MASARYKOVA UNIVERZITA. Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta BAKALÁŘSKÁ PRÁCE Brno 2015 Evelína Gahurová

MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie Genetické aspekty konopí Bakalářská práce Evelína Gahurová VEDOUCÍ PRÁCE: MVDr. Ing. Václav Trojan, Ph.D Brno 2015

Bibliografický záznam Autor: Název práce: Studijní program: Studijní obor: Vedoucí práce: Evelína Gahurová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie Genetické aspekty konopí bakalářský Molekulární biologie a genetika MVDr. Ing. Václav Trojan, Ph.D. Akademický rok: 2014/2015 Počet stran: 45 Klíčová slova: Cannabis, kanabinoidy, chemotypy, markery

Bibliographic Entry Author: Title of Thesis: Evelína Gahurová Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology Genetic aspects of Cannabis Degree Programme: bachelor Field of Study: Supervisor: Molecular Biology and Genetics MVDr. Ing. Václav Trojan, Ph.D. Academic Year: 2014/2015 Number of Pages: 45 Keywords: Cannabis, cannabinoids, chemotype, markers

Abstrakt Práce je zaměřena na popis genetické variability rodu Cannabis a metody molekulární biologie sloužící k identifikaci. Nedílnou součástí práce je popis hlavních kanabinoidů, jakožto sekundárních metabolitů konopí a jejich biosyntéza. Součástí práce je také popis karyotypu a genetická charakteristika zahrnující počet a popis chromozomů u konopí. V práci jsou taktéž zmíněny chemické fenotypy konopí. Poslední část práce se zabývá metodami molekulární biologie, konkrétně molekulárními markery. Markery jsou využívány nejen k určování fylogenetických vztahů, ale také pro šlechtění u markery asistované selekce a především k identifikaci genů. Abstract The thesis is focused on the description of genetic variability of genus Cannabis and molecular methods used for identification. An integral part of thesis is a description of main cannabinoids as secondary metabolites of Cannabis and their biosynthesis. The part of thesis is also the description of karyotype and genetic characterization including number and description chromosomes in Cannabis. Chemical phenotypes of Cannabis are also mentioned in the thesis. The very last part of thesis deals with methods of molecular biology, in particular molecular markers. Markers are not used only for determination of phylogenetic relations but they are also used for breeding in marker assisted selection, and specifically for identification of genes.

Poděkování Na tomto místě bych ráda poděkovala svému školiteli MVDr. Ing. Václavovi Trojanovi, Ph.D. a Bc. Kateřině Tejkalové za strávený čas a rady, které mně věnovali.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 5. 5. 2015. Evelína Gahurová

Obsah: 1. Úvod... 11 2. Historie výskytu a využití Cannabis... 12 2.1. Historie... 12 2.2 Využití... 13 3. Popis a charakteristika Cannabis... 15 3.1 Klasifikace... 15 3.2 Obecná charakteristika... 16 3.3 Karyotyp a genetická charakteristika... 16 4. Sekundární metabolity... 19 4.1 Endokanabinoidy a endokanabinoidní systém... 19 4.2 Fytokanabinoidy... 20 4.3 Chemické fenotypy... 22 5. Metody molekulární biologie využívané při studiu genetické variability... 24 5.1 Starší molekulární metody bez využití PCR... 24 5.1.1 Izoenzymy... 24 5.1.2 RFLP markery... 24 5.2 Markery založené na PCR... 25 5.2.1 RAPD markery... 25 5.2.2 AFLP markery... 26 5.2.3 Mikrosatelity... 27 5.2.4 EST-SSR markery... 29 5.2.5 ITS markery... 30 5.2.6 ISSR markery... 31 5.2.7 SNP markery... 31 6. Závěr... 33 7. Literatura... 35

