Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Ústav vinohradnictví a vinařství MODERNÍ ZPŮSOBY HODNOCENÍ KVALITY HROZNŮ

Mendelova univerzita v Brně Zahradnická fakulta Ústav vinohradnictví a vinařství MODERNÍ ZPŮSOBY HODNOCENÍ KVALITY HROZNŮ BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Vedoucí práce: doc. Ing. Pavel Pavloušek, Ph.D. Vypracoval: Leoš Jakubec Lednice 2011

Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem bakalářskou práci na téma Moderní způsoby hodnocení kvality hroznů vypracoval samostatně a pouţil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloţeném soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uloţena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům. V Lednici, dne: Podpis:

Poděkování Děkuji tímto vedoucímu mé práce doc. Ing. Pavlu Pavlouškovi, Ph.D. za připomínky, cenné rady a trpělivost. Dále děkuji za pomoc nejbliţším lidem, kteří mi při zpracování této práce pomáhali.

OBSAH 1. ÚVOD... 8 2. CÍL PRÁCE... 9 3. LITERÁRNÍ PŘEHLED... 10 3.1 Morfologické sloţení hroznu... 10 3.1.1 Vosková vrstva... 10 3.1.2 Slupka... 10 3.1.3 Duţnina... 11 3.1.4 Semena... 11 3.1.5 Třapina... 11 3.2 Chemické sloţení hroznu... 12 3.2.1 Voda... 12 3.2.2 Cukry... 12 3.2.3 Organické kyseliny... 12 3.2.4 Aromatické látky... 13 3.2.5 Fenolické látky... 16 3.2.6 Dusíkaté látky... 20 3.2.7 Minerální látky... 21 3.3 Senzorické metody hodnocení kvality hroznů... 21 3.3.1 Metoda ICV (Institute Coopératifdu Vin)... 22 3.3.2 Metoda Gironde... 23 3.3.3 Metoda dle posuzování barevnosti semen... 24 3.4 Analytické metody hodnocení fenolické zralosti hroznů... 24 3.4.1 Folin-Ciocalteau metoda... 25 3.4.2 Patrick-Iland metoda... 25 3.4.3 Glories metoda... 25 3.4.4 Cromoenos metoda... 26 3.4.5 NIRS (Near infrared reflectance spectroscopy)... 26 3.4.6 Optické metody... 28 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 29 4.1 Charakteristika stanoviště... 29

4.2 Odrůdy... 29 4.3 Odběr vzorků pro stanovení analytických hodnot... 29 4.4 Stanovení cukernatosti moštu areometry... 29 4.5 Stanovení cukernatosti moštu refraktometricky... 30 4.6 Stanovení veškerých titrovatelných kyselin... 30 4.7 Stanovení ph... 30 4.8 Stanovení analytických hodnot pomocí FTIR technologie... 31 4.9 Stanovení analytických hodnot pomocí HPLC... 32 5. VÝSLEDKY PRÁCE... 33 5.1 Srovnání analytických metod pro stanovení kvalitativních parametrů hroznů 33 5.1.1 Metody pro stanovení cukernatosti... 33 5.1.2 Metody pro stanovení ph... 34 5.1.3 Metody pro stanovení kyseliny jablečné a celkových kyselin... 36 6. DISKUSE... 39 7. ZÁVĚR... 41 8. SOUHRN... 42 9. SUMMARY... 42 10. SEZNAM LITERATURY:... 43 11. PŘÍLOHY... 46

1. ÚVOD Pěstování vinné révy má v České republice velmi dlouhou tradici a v posledních letech se těší nebývalému rozmachu. Prvotním předpokladem úspěšné sklizně hroznů je stanovit si poţadavky na kvalitu hroznů, které chceme dosáhnout v době sklizně uţ na začátku vegetace. Agrotechnické zásahy ve vinici by měli být přizpůsobeny určitému cíli. Kvalitu nelze definovat pouze jedním kvalitativním parametrem. Musí jít vţdy o kombinaci těchto hlavních parametrů a tj. (cukernatost, obsah titrovatelných kyselin, ph, aromatická a fenolická zralost hroznů). Optimální zralost hroznů je třeba definovat na základě zřetelných chemických, biochemických nebo senzorických znaků, které je třeba vyuţívat pro stanovení vhodné technologické zralosti. V dnešní moderní době není priorita vysoký výnos na vinici, ale kvalita hroznů. Protoţe konzument je stále náročnější, má moţnost srovnání se zahraniční produkcí vína. Senzorické hodnocení kvality hroznů má velký význam z pohledu stanovení optimálního termínu sklizně, ale jde pouze o subjektivní hodnocení, které můţe být ovlivněno mnoha faktory. Nedílnou součástí senzorického hodnocení přímo ve vinici by mělo být analytické stanovení zmiňovaných parametrů. V současné době existuje mnoho metod, které by bylo moţné aplikovat v průběhu dozrávání ke kontrole zralosti hroznů. Výsledky analytického rozboru moštu jsou potom pro daného technologa ve sklepním hospodářství velkou výhodou a na jejich základě můţe zvolit vhodnou technologii, která povede k co největšímu vyuţití potenciálu dané suroviny. Fyzikálně chemický rozbor nám umoţňuje stanovit některé významné sloţky pocházející z hroznu, ať pozitivní, či negativní a rovněţ umoţňuje zcela přesně určit přidávání cizích látek, případně odhalit falšování vína. Proto je tento proces nezaměnitelný a v rámci určování komplexní kvality je nenahraditelný. 8

2. CÍL PRÁCE Hlavním cílem této práce bylo shromáţdění literatury o moderních způsobech hodnocení kvality hroznů. Literární přehled má za úkol popsat jednotlivé parametry kvality hroznů. Dále se práce zabývala jednotlivými analytickými a senzorickými metodami hodnocení kvality hroznů. Experimentální část se zaměřuje na zhodnocení kvalitativních parametrů pomocí různých analytických metod. 9

3. LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Morfologické složení hroznu Bobule révy vinné je duţnatý plod, který se vyvíjí po plození z pletiv vajíčka. Jsou uspořádané v hroznu. Existuje velká rozmanitost ve vývoji a velikosti bobulí v různých částech hroznu. Kaţdá bobule se skládá ze skupiny pletiv perikarpu, který obklopuje semena. Perikarp je rozdělený na exokarp (slupku), mesokarp (duţninu) a endokarp (pletivo, které ohraničuje semena). Vodivá pletiva se potom rozvětvují vně duţniny, těsně pod slupkou (PAVLOUŠEK, 2009). 3.1.1 Vosková vrstva Tenká vosková vrstva (kutikula) potahuje celou bobuli a chrání ji před mechanickým poškozením a nadměrným vypařováním. Tato vrstva ovlivňuje ulpívání prostředků ochrany rostlin a pohlcování pachů z okolí např. asfalt, nafta (STEIDL, 2006). Tloušťka kutikuly se u odrůd Vitis vinifera L. pohybuje mezi 1,5 4,0 μm a je to také odrůdovou vlastností. 3.1.2 Slupka Slupka bobule (epidermis a hypodermis) sestává z 10-12 vrstev relativně malých buněk (tloušťka asi 7-15 µm), které jsou odpovědny za mechanickou pevnost a ochranu. Jejich tloušťka stěny 1-6 µm je tedy relativně velká. Kaţdá buňka navazuje na sousedních 14 buněk a je sloţena s elementárních vláken (mikrofibril) celulózy pro dosaţení pevnosti v tahu a základní hmoty z hemicelulózy, proteinů a pektinových látek dodávajících pruţnost. Obsahují většinové mnoţství fenolických látek (třísloviny, barviva), minerálních látek (vápník, draslík), pektinů, proteinů a hroznových enzymů (STEIDL, 2006). Na povrchu bobule se nachází průduchy. Slupka představuje asi 8-20% z hmotnosti bobule. Hodnota ph je ve slupce vyšší neţ v duţnině. Ve slupce se vyskytují především sekundární metabolity, fenolické látky antokyaninová barviva a taniny a také aromatické látky. 10

