLKOVINY Důvody pro analýzu bílkovin v potravinách posuzování nutriční hodnoty celkový obsah bílkovin aminokyselinové složení bílkoviny, volné aminokyseliny obsah cizorodých nebo neplnohodnotných bílkovin travitelnost bílkovin kontrola dodržování receptury celkový obsah bílkovin přítomnost cizorodých bílkovin určování původu suroviny, autenticita výrobku aminokyselinové složení stanovení jednotlivých frakcí bílkovin Některé pojmy Hrubý obsah bílkovin Čistý obsah bílkovin Obsah travitelných bílkovin 1
METODY ZALOŽENÉ NA STANOVENÍ DUSÍKU Obsah dusíku v bílkovinách je průměrně 16 %. Stanovíme-li ve vzorku potraviny dusík a násobíme výsledek faktorem 6,25 (=100/16), získáme hrubý obsah bílkovin. Přepočítávací faktor závisí na druhu bílkoviny (je dán AK složením). Faktory bílkovina / dusík pro různé potraviny: Potravina Faktor Potravina Faktor Pšenice Ořechy celozrnná mouka 5,83 para ořechy, arašídy 5,41 ostatní mouky, těstoviny 5,70 mandle 5,18 otruby 6,31 ostatní ořechy 5,30 Rýže 5,95 Mléko a mléčné výrobky 6,38 Ječmen, oves, žito 5,83 Želatina a kolagen 5,55 Sója 5,71 Ostatní potraviny 6,25 Stanovení dusíku a hrubé bílkoviny Kjeldahlovou metodou Význam: univerzální, mezinárodně akceptovaná metoda Podstata: mineralizace vzorku kys. sírovou konverze organických sloučenin dusíku na (NH 4 ) 2 SO 4 provedení: záhřev s konc. H 2 SO 4 za přít. katalyzátoru (elementární selen, Se+K 2 SO 4, HgO, bezvodý CuSO 4, K 2 SO 4 +CuSO 4, TiO 2 + CuSO 4 ) v Kjeldahlově baňce nebo zkumavce postupný ohřev, max. teploty 340-390 C (t.v. H 2 SO 4 338 C) doba běžně 20-60 min, úplný rozklad Lys, Trp, Tyr až po dalších 30-40 min po vyčiření (dusík obsažený v derivátech pyridinu, chinolinu, triazolu, nelze stanovit, NO 3 -, NO 2 - nitosloučeniny, nitrososloučeniny, až po redukci) 2
uvolnění amoniaku z mineralizátu zalkalizováním a jeho oddělení destilací s vodní párou: H 2 SO 4 + NaOH Na 2 SO 4 + 2H 2 O (NH 4 ) 2 SO 4 + 2 NaOH 2 NH 3 + Na 2 SO 4 + 2 H 2 O Destilační přístroj podle Parnase a Wagnera titrační stanovení amoniaku: a) při destilaci se jímá amoniak do předlohy s odměrným roztokem H 2 SO 4, nadbytek kyseliny se stanoví titrací hydroxidem: 2 NH 3 + H 2 SO 4 (NH 4 ) 2 SO 4 H 2 SO 4 + 2NaOH Na 2 SO 4 + 2 H 2 O Tashirův indikátor (methylčerveň + methylenová modř) b) amoniak se jímá do předlohy s nadbytkem kyseliny borité, vzniklý boritan amonný se titruje kyselinou (WINKLER) 3NH 3 + H 3 BO 3 (NH 4 ) 3 BO 3 (NH 4 ) 3 BO 3 + 3 HCl 3 NH 4 Cl + H 3 BO 3 Tashirův indikátor 3
Výpočet obsahu dusíku a bílkoviny: ad a) n(nh 3 ) = 2. [c(h 2 SO 4 ).V(H 2 SO 4 ) 0,5. c(naoh).v(naoh)] mmol m(n) = 14. n(nh 3 ) mg m(bílkovina) = 6,25. m(n) ad b) n(nh 3 ) = n(hcl) = c(hcl).v(hcl) mmol Spektrofotometrické stanovení dusíku s Nesslerovým činidlem amonné ionty obsažené v mineralizátu tvoří s Nesslerovým činidlem (K 2 HgI 4 + NaOH) žlutě až hnědě zbarvený produkt o složení [Hg 2 I 3 NH 2 ] n. Absorbance při 450 nm je úměrná obsahu NH 4 +. Kalibrace v rozsahu 20-60 µg dusíku (jako (NH 4 ) 2 SO 4 ). Stanovení čistého obsahu bílkovin bílkoviny se předem isolují srážením trichloroctovou kyselinou (nebo taninem nebo hydroxidem měďnatým), ve sraženině se stanoví dusík podle Kjeldahla a přepočte se na obsah bílkoviny Stanovení travitelných bílkovin vzorek se inkubuje s příslušným enzymem (pepsin kyselé prostředí, trypsin alkalické prostředí) při 37 C (24-48 hod); v nerozpustném zbytku se stanoví bílkoviny, výsledek se odečte od celkového obsahu a získá se obsah travitelných bílkovin 4
SPEKTROMETRICKÉ METODY STANOVENÍ BÍLKOVIN UV/VIS, MIR: stanovení v roztocích NIR: stanovení i v tuhých vzorcích bez úpravy Stanovení bílkovin ultrafialovou spektrofotometrií a) absorpce vyvolaná aromatickými aminokyselinami (Tyr, Trp, Phe) při 280 nm vliv interferentů (nukleové kyseliny ) se koriguje měřením při 260 nm (nutný alespoň 5 násobný přebytek bílkovin vůči nukleovým kyselinám) přibližný výpočet: c bílk = (1,45. A 280 0,74. A 260 )/b [mg/ml] b je délka absorpční dráhy (tloušťka kyvety) v cm absorbance je ovlivněna aminokyselinovým složením bílkoviny a hodnotou ph roztoku Absorptivity některých živočišných bílkovin při 280 nm Bílkovina (původ) myosin (sval prasete) β-laktoglubulin (kravské mléko) laktoferrin (kravské mléko) ovomukoid (vaječný bílek) lysozym (vaječný bílek) ε 280 a 280 Mol.hmotnost (l.mol -1.cm -1 ) (l.g -1.cm -1 ) (g.mol -1 ) 32,2.10 4 0,685 470 000 (1,6-1,9).10 4 0,90-1,04 (ph 2,6) 18 000 10,9.10 4 1,27 86 000 3,9.10 4 0,51 76 000 3,8.10 4 2,64 14 300 5