Seznam zkratek AFLP amplified fragment length polymorphism polymorfismus délek amplifikovaných fragmentů BSA bulked segregant analysis bulková segregační analýza CBC cannabichromene kanabichromen CBCA cannabichromene acid kyselina kanabichromenová CBD cannabidiol kanabidiol CBDA cannabidiolic acid kyselina kanabidiolová CBDAS cannabidiolic acid synthase syntáza kyseliny kanabidiolové CBG cannabigerol kanabigerol CBGA cannabigerolic acid kyselina kanabigerolová CBN cannabinol kannabinol cdna complementary DNA komplementární DNA EST expressed sequence tag místa s expresní adresou HPLC high-performance liquid chromatography vysokoúčinná kapalinová chromatografie ISSR inter simple sequence repeat polymorfismus sekvencí mezi dvěma mikrosatelity ITIS Integrated Taxonomic Information Systém Integrovaný taxonomický informační systém ITS internal transcribed spacer vnitřní přepisovaný mezerník LINE long interspersed nuclear elements dlouhé rozptýlené jaderné elementy MAS marker assisted selection/marker aided selection markery asistovaná selekce MADC1, MADC2, MADC3, MADC4, MADC5, MADC6 Male-associated DNA sequence in C. sativa DNA sekvence spojované se samčím pohlavím u C. sativa NCBI National Center for Biotechnology Information Národní centrum pro biotechnologické informace nor nucleolus organizer region organizátor jadérka PCR polymerase chain reaction polymerázová řetězová reakce RAPD randomly amplified polymorphic DNA polymorfismus náhodně amplifikované DNA RFLP restriction fragment length polymorphism polymorfismus délek restrikčních fragmentů

sat satellite satelity SCAR sequence characterized amplified region sekvenčně specifická amplifikovaná oblast SNP single nucleotide polymorphism jednonukleotidový polymorfismus STR short tandem repetitions krátké tandemové repetice (mikrosatelity) SSR simple sequence repeat opakování jednoduchých sekvencí THC Δ 9 -tetrahydrocannabinol delta-9-trans-tetrahydrokanabinol THCA tetrahydrocannabinolic acid kyselina tetrahydrokanabinolová THCAS tetrahydrocannabinolic acid synthese syntáza kyseliny tetrahydrokanabinolové THCV tetrahydrocannabivarin tetrahydrokanabivarin

1. Úvod Cannabis sativa je jednoletá rostlina, u níž se vyskytuje dvoudomost, ale také jednodomost. C. sativa má bohatou a rozmanitou historii nejen v pěstování, ale také použití. V minulosti dle jednotné úmluvy OSN o omamných látkách z r. 1961 bylo pěstování konopí zakázáno po celém světě. Od r. 2001 dle Evropské komise (European Commission, nařízení č. 2860/2000) je v Evropské Unii povoleno pěstovat konopí typu fiber s obsahem THC nižší než 0,2 %. Konopí s obsahem do 0,2 % THC je bráno jako zemědělské (další užívané názvy technické, průmyslové konopí), jehož pěstování a uchovávání je legální. Obsahuje-li více než 0,2 % THC, je tento typ konopí nazýván drug a je považován za omamnou látku. Typ drug je používán pro lékařské účely. V České republice dle zákona č. 167/1998 Sb. je povoleno pěstovat konopí s obsahem do 0,3 % THC a zároveň s ohlašovací povinností při osetí pěstitelské plochy nad 100 m 2. V roce 2013 přichází změna v podobě novely zákona z r. 1998, kdy je konopí povoleno pro lékařské účely. První část mé bakalářské práce je věnována historii a využití konopí, kde jsou shrnuty poznatky o použití konopí v minulosti a současnosti. Dále také poznatky o potenciálním využití konopí u léčby různých onemocněních například spasticky u roztroušené sklerózy (Novotna et al., 2011), určitých typů nádorů (Munson et al., 1975). Následující kapitoly se zabývají popisem, charakteristikou konopí a jeho sekundárními metabolity. Tyto metabolity jsou důležité nejen pro lékařské účely, ale také pro rozlišování chemických fenotypů konopí k posouzení ilegality konopí. Poslední kapitola je zaměřena na molekulární metody zabývající se studiem genetické variability. Cílem bakalářské práce je shrnout současné a dostupné poznatky zabývající se popisem metod využívaných v molekulární biologii k určování genetické variability u Cannabis. 11