1986). Slupky bílých odrůd obsahují ţlutá a zelená barviva (MINÁRIK, NAVARA, 3.1.3 Dužnina Je základní částí bobule pro vinařskou technologii. Duţnina má 2 části. Vnější část obvodová, ta je šťavnatější a vnitřní ta je tuhá, nachází se v ní semena a cévní svazky. Chemické sloţení a chuťové vlastnosti duţniny je odrůdovou vlastností (MINARIK, NAVARA, 1986). Duţnina představuje 75-85% z celkové hmotnosti bobule. Obsahuje cukry, především glukózu a fruktózu. Z organických kyselin mají nejvýznamnější zastoupení v duţnině kyseliny vinná, jablečná a citrónová. Hlavní anorganickou kyselinou, která se vyskytuje v bobulích je kyselina fosforečná. Ze sekundárních metabolitů jsou v duţnině obsaţené aromatické látky a u odrůd, které označujeme jako barvířky rovněţ antokyaninová barviva (PAVLOUŠEK, 2009). 3.1.4 Semena Semena dosahují asi 3-6% z celkové hmotnosti bobule. Jsou významným zdrojem fenolických látek. Z důvodu obsahu fenolických látek, mají vliv na kvalitu modrých odrůd révy vinné. Morfologie semen révy vinné je odrůdovou vlastností. Počet a hmotnost semen můţe být dáno klimatickým rokem a způsobem ošetřování vinice. Bobule obsahuje 0-4 ks semen, průměrně je 1-2 semena, která jsou původně zelená, při dozrávání hnědnou, sesychají a jejich hmotnost se zmenšuje (LAHO, MINARIK, NAVARA, 1970). 3.1.5 Třapina Třapina tvoří hlavní osu a je nositelem bobulí. Obsahuje malé mnoţství sacharidů, průměrnou koncentraci kyselin a velké mnoţství fenolických látek (představují asi 20% z celkového obsahu v hroznech). Třapina je soubor rozvětvených stopek hroznu. Zabezpečuje spojení mezi listy a bobulemi. Chemické sloţení třapiny je závislé na odrůdě (MINÁRIK, NAVARA, 1986). 11

3.2 Chemické složení hroznu 3.2.1 Voda Obsah vody v moštech je 70 90 % a její mnoţství závisí na odrůdě a klimatických faktorech (MINÁRIK, NAVARA, 1986). Voda je hlavní součástí moštu a je v ní rozpuštěna většina ostatních sloţek. Její mnoţství závisí na kultivaru, stupni vyzrání a na klimatických podmínkách během vegetace. Tvoří asi 70 aţ 80 % (hmot.) moštu (ŠVEJCAR, 1986). 3.2.2 Cukry Tato skupina látek slouţí v přírodě jako základní stavební kámen buněčných stěn a jako chemický akumulátor energie, proto je pro rostliny velmi důleţitá (STEIDL, 2006). Cukry jsou vyráběny za pomocí fotosyntézy v listech révy vinné. Je důleţitá voda při dozrávání hroznů vyplývá to s rovnice: 6 CO 2 + 6 H 2 O = C 6 H 12 O 6 + 6 O 2 Skládají se z polyfunkčních molekul a jsou schopny se účastnit velkého mnoţství chemicky, biochemických a metabolických reakcí. Cukry jsou prekurzory organických kyselin, fenolů a dokonce i aromatických aminokyselin (tryptofan, fenylalanin, tyrosin) (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). Mezi základní cukry, které se nachází v hroznech a víně patří D-glukóza a D- fruktóza. Poměr těchto dvou hlavních cukrů se mění v průběhu dozrávání hroznů. Mezi další cukry, které se ve stopovém mnoţství nachází v bobulích patří: L-arabinóza, D-xylóza, D-ribóza, L-rhamnóza. Jejich obsah v hroznech je však prakticky nevýznamný, protoţe nejsou metabolizované kvasinkami a neovlivňují senzorické vlastnosti vína (PAVLOUŠEK, 2009). Masivní hromadění glukózy a fruktózy ve vakuolách buněk mesokarpu nastává po zaměkání bobulí (CONDE et. al., 2007). 3.2.3 Organické kyseliny Organické kyseliny tvoří hlavní podíl na sloţení, stability a organoleptických vlastností, obzvláště bílých vín. Jejich konzervační vlastnosti posilují mikrobiologickou 12

a fyzikálně-chemickou stabilitu. Jsou v hroznech částečně neutralizovány draselnými a vápenatými ionty, se kterými tvoří soli. Kyselina citrónová hraje velmi důleţitou roli (biochemickou a metabolickou) v Krebsově cyklu (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). Kyselina vinná a kyselina jablečná představují 69-92% ze všech organických kyselin, které se nachází v bobulích a listech révy vinné. Fotosyntéza v zelených bobulích je zodpovědná za akumulaci přibliţně 50% organických kyselin. Pokles obsahu organických kyselin, který začíná v průběhu dozrávání bobulí je spojený s náhlým nástupem oxidace kyseliny jablečné. Kyselina jablečná je buď přeměňovaná na fruktózu a glukózu, nebo je vyuţívaná jako zdroj uhlíku a energie pro dýchání (CONDE et al., 2007). Dále se v hroznech vyskytují kyseliny jantarová, glykolová, šťavelová. 3.2.4 Aromatické látky Aromatickou látkou se rozumí chemická látka, která vyprchává z vodněalkoholového roztoku vína a můţe se pomocí své plynné fáze dostat do našeho nosu. Aromatické látky jsou tvořeny z několika stovek těkavých látek v rozmezí několika mg.l -1 do několika µg.l -1.V bobulích révy vinné je nízké mnoţství aromatických látek k dispozici v těkavé, tudíţ čichově vnímatelné formě (WERWITZKE et al., 2000; FISCHER et al. 2001 in PAVLOUŠEK, 2009). Monoterpeny Monoterpeny se vyskytují ve formě jednoduchých uhlovodíků (limonen, myrcen), aldehydů (lineal, geranial), alkoholů (linalol, geraniol), kyselin (linalová kyselina) a dokonce i esterů (linalyl acetát). Asi 40 terpenových sloučenin bylo identifikováno v hroznech. Mezi nejvíce vonné monoterpeny patří: linalool, nerol, geraniol, α-terpineol, citronelol a hotrienol, který připomíná esenci růţe. Hrají hlavní roli ve vonných komponentech muškátových odrůd. Nejvíce glykosidických monoterpenů je ve slupce (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). Monoterpeny, které jsou běţnou součástí mnoha ovoce, jsou přítomny ve volné (vonné) formě a více zastoupené vázané (nevonné) formě glykosidů (MATEO A JIMENEZ, 2000). 13

(CONDE et al. 2007) rozděluje monoterpeny na 3 kategorie a vzájemné vztahy mezi nimi. Volné aromatické monoterpeny, patří sem linalool, geraniol, nerol,citronelol, α- terpineol, hotrienol. Nearomatické polyoly (dioly a tioly). Významným rysem polyolů je, ţe jsou reaktivní a snadno štěpitelné např. diendiol (3,7-dimethylocta-l,5-diene-3,7- diol). Tyto polyoly jsou přítomny v hroznech v koncentracích aţ do 1 mg.l -1 Glykosidicky konjugované formy, tyto formy se přímo nepodílejí na aroma hroznů. Koncentrace v moštu těchto glykosidických prekurzorů se pohybuje mezi 6,5 28 mg.l -1 C 13 Norisoprenoidy a Karotenoidy Oxidativní degradací karotenoidů, terpenů se 40 atomy uhlíku (tetraterpenoly) jsou produkovány deriváty s 9, 10, 11 nebo 13 atomy uhlíku. Deriváty s 13 atomy uhlíku (C 13 Norisoprenoidy) mají zajímavé aromatické vlastnosti. Nicméně C 13 Norisoprenoidy jsou hlavně přítomny v hroznech ve formě netěkavých prekurzorů (karotenoidů a glykosidů). V osluněných hroznech probíhá degradace karotenoidů rychleji (RAZUNGLES et al. 1998 in CONDE et al. 2007). Z hlediska chemického jsou rozděleny do dvou skupin, kaţdá z těchto dvou skupin obsahuje velké mnoţství těkavých sloučenin (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). Methoxypyraziny Methoxypyraziny jsou dusíkaté heterocyklické sloučeniny produkované metabolismem aminokyselin. Tyto vysoce aromatické látky poskytují vůně připomínající zelenou papriku, chřest dokonce i zemité tóny. Mají extrémně nízkou prahovou hodnotu vnímání okolo 1 µg.l -1. Mezi nejdůleţitější methoxypyraziny vyskytující se ve víně a hroznech patří: 2-methoxy-3-isobutylpyrazin (IBMP) 3-sec-butyl-2-methoxypyrazin (SBMP) 3-isopropyl-2-methoxypyrazin (IPMP) 14