b) absorpce peptidových vazeb v intervalu 205-235 nm měření při 215 a 225 nm v prostředí ph 4-8 platí c bílk = 144 (A 215 -A 225 )/b [µg/ml] mimořádná citlivost (možno stanovit až jednotky ng/ml) interferují acetáty, sukcináty, citráty, ftaláty, barbituráty, stanovení neruší fosfáty, boráty, NaCl, (NH 4 ) 2 SO 4 a Tris c) měření absorpce peptidové vazby s korekcí obsahu aromatických AK dalším měřením při 280 nm pro koncentrace roztoků bílkovin v 0,02M fosfátovém pufru ph 6,8 platí c bílk = 0,3984 (A 235 A 280 ) /b [mg/ml] 0,3984 je převrácená hodnota rozdílu průměrných hodnot absorpčního koeficientu různých bílkovin při 235 a 280 nm Výhody: nukleové kyseliny neinterferují (absorbují stejně při 235 a 280 nm) analýza nevyžaduje kalibraci výsledek je jen málo ovlivněn složením bílkoviny (odchylka výsledku od skutečné hodnoty je při bezkalibrační analýze menší než 20 % rel.) 6
Stanovení bílkovin biuretovým činidlem Bílkoviny tvoří s biuretovým činidlem (CuSO 4 + vinan sodno-draselný + NaOH) fialově zbarvené komplexy (λ= 540-560 nm nebo 310 nm). stanovení je nespecifické (reagují také peptidy, interferuje amoniak a Tris) výsledky jsou prakticky nezávislé na AK složení bílkoviny malá citlivost (pracovní rozsah cca 0,1-10 mg bílk.). 0,40 0,35 0,30 560 544 b 0,25 c Absorbance 0,20 0,15 0,10 a 663 0,05 0,00-0,05 200 300 400 500 600 700 800 900 λ (nm) a 4 ml činidla + 1 ml vody b 4 ml činidla + 1 ml vzorku (vaječný albumin 5 mg/ml) c rozdílová křivka 7
Stanovení bílkovin Lowryho metodou Folin-Ciocalteovo činidlo (směs kyseliny fosfomolybdenové a fosfowolframové) poskytuje v alkalickém prostředí (ph 10-10,5) za přítomnosti Cu 2+ s bílkovinami modře zbarvený produkt (λ max = 745-750 nm). Činidlo reaguje se zbytky aromatických aminokyselin (Tyr, Trp); odezva je proto závislá na aminokyselinovém složení bílkoviny. Reakci dává i samotný Tyr. Stanovení je dosti citlivé (pracovní rozsah 10-200 µg bílk.). 8
Spektrofotometrické stanovení bílkovin po reakci s organickými barvivy Principy: a) bílkovina se váže na rozpustné barvivo a vzniká nerozp. produkt roztok se odbarvuje, tj. klesá absorbance (amidočerň, oranž G) b) vazbou bílkoviny na rozpustné barvivo se mění absorpční spektrum (Coomassie) Bradfordova metoda používá trifenylmethanové barvivo Coomassie brilliant blue G250 C H 3 N SO 3 H H 3 C CH 3 CH 3 HN N + OCH 2 CH 3 SO 3 - Reakce probíhá v kyselém prostředí; absorpční maximum barviva (480 nm) se po reakci s s bílkovinou posouvá na 595 nm (modrý roztok). Absorbance při 595 nm měřená proti roztoku činidla je úměrná koncentraci bílkoviny. 9
Bradfordova metoda: absorpční spektra 1,2 595 1 b 596 Absorbance 0,8 0,6 a 480 c 0,4 638 0,2 0 400 450 500 550 600 650 700 750 800 nm a činidlo b činidlo+bílkovina c diferenční křivka 10
Vlastnosti spektrometrických metod stanovení bílkovin Metoda λ Citlivost Doba Interferenty reakce UV a 280/260 nm vysoká 0 aromatické sloučeniny, nukleotidy, nukleové kyseliny UV 205-235 nm velmi vysoká 0 peptidy, aromatické sloučeniny, složky pufrů (sukcinát, citrát, ftalát, barbiturát ) 15-40 min peptidy, amidy, NH 3, Tris s biuretovým 540-560 nm nízká činidlem (310 nm) Lowry b 745-750 nm vysoká 15-40 min aminokyseliny, NH 3, složky pufrů, surfaktanty, cukry, alkoholy, lipidy Bradford 595 nm vysoká 2 min surfaktanty MIR c 6460 nm střední 0 voda (1548 cm -1 ) NIR d 2180 nm nízká 0 Poznámky: a silná závislost na aminokyselinovém složení b závislost na aminokyselinovém složení, činidlo málo stabilní c přímá analýza mléka d měření reflektance tuhých vzorků, náročná kalibrace 11