2. Historie výskytu a využití Cannabis 2.1. Historie První dochované zmínky o Cannabis pocházejí z Asie, konkrétně z Číny. Jak uvedl Li (1974), jsou tyto záznamy z doby 6000 před n. l. Touw (1981) naproti tomu tvrdil, že první zmínky o Cannabis a jeho pěstování jsou nejasné. Přiklání se k názoru, že jako první byla Cannabis použita ve Střední Asii a šířila se dále na jih a východ, nikoliv v Číně, jak uvedl Li (1974). Z toho tedy usuzoval, že by i původ mohl být ve Střední Asii. Cannabis měla v Číně hojné využití. Používala se zejména vlákna rostlin, která byla dále užita na výrobu lan, textilu, rybářských sítí a provazů. Dále se vlákna využívala jako surovina k výrobě papíru. Významné byla také semena konopí, z kterých byl získáván olej využíván nejen na smažení, ale také v průmyslovém odvětví. Nedílnou součástí bylo medicínské využití, kdy se využívaly listy, plody a kořeny. V neposlední řadě byla rostlina používána jako droga s halucinogenními účinky (Li, 1974). Cannabis byla také hojně používána v Indii, kde sloužila nejen pro medicínské účely, ale také při náboženských rituálech. Dále se konopí využívalo v Tibetu, Persii a psychoaktivní účinky konopí znali také Asyřané (Touw, 1981). Do Evropy se Cannabis dostala ještě před naším letopočtem, kdy ji přinášejí Skytové migrující ze Střední Asie. V roce 405 před n. l. se Herodotos zmiňoval o pohřbu pořádaném Skyty, kteří používali semena konopí k rituálům a navození euforie (Aldrich, 1997). Začátkem našeho letopočtu bylo stále velmi často využíváno konopí v Indii a začalo se dále šířit na Blízký východ a do Afriky. Konopí bylo v tomto období známé také v arabské kultuře, kde Avicenna zmiňuje jeho použití v medicíně jako diuretikum (lék pro zvýšení vylučování moči), dále také lék pro lepší zažívání (Fankhauser, 2002). V r. 1150 muslimové představili výrobu papíru z konopí ve Španělsku, později také v Itálii. V tomto období se konopí v Evropě pěstovalo zejména pro vlákninu, lékařské využití bylo poměrně vzácné (Aldrich, 1997). V 19. století se běžně v Evropě používala semena konopí, dále se také konopí využívalo jako homeopatikum. Na začátku 20. století se naopak použití konopí pro lékařské účely snižuje (Fankhauser, 2002). 12