Poprvé byly methoxypyraziny zjištěny v hroznech Cabernet Sauvignon. 2- methoxy-3-isobutylpyrazin a další pyraziny byly zjištěny v Sauvignon blanc, Cabernet franc, Merlot, Pinot noir, Gewürtztraminer, Chardonnay, Ryzlink rýnský aj. Methoxypyraziny jsou extrémně citlivé na světlo (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). Tvorba methoxypyrazinů v hroznech je výrazně determinována klonem révy a stupněm vyzrálosti, kdy genetická dispozice má dominantní úlohu. V hroznu je více neţ polovina celkového mnoţství methoxypyrazinů lokalizována v třapině a zbytek ve slupce a semenech v poměru 2:1. Duţnina tuto skupinu látek téměř neobsahuje (KUMŠTA, 2010). Nejvyšší úroveň těchto aromatických látek je v nezralých, zastíněných hroznech a pěstovaných v chladném podnebí (cool climates) (COOMBE et. al. 2004). Třapiny obsahují více neţ polovinu (53%) z IBMP, zatímco nejvyšší koncentrace IBMP je ve slupce (67%). Méně neţ 1% z IBMP v hroznech je v duţnině a zbytek se nachází v semenech. V hroznech a vínech byly dále zjištěny tyto methoxypyraziny: 2-methoxy-3-methylpyrazin 2-methoxy-3-ethylpyrazin Jsou ovšem mnohem méně aromatické neţ 2-methoxy-3-isobutylpyrazin. Některé methoxypyraziny mohou být mikrobiálního původu(ribéreau-gayon et. al. 2006). Vonné thioly Jsou to senzoricky neaktivní konjugáty s aminokyselinou cysteinem a jsou přítomné jiţ v hroznech, ale volné vonné thioly se uvolňují aţ činností specifického enzymu β-lyasy, jejíţ aktivitu v různé míře vykazují některé formy kvasinek (KUMŠTA, 2010). Sirnaté sloučeniny ze skupiny thiolů (nebo merkaptanů) jsou zpravidla zodpovědné za čichové vady. Nicméně byl prokázán jejich podíl na aromatu určitého ovoce a aromatických rostlin. Tyto specifické thioly jsou charakteristické vůně ovoce jako černý rybíz, grapefruit, list rajčete, mučenka, broskev, květ akátového dřeva. Od roku 1990 byl v odrůdě Sauvignon blanc identifikováno několik těkavých thiolů. Práh vnímání v modelových roztocích je 0,8 µg.l -1. Koncentrace těkavých thiolů můţe být i 15

nad 100 mg.l -1 v Sauvignon blanc. To má nepopíratelný organoleptický vliv na odrůdové aroma Sauvignonu (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). Ve vínech Sauvignon blanc byly identifikovány tyto vonné thioly: 4-mercapto-4-methyl-pentan-2-one (4-MMP) 4-mercapto-4-methyl-pentan-1-ol (4-MMPOH) 3-mercapto-3-methyl-butan-1-ol (3-MMB) 3-mercaptohexan-1-ol (3-MH) 3-mercaptohexylacetate (A3-MH) Všechny tyto látky ze skupiny thiolů se vyskytují v bobulích ve vázané a netěkavé formě, a uvolňují se aţ při zpracování hroznů (PAVLOUŠEK, 2009). Těkavé fenoly Těkavé fenoly mohou ve víně způsobovat většinou neţádoucí aroma, jako lékarnické aroma, plastové aroma apod., které rozhodujícím způsobem poškozují kvalitu vína. U těchto sloučenin je důleţitá jejich koncentrace v bobulích a následně ve víně, protoţe v niţších koncentracích mohou být z aromatického pohledu ţádoucí. Jsou přítomné v bílých i červených vínech s velkými rozdíly podle odrůdy, oblasti, počasí, agrotechniky ve vinici a způsobu zpracování. Hlavní těkavé fenoly ve víně jsou: 4-vinylguajacol, 4-vinylfenol, 4-ethylguajacol, 4-ethyl-fenol. Prekurzory těchto těkavých fenolů jsou hydroxyskořicové kyseliny, které se nachází v hroznech. Ne-flavonoidní hydroxyskořicové kyseliny jsou kyselina p- kumarová a kyselina ferulová a právě tyto kyseliny jsou dekarboxylované do formy těkavých fenolů (SWIEGERS et al., 2005) 3.2.5 Fenolické látky Fenolické látky hrají významnou roli v enologii. Mají baktericidní a antioxidační vlastnosti, dále obsahují vitamíny. Jejich molekuly pochází z různých částí hroznů a jsou extrahovány při výrobě vína. (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). 16

Během vzniku a zrání podléhají velkému mnoţství reakcí, tyto změny je však velmi obtíţné sledovat i pouţitím moderních analytických metod (KUMŠTA, 2010). Jsou zodpovědné za barvu modrých hroznů, červených vín a podílí se na oxidativním hnědnutí bílých vín. Fenolické látky jsou přítomny v různých částech hroznu. Ne-flavanoidní fenolické látky Hydroxyskořicové kyseliny Mezi základní hydroxyskořicové kyseliny patří kyselina p-kumarová, kyselina kávová a kyselina ferulová. Byly identifikovány v malém mnoţství ve volné formě, ale jsou hlavně esterifikované, zejména kyselinou vinnou. Nemají ţádnou zvláštní chuť nebo vůni. Tyto sloučeniny jsou rovněţ prekurzorem těkavých fenolů, které vznikají činností kvasinek rodu Brettanomyces (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). Jsou obsaţeny v duţnině a mají antioxidační vlastnosti (KUMŠTA, 2010). Patří mezi hlavní fenolické látky obsaţené v bílém víně. (JAMES et. al., 2006). Hydroxybenzeoové kyseliny Jedná se o skupiny sloučenin, které jsou ve velmi malém mnoţství zastoupené ve víně. V hroznech se nachází především ve formě glykosidů, ze kterých jsou uvolňované kyselou hydrolýzou, a rovněţ ve formě esterů (gallové a elagické taniny), ze kterých se uvolňují alkalickou hydrolýzou (RIBÉREAU-GAYON et. al. 2006). Mezi základní hydroxybenzeové kyseliny patří: kyselina p- hydroxybenzoová, kyselina vanilinová, kyselina gallová, kyselina syringová, kyselina salycilová. Stilbeny Stilbeny zařazujeme mezi fytoalexiny, jsou to nízkomolekulární látky, které mají antimikrobiální vlastnosti a vznikají na základě vzájemného působení mezi rostlinou a mikroorganismem (CREASY a CREASY, 2003 in PAVLOUŠEK 2009). 17

Nacházejí se ve slupce a koncentrace v červených vínech můţe být od 0,1-12 mg.l -1 (CONDE et.al., 2007). Mezi nejznámější stilbeny patří (trihydroxy-3,5,4-stilben) - resveratrol. Resveratrol se nachází ve slupce, je především extrahovaný během kvašení červeného vína a má dobré (pozitivní) vlastnosti.(ribéreau-gayon et. al. 2006). Je to stresový metabolit vznikající v révě v reakci na abiotický (UV záření) a biotický stres (Botrytis cinerea). Hydrolyzovatelné taniny Jsou to deriváty kyseliny gallové. Tato skupina látek nemá svůj původ v hroznech. Jejich původ souvisí s pouţíváním dubových sudů nebo enologických přípravků. Jsou sloţené z jedné glykosidické molekuly, na kterou jsou vázány různé hydroxylové skupiny, z nichţ nejdůleţitější je kyselina gallová. (ROEDIGER, 2006). Flavonoidní fenolické látky (Flavonoidy): Flavonoly V hroznech jsou přítomny ve formě glykosidů např. rhamnosylquercetin. Jsou to ţluté pigmenty a nejvýznamnější jsou kaempferol (1 OH), quercetin (2 OH) a myricetin (3 OH). Jsou diferencované podle bočního jádra. Všechny tři pigmenty jsou přítomny u modrých odrůd, zatímco u bílých odrůd pouze první dva. U bílých vín kde kvašení probíhá v nepřítomnosti pevných látek, jsou typické hodnoty 1 3 mg.l -1 podle odrůdy. Nejčastější identifikovaný flavanonol v hroznech a víně bývá dihydroquercetin téţ známý jako taxifolin. (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Flavonoly mají schopnost působit jako ochrana před UV zářením (DOWNEY et. al., 2003). Antokyaniny Nacházejí se ve slupkách modrých hroznů a jsou odpovědné za barvu a barevnou stabilitu červených vín. Jsou to ve vodě rozpustné flavonoidní deriváty, mohou být 18

glykosidované nebo acylované. Neglykosidované formy, jsou to aglykony (anthokyanidiny) jsou méně stabilní neţ vázané glykosidované formy (anthokyaniny). V hroznech se vyskytuje pět anthokyanidinů a to malvidin, petinidin, kyanidin,peonidin, delfinidin (ROEDIGER, 2006). Antokyaniny jsou také přítomny ve velkých mnoţstvích v listech, hlavně na konci vegetačního období. Barvivo se nachází ve vakuolách v přítomnosti jiných polyfenolů (fenolové kyseliny, flavonoidy). Tyto faktory vysvětlují různé zabarvení modrých odrůd. Všechny odrůdy mají stejnou antokyanidinovou strukturu, ale je zde několik malých změn ve sloţení. Mezi těmito pěti antokyanidiny je dominantní malvidin ve všech odrůdách (RIBÉREAU-GAYON et. al., 2006). Mohou být esterifikovány kyselinou octovou nebo kumarovou a nahrazeny hydroxylovou nebo methylovou skupinou. (BLOUIN & CRUÉGE 2003 in CONDE et. al. 2007; ADAMS 2006). Obr. 1: Přehled hlavních anthokyanidinů Taniny flavan-3-oly a proatokyanidiny Velmi významnou skupinou fenolických látek v hroznech a víně jsou polymerní flavan-3-oly, které označujeme také jako taniny. K maximální koncentraci taninů ve slupce dochází ve fenofázi zaměkání bobulí a jejich obsah klesá v průběhu dozrávání (KENNEDY et al., 2000; DE FREITAS et al., 1999 in PAVLOUŠEK, 2009). Flavan-3-oly jsou odpovědné za hořkost a svíravost ve vínech. Katechiny, taniny a antokyaniny jsou nejvíce koncentrované přírodní antioxidanty přítomné v modrých odrůdách a víně. (MATTIVI et al. 2002). Hlavními flavan-3-oly, které byly nalezeny v hroznech a vínech jsou (+)- katechin, (+)-gallokatechin, (-)- epikatechin, (-)-epigallokatechin a epikatechin-3-o- 19

gallát.taniny jsou látky schopné vytvořit stabilní kombinaci s proteiny a dalšími rostlinnýmipolymery, např. polysacharidy (RIBÉREAU-GAYON et al., 2006). Kvalita taninů v hroznech je důleţitý faktor pro výrobu červených vín. Jsou tvořeny polymerizací základních fenolických molekul, podle charakteru těchto molekul. V zásadě existují 2 chemické třídy taninů (ROEDIGER, 2006): KONDENZOVANÉ - stavební jednotkou je katechin, nacházejí se ve slupce a v semenech. Jsou známé také jako proantokyanidiny a jsou to polymerní flavonoidy. Je to nejbohatší skupina rozpustných polyfenolů v hroznech. Jsou to hlavně kondenzované polymery z flavan-3-olů (katechiny) a flavan-3,4-diolů (leukoantokyanidiny). HYDROLYZOVATELNÉ deriváty kyseliny gallové, viz. Kap. 3.2.5. Obr. 2: Přehled hlavních flavan-3-olů 3.2.6 Dusíkaté látky V bobulích révy vinné se můţe dusík vyskytovat v anorganických formách NH 4 +, NO 3 -, NO 2 - nebo v organických formách volné aminokyseliny, bílkoviny, močovina, ethylkarbamát nebo nukleové kyseliny. Výzkumy naznačují, ţe celkové mnoţství dusíkatých sloučenin v orgánech révy vinné závisí na genetických faktorech, podmínkách okolního prostředí a agrotechnických zásazích. Významné rozdělení dusíku v rostoucích bobulích révy vinné začíná v období po kvetení. Hlavní zdroj dusíku pro kvasinky představují primární aminokyseliny a amonné ionty udávané jako 20

FAN (free assimilable nitrogen) nebo YAN (yeast assimilable nitrogen) (JIRÁNEK et. al. 1995 in PAVLOUŠEK, 2009). Dusík silně ovlivňuje růst letorostů a barvu listů révy vinné. Dusíkaté látky uloţené v bobulích jsou velmi důleţité pro rozmnoţování a vlastní činnost kvasinek. Amoniakální dusík reprezentuje 80 % celkového dusíku vznikajícího přeměnou dusíkatých látek asimilovaných kořeny rostliny (BAROŇ, 2010). Dusík asimilovatelný kvasinkami se dělí na amoniové ionty a volné aminokyseliny. Jeho obsah v moštech se pohybuje v rozmezí desítek aţ stovek mg N.l -1 (s optimem kolem 200) a většinou postačuje k tomu, aby mohla být fermentace úplná (BAROŇ, 2011). 3.2.7 Minerální látky Minerální látky se do moštu dostávají především z půdy. Obsah popela v moště se pohybuje v rozmezí 2 8 g.l -1 (MALÍK; MINÁRIK 1983). Protoţe během alkoholového kvašení dochází k velkému úbytku minerálních látek, jednoznačně můţeme poukázat na skutečnost, ţe tyto látky jsou důleţitou ţivinou pro kvasinky (ŠVEJCAR, 1986). 3.3 Senzorické metody hodnocení kvality hroznů Senzorické hodnocení hroznů v průběhu dozrávání ve vinici má velký význam z pohledu stanovení optimálního termínu sklizně. Tento způsob hodnocení je velmi jednoduchý, nevyţaduje ţádné speciální přístroje a analýzy ke stanovení. Z vinohradnického pohledu nás zajímá především primární nebo-li hroznové aroma. Významné rozdíly ve sloţení aromatických látek existují i v závislosti na pěstované odrůdě révy vinné. Aromatické látky se tvoří v bobulích révy vinné, ve slupce a těsně pod slupkou. Aromatickou zralost můţeme hodnotit vizuálně na základě zbarvení slupky a senzoricky na základě chuti volných aromatických látek v bobuli. Díky sklizni v optimální aromatické zralosti můţeme docílit skutečně vynikající kvality výchozí suroviny pro výrobu vína. 21

Tab. 1: Hodnocení aromatické zralosti slupky. Hodnocený znak Barva slupky Kyselá chuť Trpká chuť Ovocné aroma Travnaté aroma 1 2 3 4 5 zelená zelenoţlutá ţlutozelená Velmi silnánepříjemná Silná - nepříjemná Střední - příjemná Ţlutozelená s odstínem do zlatava nebo růţova Svěţí - příjemná Zlatavá s hnědými skvrnami Nepříjemná - agresivní Silná střední nízká ţádná silná slabé střední silná Velmi silná Slabá - cizí Silné střední slabé nepřítomné Střední intenzitacizí Tab. 2: Hodnocení aromatické zralosti dužniny bobulí. Hodnocený znak Kyselá chuť Sladká chuť Ovocné aroma Travnaté aroma 1 2 3 4 5 Velmi silnánepříjemná Silná - nepříjemná Střední - příjemná Fresh - příjemná Nepříjemnáagresivní Velmi slabá Slabě sladká Středně Velmi Sladká sladká sladká s cizími tóny slabé střední silná Velmi silná Slabá - cizí Silné střední slabé nepřítomné nepřítomné Z pohledu sklizně kvalitních hroznů je optimální stupeň 4. Velký počet hroznů se v našich vinicích sklízí velmi často ve stupni 5, který je jiţ nekvalitním pro výrobu vína. Hrozny ve stupni 5 jiţ nejsou vhodné k výrobě kvalitních vín. Na základě této stupnice je proto moţné přímo ve vinici hodnotit aromatickou zralost hroznů (PAVLOUŠEK, 2009). 3.3.1 Metoda ICV (Institute Coopératif du Vin) Ochutnávka samotných bobulí představuje poměrně jednoduchý nástroj pro hodnocení zralosti s minimem tréninku. Umoţňuje nejen rozlišovat stupně zralosti (zejména fenolické zralosti), ale můţe i napovědět k potenciální jakosti vína. Je to vyladěná senzorická metoda zahrnující kvantitativní parametry. Tyto parametry se nazývají deskriptory. Pomáhají vytvořit senzorický profil bobule (hroznu). V tabulce 22

jich je 20 parametrů (deskriptorů). Viz. Přílohy Schéma 1. Pouţívá se spíše pro modré odrůdy, ale lze ji modifikovat i pro odrůdy bílé. Postup ochutnávky tkví v posouzení duţniny, slupky a semen. Kromě sluchu je vyuţito všech smyslů. Následující postupy jsou v tomto pořadí: Vizuální prohlídka bobule Ochutnávka duţniny (semena a slupku se snaţíme dát na stranu v ústech) Ochutnávka slupky Vizuální prohlídka semen a popřípadě ochutnávka Po těchto postupech je vhodné charakterizovat míru zralosti a kvalitativní potenciál bobule (hroznu). K této ochutnávce je potřeba asi tři bobule. Bobule musí být vybrány náhodně, z různých oblastí pozemku, osluněná a neosluněná strana, například sesbírání 200 bobulí pro sledování zralosti. Ochutnávka bobulí doplňuje chemickou analýzu sledování zralosti (ROEDIGER, 2006). 3.3.2 Metoda Gironde Základním principem této metody je oddělení slupky od duţnin a semen. Tato metoda se pouţívá velmi úspěšně v Evropě. Pomocí této metody dokáţeme monitorovat průběh vývoje pigmentů během zrání bobule. Tato metoda slouţí k posouzení aromatické i fenolické kvality hroznů (ROEDIGER, 2006). Metoda spočívá v odběru 150 bobulí a oddělení semen a duţniny. K samotnému pokusu nám postačí pouze slupka hroznu. Slupky jsou rozmixovány s 75 ml roztoku kyseliny citrónové, kdy konečné ph by mělo být 3,5. Do této směsi se přidá 96% etanol, aby výsledný roztok měl 8 % obj. alkoholu. Filtrovaný roztok slouţí k degustaci a hodnocení: Barvy (stupnice 1-5) Chuť (od nezralých aţ po zralé tóny), rostlinná, zelená, hodnocení opět na stupnici 1-5 Koncentrace chuti (stupnice 1-5) Intenzita, projev a kvalita taninů (zelené, hořké, tvrdé tóny) 23

3.3.3 Metoda dle posuzování barevnosti semen V průběhu vývoje semen dochází ke změnám barvy semen, které jsou velmi zřetelné. Barva semenných obalů se mění z ostře zelené na počátku vývoje semen, přes ţlutou barvu v době zaměkání bobulí, po tmavohnědou v době sklizně. Na Univerzitě v Adelaide byla vytvořena barevná stupnice pro hodnocení semen. Stupnice má 12 stupňů a u kaţdého semene se jednotlivě hodnotí horní a dolní strana semene. Z obou získaných hodnot se potom vypočítá průměrná hodnota. Změny v barvě semen korelují se změnami fenolického sloţení semen, hromaděním cukrů, antokyaninů a fenolických látek ve slupce. Tuto metodu je proto moţné pouţít jako indikátor zralosti semen a bobulí (RISTIC; ILAND 2005). Diagram 1.: Barevná stupnice pro hodnocení fenolické zralosti semen. 3.4 Analytické metody hodnocení fenolické zralosti hroznů Existují různé metody pro posouzení fenolické zralosti v hroznech, ale nejsou shodné s obsahem fenolických látek v následném víně. Pojem technologické (cukr/kyselina), aromatické a fenolické zralosti jsou nezávislé proměnné, tzn. všechny musí být vzaty v úvahu při posuzování enologické zralosti a při rozhodování o tom kdy musí být hrozny sklizeny. Fenolická zralost nezahrnuje pouze celkovou koncentraci těchto látek v hroznech, ale také strukturu a kapacitu těchto látek, které budou uvolněny během vinifikace (RIBÉREAU-GAYON et.al., 2006). Nejpouţívanější metody pro stanovení fenolické zralosti hroznů jsou zaloţeny na získávání extraktu hroznů a jeho macerací v různých rozpouštědlech. Pravděpodobně nejpouţívanější metoda je Glories. Ostatní metody (ITV, Patrick Iland metoda ad.) jsou časově náročné a vyţadují speciální vybavení a vyškoleny personál. Byla navrhnutá i metoda za pouţití mikrovln, která by umoţňovala zrychlení procesu extrakce. Technika na bázi FTIR (Fourier Transform infrared) se jiţ uplatňuje při analýze 24

extraktů (GLORIES and AGUSTIN 1993; SAINT-CRICQ de GAULEJAC et al. 1998; CELOTTI et al. 2007a; DUBERNET et al. 2000 in KONTOUDAKIS 2010). 3.4.1 Folin-Ciocalteau metoda Původně tato metoda byla vyvinuta pro stanovení celkových fenolů ve víně. Ve vinařském průmyslu byla úspěšně pouţívána více jak 30 let. První zmínka o této metodě byla publikována v roce 1927. V roce 1962 byla pouţita pro stanovení celkových fenolů v rostlinných produktech. Jedná se o citlivou, kvantitativní metodu. Spočívá v měření koncentrace celkových fenolů. Metoda spočívá ve spektrofotometrické analýze, zaloţené na kolorimetrické oxidačně-redukční reakci ke standartu coţ je kyselina gallová. Bez rozlišení monomerů, dimerů a větších fenolických sloučenin. Výsledky jsou vyjádřeny jako ekvivalenty kyseliny gallové (GAE gallic acid equivalents) (ROEDIGER, 2006). 3.4.2 Patrick-Iland metoda Je zaloţena na etanolové extrakci pigmentů známého mnoţství macerovaných, celých hroznů. Část etanolového extraktu se ředí HCL a měří se absorbance na spektrofotometru při 520 nm. Výpočet červených pigmentů je na základě pouţití extinčního koeficientu malvidin-3-glukosidu a výsledek je vyjádřen jako ekvivalent tohoto antokyaninu. Celkové fenoly se získávají přepočtením výsledků naměřených absorbancí při 280 nm (ROEDIGER, 2006). 3.4.3 Glories metoda Tato metoda spočívá v testu extrahovatelnosti jako indikátor fenolické zralosti. Sleduje se rozklad buněčných stěn slupky a naznačení začátku přezrávání. Tato metoda můţe být pouţita k určení mnoţství a extrahovatelnosti antokyaninů, taninů v semenech a celkových fenolických látek v hroznech. Tato metoda je výhodná zejména v rychlém extrahování antokyaninů ze slupky. Drcení semen je potřeba k extrakci taninů ze semen. 25

Jsou zde pouţity dva vodné roztoky ph=1, ph=3,2. V kyselém prostředí dochází k uvolnění obsahu vakuoly. Celkové antokyaniny jsou stanovovány v roztoku ph 1. Při ph 3,2 jsou srovnatelné podmínky při extrahování během kvašení. Pouţívá se UV absorbance při 280 nm ke stanovení celkového obsahu fenolických látek. Hlavní parametry měřené touto metodou jsou: - A ph 1 coţ je celkový antokyaninový potenciál, který se mění v závislosti na odrůdě mezi 500 2000 mg.l -1. - (EA) antokyaninová extrahovatelnou, hodnoty se pohybují mezi 70-20 v závislosti na odrůdě a zralosti. - podíl taninů ze semen na celkovém fenolickém sloţení extraktu. Hodnoty se pohybují mezi 0 60 %. Čím vyšší hodnota MP (%), tím je vyšší podíl taninů ze semen a nebezpečí negativního ovlivnění v chuti. (ROEDIGER 2006; RIBÉREAU-GAYON et al. 2006). 3.4.4 Cromoenos metoda Tato nová metoda vyţaduje zvláštní vybavení a činidla. Pro tuto metodu jsou zapotřebí 2 reagenty. 40 ml hroznového extraktu bylo převedeno do thermoextraktoru po přidání 1 ml reagentu A a 4 ml reagentu B a 40 ml deionizované vody. Jakmile teplota dosáhne 80 C, odebere se 1 ml vzorku a ten se odstředí. 60 µl odstředěného vzorku se smíchá s 4 ml 2% HCL a je měřena absorbance při 280 a 520 nm. Současně se tento roztok pouţívá pro stanovení obsahu antokyaninů a celkový obsah fenolických sloučenin. Tato metoda je časově velmi perspektivní, vyţaduje asi 10 minut práce (KONTOUDAKIS, 2010). 3.4.5 NIRS (Near infrared reflectance spectroscopy) Je to nedestruktivní, rychlá a přesná metoda. Bez potřeby chemických látek. Bylo prokázáno, ţe NIRS je dobrá analytická metoda pro stanovení fenolických sloučenin a dalších bioaktivních látek v potravinách. Tato metoda můţe být pouţita k měření kyseliny glukonové, glycerolu, rozpustné sušiny a ph v hroznovém moštu. Dále je schopna určit kondenzované taniny a antokyaniny. 26

Za pomocí této metody je moţné určit kvantifikaci celkových fenolických sloučenin ze slupky hroznu, nebo neporušené bobule během zrání. Bylo pouţito i srovnání s HPLC a rozdíly byly minimální v obsahu celkových fenolických látek. Nejlepší výsledky byly získány pomocí spektra z neporušeného hroznu. Výsledky jsou srovnatelné s drahými a časově náročnými analytickými metodami (MCGOVERIN; WEERANANTANAPHAN; DOWNEY&MANLEY; 2010; VERSARI; PARPINELLO; MATTIOLI&GALASSI, 2008 in FERRER-GALLEGO, 2011) Obr. 3: Spektrální pořízení fází přímo ve vinici (GUIDETTI et al. 2010) Obr. 4: Měření parametrů homogenizované složky (GUIDETTI et al. 2010) 27

3.4.6 Optické metody Většina známých metod pro měření fenolické zralosti je zaloţena na destruktivních metodách, prováděných v chemických laboratořích. Pro kontinuální měření zralosti jsou vhodnější metody nedestruktivní. Za tímto účelem byly vytvořeny nové optické metody. Principem je měření vybuzené chlorofylové fluorescence v ovoci, kdy se získají hodnoty flavonolů a antokyaninů bez narušení slupky bobule. Komerčně jsou pouţívány prototyp Multiplex a Dualex (CEROVIC et al., 2008). Obr. 5: Detailní pohled na optické zařízení a měření v terénu (NAIMA BEN GHOZLEN, 2010) 28

4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 Charakteristika stanoviště Pro odběr vzorků byla stanovena znojemská podoblast. Vinice se nachází ve vinařské obci Znojmo Oblekovice. Ve viniční trati Načeratický kopec, která je jedna z největších tratí na Znojemsku. Leţí v nadmořské výšce 226 280 m. UKZUZ (Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský) je majitelem této vinice. Průměrná roční teplota je 8,8 C. Běţný roční úhrn sráţek se pohybuje okolo 500 mm. Z geologického hlediska se jedná o štěrkopískovou terasu na zvětralině Dýjského masivu. Jedná se o písčito hlinitou hnědozem s 15 40 % skeletu. Výměra vinice je asi 2,2 ha. Nachází se zde všechny odrůdy zapsané v Státní odrůdové knize. Tato vinice také dále slouţí k registračním a ověřovacím zkouškám nových a povolených odrůd révy vinné. Spon je 2,5 x 1 m. Zimní řez je prováděn na jeden vodorovný taţeň + čípek. Vinice jsou ošetřovány podle zásad Integrované produkce hroznů. Není zde zavlaţovací systém a zelené práce jsou prováděny kombinací ručních a mechanických operací. 4.2 Odrůdy Byly zkoumány téměř všechny odrůdy zapsané v SOK (Státní odrůdová kniha). Hodnoceno bylo 20 modrých moštových odrůd a 24 bílých moštových odrůd. 4.3 Odběr vzorků pro stanovení analytických hodnot Odběr vzorků korespondoval se sklizní hroznů. Odrůdy byly ručně sklizeny do beden a odvezeny ke zpracování. Hrozny byly pomlety a okamţitě lisovány. Při lisovacím procesu byl odebrán vzorek moštu, který slouţil k následné analýze. Ve sklepních prostorách ihned po lisování proběhlo stanovení cukernatosti pomocí moštoměru. 4.4 Stanovení cukernatosti moštu areometry Skleněný areometr je měřící přístroj stálé hmotnosti v provedení bez teploměru nebo s teploměrem, který stanoví hloubku svého rovnováţného ponoru v měřené 29

kapalině za předepsaných podmínek její hustotu (hustoměry) nebo přímo koncentraci cukru v moštu (moštoměry). Přesnost měření je závislá na teplotě a povrchovém napětí měřené kapaliny. Jestliţe teplota měření se odlišuje od teploty poţadované, je třeba naměřenou hodnotu upravit podle příslušných korelačních tabulek. Pouţívaný areometr (moštoměr) měřil v ( NM) stupních normalizovaného moštoměru a udává kolik kg cukru je ve 100 l moštu (BALÍK, 2006). 4.5 Stanovení cukernatosti moštu refraktometricky Obsah cukru v moště je stanovován na základě měření indexu lomu světla Abbé refraktometrem jako rozpustnou sušinu moštu vyjádřenou v hmotnostních % sacharózy (BALÍK, 2006). 4.6 Stanovení veškerých titrovatelných kyselin Veškerými titrovatelnými kyselinami (veškerou kyselostí vína) se rozumí suma sloučenin titrovatelných odměrným alkalickým roztokem do ph 7. Kyselina uhličitá se do veškeré kyselosti nezahrnuje. Součástí titrační aparatury byla byreta, magnetická míchačka, kádinka a digitální ph metr. Pipetou bylo odměřeno 10 ml připraveného moštu do titrační kádinky, následně bylo přidáno 10 ml destilované vody a do směsi byla ponořena kombinovaná elektroda pro měření ph. Za stálého míchání pomalu bylo přidáváno z byrety 0,1 mol.l -1 roztoku NaOH do ph rovnající se hodnotě 7 při 20 C. Spotřebovaná hodnota se převede do vzorce. x = a x f x 0,75 x = obsah titrovatelných kyselin v g.l -1 jako kyselina vinná a = ml spotřebovaného 0,1 mol.l -1 roztoku NaOH f = faktor 0,1 mol.l -1 roztoku NaOH 4.7 Stanovení ph Hodnota ph je záporný dekadický logaritmus aktivity vodíkových kationů v moště nebo víně. Tuto hodnotu stanovujeme na základě potenciálu skleněné elektrody, jenţ závisí od aktivity vodíkových kationů, vzhledem k referenční 30

kalomelové elektrodě vhodným milivoltmetrem (ph - metrem), kalibrovaným tlumivými roztoky o známém ph (BALÍK, 2006). 4.8 Stanovení analytických hodnot pomocí FTIR technologie FTIR je zkratka z anglického slova Fourier transform infrared (spectroscopy) označující experimentální spektroskopickou techniku. Metoda je zaloţena na absorpci infračerveného záření při průchodu vzorkem, při které proběhnou změny rotačně vibračních energetických stavů molekuly v závislosti na změnách dipólového momentu molekuly. Výsledné infračervené spektrum je funkční závislostí energie, většinou vyjádřené v procentech transmitance nebo jednotkách absorbance na vlnové délce dopadajícího záření. Na stanici UKZUZ Znojmo-Oblekovice v oddělení vinohradnictví probíhalo měření analytických hodnot na přístroji BACCHUS II µ. Jedná se o analyzátor moštů a vína zaloţený na spektrometrii středního infračerveného spektra Fourierovými transformacemi (FTIR). Tato technologie umoţňuje kvantifikovat většinu parametrů v moštech a vínech odebráním a změřením jednotlivých vzorků. Tato technika je zaloţená na univerzálních kalibracích, nevyţaduje ţádné reagencie ani specifické přípravy vzorku. Tento přístroj byl vyvinut na základě poţadavků francouzských enologů k maximálnímu zjednodušení práce ve vinařských laboratořích a institutech. Moţnosti analyzátoru jsou velice široké a dá se říct, ţe je moţnost s ním nadstandardně a komplexně kontrolovat celý průběh technologie výroby vína od předsklizňových analýz hroznů aţ po lahvování a kontrolu vývoje nalahvovaného vína. Výhodou tohoto přístroje spočívá v jednoduchosti jeho obsluhy (není třeba odborného personálu). Provozní náklady jsou téměř nulové a není třeba dokupovat další kalibrace. U měřených moštů bylo stanoveno 6 kvalitativních parametrů (ph, celkové kyseliny, těkavé kyseliny, jablečná kyselina, asimilovatelný dusík a cukernatost). 31

Obr. 6: BACCHUS II µ 4.9 Stanovení analytických hodnot pomocí HPLC HPLC je zkratka pro kapalinovou chromatografii - analytickou fyzikálněchemickou separační metodu. Zkratka je odvozena od dvou přípustných názvů této techniky a to high performance liquid chromatography (vysokoúčinná kapalinová chromatografie) nebo high pressure liquid chromatography (vysokotlaká kapalinová chromatografie). Při stanovení cukrů a kyselin pomocí HPLC musí být vzorky moštu odstředěny (3000 otaček, 6 minut) a ředěny 10x demineralizovanou vodou. Pro výpočet cukrů je potřeba součet glukosy a fruktosy chromatografií s iontovou výlukou. Detekce při 190 nm. Pro stanovení organických kyselin je potřeba detekce při 210 nm. Měření na kapalinovém chromatografu probíhalo na Ústavu vinohradnictví a vinařství na Zahradnické fakultě v Lednici. Vzorky byly před měřením uchovány v mrazícím boxu. U daných vzorků byly měřeny cukry a organické kyseliny. Obr. 7: Kapalinový chromatograf 32

5. VÝSLEDKY PRÁCE 5.1 Srovnání analytických metod pro stanovení kvalitativních parametrů hroznů Pomocí vhodné metodiky jsem získal velké mnoţství výsledků. Jsou zde statisticky porovnávány analytické metody pro získání základních kvalitativních parametrů hroznů. Ke zpracování dat byly pouţity komerčně dostupné softwary EXCEL a STATISTICA 9,0. 5.1.1 Metody pro stanovení cukernatosti Jsou zde srovnávány nejběţnější metody pro stanovení cukernatosti. Byla prokázána korelace mezi jednotlivými metodami. To dokazuje korelační koeficient 0,78 s 95 % hladinou spolehlivosti. Graf 2 znázorňuje rozsah hodnot a jejich průměrnou hodnotu. Refraktometr 20 10 0 26 24 22 20 18 16 14 12 10 Bodový graf: Moštoměr vs. Refraktometr (Cukernatost) Refrakt. = -1,611 + 1,0209 * Moštom. Korelace : r =,78587 Moštoměr X: Prom1 N = 44 Průměr = 20,795455 Sm.Odch. = 1,727070 Max. = 24,500000 Min. = 17,000000 Y: Prom2 N = 44 Průměr = 19,618182 Sm.Odch. = 2,243468 Max. = 23,500000 Min. = 12,100000 8 14 16 18 20 22 24 26 28 0 10 20 95% hladina spolehlivosti Graf 1: Korelace mezi moštoměrem a refraktometrickým stanovením cukernatosti 33

26 Krabicový graf z více proměnných Tabulka1 2v*44c Hodnoty cukernatosti 24 22 20 18 16 14 12 10 Prom1 Prom2 Refraktometr vs. Moštoměr Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Graf 2: Srovnání metod pro stanovení cukernatosti 5.1.2 Metody pro stanovení ph Stanovení ph jako kvalitativního parametru hroznů je velmi jednoduché. Závislost mezi potenciometrickým stanovením ph a pomocí FTIR metody je velmi vysoká. Korelační koeficient je 0,93 s 95% hladinou spolehlivosti. Byla zjištěna vysoce pozitivní závislost. 34

20 10 Bodový graf: ph metr vs. ph FTIR ph FTIR = -2,473 + 1,7679 * ph metr Korelace : r =,93191 X: Prom1 N = 44 Průměr = 3,048182 Sm.Odch. = 0,153627 Max. = 3,510000 Min. = 2,760000 Y: Prom2 N = 44 Průměr = 2,915682 Sm.Odch. = 0,291439 Max. = 3,590000 Min. = 2,260000 ph - FTIR 0 4,0 3,8 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 2,0 1,8 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8 ph metr 0 10 20 95% hladina spolehlivosti Graf 3: Korelace mezi potenciometrickým stanovením ph a pomocí metody FTIR 3,8 Krabicový graf z více proměnných Tabulka2 2v*44c Hodnoty ph 3,6 3,4 3,2 3,0 2,8 2,6 2,4 2,2 Prom1 Prom2 ph metr vs. FTIR Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Graf 4: Srovnání metod pro stanovení ph 35

5.1.3 Metody pro stanovení kyseliny jablečné a celkových kyselin Pro stanovení kyseliny jablečné bylo pouţito kapalinové chromatografie a metody FTIR. Korelační koeficient je 0,81 s 95% hladinou spolehlivosti. Byla zjištěna pozitivní závislost. U celkových kyselin byla zvolena titrační metoda a FTIR technologie. U tohoto parametru činí korelační koeficient 0,83 s 95% hladinou spolehlivosti. Opět jsou tyto dvě metody na sobě závislé. 20 10 0 12 10 8 Bodový graf: HPLC vs. FTIR Kyselina jablečná (g.l-1) FTIR = -1,227 + 1,0763 * HPLC Korelace : r =,81703 X: Prom1 N = 44 Průměr = 5,745152 Sm.Odch. = 1,758928 Max. = 11,024000 Min. = 2,343333 Y: Prom2 N = 44 Průměr = 4,956818 Sm.Odch. = 2,317146 Max. = 9,900000 Min. = 0,200000 FTIR 6 4 2 0-2 0 2 4 6 8 10 12 14 HPLC 0 10 20 95% hladina spolehlivosti Graf 5: Korelace mezi metodou FTIR a HPLC u kyseliny jablečné 36

12 Krabicový graf z více proměnných Tabulka3 2v*44c Hodnoty kyseliny jablečné (g.l-1) 10 8 6 4 2 0-2 Prom1 HPLC vs. FTIR Prom2 Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Graf 6: Srovnání metod pro stanovení kyseliny jablečné 20 10 0 14 Bodový graf: Titrace vs. FTIR Celkové kyseliny (g.l-1) FTIR = 1,1670 +,64532 * Titrace Korelace : r =,83748 X: Prom1 N = 44 Průměr = 11,429545 Sm.Odch. = 2,286237 Max. = 16,820000 Min. = 6,500000 Y: Prom2 N = 44 Průměr = 8,542727 Sm.Odch. = 1,761663 Max. = 11,980000 Min. = 5,430000 12 10 FTIR 8 6 4 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0 10 20 Titrace 95% hladina spolehlivosti Graf 7: Korelace mezi FTIR a titračním stanovením veškerých kyselin 37

18 Krabicový graf z více proměnných Tabulka4 2v*44c Hodnoty celkových kyselin (g.l-1) 16 14 12 10 8 6 4 Prom1 Prom2 Titrace vs. FTIR Medián 25%-75% Rozsah neodleh. Odlehlé Extrémy Graf 8: Porovnání metod pro stanovení celkových kyselin 38

6. DISKUSE Jednotlivé kvalitativní parametry hroznů byly porovnávány různými analytickými metodami. Měření bylo prováděno na stanici ÚKZUZ Znojmo Oblekovice a na Ústavu vinohradnictví a vinařství Zahradnické fakulty v Lednici na Moravě. Celkem byly měřeny čtyři parametry (cukernatost, ph, kyselina jablečná a celkové kyseliny) za pomoci pěti analytických metod (refraktometrie, areometrie, titrace, potenciometrické stanovení ph, technologie HPLC a FTIR). Cukernatost byla měřena pomocí refraktometru a moštoměru. Z bodového grafu v sekci 5.1.1 vyplynulo, ţe tyto metody jsou na sobě závislé. Refraktometrické stanovení cukernatosti je zaloţené na indexu lomu světla, tato metoda je tedy velmi jednoduchá a rychlá. Je vhodná pro předběţné zjištění cukernatosti přímo ve vinici. Statisticky tato metoda vykazovala vyšší hodnoty, jak je patrné z grafu 2. Průměrná hodnota obsahu cukrů měřená refraktometricky byla u všech odrůd 20,7 NM, pomocí moštoměru to bylo 19,6 NM. Situační a výhledová zpráva pro révu vinnou a víno uvádí, ţe průměrná cukernatost moštových odrůd byla 19,8 NM pro rok 2010. V případě stanovení cukernatosti pomocí moštoměru se na výsledné hodnotě podílí i ostatní látky obsaţené v moštu, tedy nejen cukry. Moštoměr neměří koncentraci cukrů v moštu, ale jeho hustotu. Cukernatost je nejdůleţitějším parametrem pro klasifikaci vín pouţívaný v České republice. Stanovení tohoto parametru je tedy nezbytné. Refraktometr zajišťuje rychlé a okamţité měření. Z výsledků této práce vyplývá, ţe vedle těchto výhod je to metoda i spolehlivá a objektivní. Ovšem velmi záleţí na kvalitě odebraného a měřeného vzorku. Co se týče moštoměru, tak je to metoda uţ zaběhnutá v praxi. Pro správné stanovení je důleţité dodrţet teplotu měřeného moštu. Stanovení ph bylo stanoveno potenciometricky a pomocí FTIR technologie. Bodový graf v sekci 5.1.2 ukazuje vysoce pozitivní závislost mezi jednotlivými metodami. V průběhu zrání hroznů se mění hodnota ph v rozsahu 2,8 3,5 a někdy i výrazněji v závislosti na odrůdě, ročníku a průběhu počasí. Vzhledem ke větší zkušenosti s potenciometrickým měřením ph je stanovení ph pomocí FTIR technologie ještě v oblasti bádání a porovnávání výsledků. Průměrná hodnota ph stanovená potenciometricky byla 3,04. Pomocí FTIR technologie to bylo 2,91. Graf 4 vykazuje průměrně vyšší hodnoty potenciometrického měření ph. Stanovení kyseliny jablečné bylo stanoveno technologii FTIR a HPLC. Bodový graf v sekci 5.1.3 naznačuje pozitivní závislost mezi těmito metodami. Vinařský rok 39

2010 byl charakteristický vysokým obsahem organických kyselin a obzvláště kyselinou jablečnou. Kyselina jablečná je kyselina, která poskytuje hroznům a vínu zelenou chuť, s ostrými, hrubými, nezralými tóny. Procentuální poměr kyseliny vinné vztaţen na kyselinu jablečnou se podle rychlosti vyzrávání jednotlivých odrůd pohyboval zhruba mezi 50 % u velmi raných odrůd aţ téměř k 200% u velmi pozdních odrůd, které prostě v daném roce nedozrály (KUMŠTA, 2011). Průměrná hodnota měřená pomocí HPLC je 5,75 g.l -1 kyseliny jablečné. FTIR technologie vykazovala průměrnou hodnotu 4,95 g.l -1. Obsah celkových kyselin byl stanovován titračně a pomocí FTIR technologie. Bodový graf v sekci 5.1.3 naznačuje opět pozitivní závislost mezi jednotlivými metodami. Kyseliny stanovené titračně vyjadřují mnoţství volných karboxylových skupin vyjádřených jako kyselina vinná. Průměrná hodnota celkových kyselin stanovených titračně byla 11,4 g.l -1. U FTIR to byla průměrná hodnota 8,54 g.l -1. Celkově přístroj BACCHUS II µ, který vyuţívá právě FTIR technologii, vykazoval průměrně niţší hodnoty u ph, kyseliny jablečné a celkových kyselin. Ovšem s výrazně vyšším rozptylem hodnot. Tato metoda v podmínkách České republiky je relativně nová a dostatečně neprozkoumaná. Výhoda spočívá zejména v rychlosti stanovení kompletních výsledků a není potřeba vyškoleného personálu. 40

7. ZÁVĚR V roce 2010 byly vyhodnocovány kvalitativní parametry pomocí dostupných analytických metod. Byla sledována cukernatost, ph, obsah kyseliny jablečné a obsah celkových kyselin. Jsou to nejzákladnější parametry pro stanovení optimálního termínu sklizně. Bylo analyzováno celkem 44 odrůd z toho 24 bílých moštových a 20 modrých moštových odrůd. Stanovení pomocí FTIR technologie probíhalo 24 hodin po vylisování. Potenciometrické měření ph a měření na kapalinovém chromatogramu se odehrálo o 2 měsíce později. Vzorky moštů byly uchovány v mrazícím boxu. Na výsledných hodnotách jednotlivých parametrů byla provedena korelace v programu STATISTICA 9,0. Neustále rozvíjející se obor chemie dává širokou moţnost vyuţití analytických přístrojů dostupných na trhu. Stanovení cukernatosti moštoměrem a refraktometricky. Potenciometrické měření ph, měření titrovatelných kyselin. Všechny tyto metody a jejich pořizovací cena jsou víceméně lehce dostupné pro malý či střední vinařský podnik. HPLC je velmi sloţitý přístroj umoţňující stanovení mnoha látek. Díky jeho velikosti je nepřenosný, pořizovací náklady vysoké a přímé vyuţití ve vinařské praxi je problematické. Metoda zaloţená na FTIR technologii je také značně nákladná a zkušenosti s objektivitou hodnocení malé. 41