2.2 Využití Konopí má mnohé využití. Jedním z nich je ekonomické použití. Po tisíce let se konopí využívalo jako zdroj vlákniny, paliva a výživy. Z vlákniny se vyrábí oblečení, lana, plátna a papír. Ze semen se získává olej, který se následně uplatňuje v kosmetickém průmyslu, dále se z něj vyrábějí barvy a laky. Z vlákniny konopí se mimo jiné vyrábí cigaretový papír, technické filtry, čajové svíčky, hygienické produkty a bankovky. Mezi méně tradiční využití konopných vláken patří například výroba nových nanostrukturních polymerů (Piluzza et al., 2013; Pommet et al., 2008). Kromě ekonomického a technického využití se konopí využívá pro lékařské, ale také rekreační účely. Z hlediska lékařských účelů má konopí pestré využití. Používá se k léčbě zeleného zákalu, bolesti, depresí, astma, žaludečních potížích, nespavosti (Coyle et al., 2003). Konopí může být užíváno v různých formách, buď jako herba (sušená samičí květenství), ve formě extraktů (přírodní fytokanabinoidy) nebo syntetických fytokanabinoidů. Herbální medicína (fytoterapie) využívá k léčbě rostlinné přípravky. U konopí se používá výraz léčivá droga (usušená část rostliny nebo produkty metabolismu, které slouží k léčebným účelům) marihuana (usušené samičí květenství, případně smícháno s většími listy). Čím vyšší je podíl květů, tím je potence (obsah psychoaktivních látek) marihuany vyšší. Hlavní výhodou užívání fytoterapeutik je méně vedlejších účinků ve srovnání s běžnými léčivy. Jednou z nevýhod použití fytoterapeutik konopí je, že nelze přesně stanovit obsah kanabinoidů. Je tedy nutné u jednotlivých variet konopí stanovit jejich chemické složení. Tímto problémem se zabývali Hazekamp a Fischedick (2012), kteří se poprvé snažili z různých kultivarů (vyšlechtěná rostlina, odrůda) Cannabis získat chemické složení nejen hlavních kanabinoidů. V Evropě se zabývá pěstováním léčebného konopí firma Bedrocan BV sídlící v Holandsku. Bedrocan poskytuje sušenou drogu (Cannabis flos), kterou lze získat na lékařský předpis. Jejich rostliny mají odlišný obsah dvou hlavních kanabinoidů tzv. chemovary Bedrocan, Bedrobinol, Bediol, Bedica a Bedrolite (www.bedrocan.nl). Rostlinný materiál může být podáván ve více formách. Jednou z nich je vaporizace (kapalné, pevné skupenství přeměno na plynné) pomocí vaporizéru. Dalším typem podávání je perorální aplikace (součást jídla), jiným typem je forma odvaru. Dávky u jednotlivých typů podávání se mohou lišit. Ve farmakologii se využívají fytokanabinoidy (viz. kap. 4.2), které mají velký potencionál ve vývoji léků. Syntetických fytokanabinoidů existuje celá řada. Z těchto syntetických fytokanabinoidů se vyrábějí kanabinoidní přípravky dostupné pro pacienty 13

na lékařský předpis. Přípravky z konopí mají velké terapeutické využití, mezi něž patří neuroprotektivní, protizánětlivé a antispastické (uvolňující křeče hladkého svalstva) účinky. Tyto přípravky jsou také dále využívány i u některých psychiatrických onemocněních. Příkladem je Munson et al. (1975), kteří se zabývali antineoplastickými (protinádorovými) účinky kanabinoidů. Zjistili, že kanabinoidy mohou pozastavovat růst určitých typů nádorů (například Lewisův plicní karcinom). Kanabinoidní preparáty jsou dostupné v některých zemích a jsou dostupné ve formě kapslí, tablet, případně ve formě orálního spreje. THC (viz. kap. 4.2) má potenciální využití například v léčbě maligního gliomu (Sanchez et al., 2001). THC je v lékařské terminologii označován pod názvem dronabinol. Syntetický dronabinol je dostupný v některých zemích (USA, Kanada) na předpis pod názvem Marinol ve formě kapslí. Tento přípravek je používán u pacientů podstupující cytostatickou léčbu, která u nich vyvolává zvracení a nevolnosti (Meiri et al., 2007; Hanus, 2009). Beal et al. (1995) uvedli, že dronabinol podporuje také chuť k jídlu u pacientů s AIDS podstupující imunosupresivní léčbu. Další léky dostupné na předpis ve formě kapslí jsou Cesamet (dostupný v Kanadě, Velké Británii, USA a Mexiku) a Canemes (Rakousko), u nichž je účinná látka nabilon syntetický kanabinoid s antiemetickými (tlumící nevolnosti) a analgetickými (úlevě od bolesti) účinky. Tyto léky se používají u pacientů s rakovinou trpící vedlejšími účinky (zvracení a nevolností) při chemoterapii. Berlach et al. (2006) popsali, že nabinol může pozitivně ovlivňovat také nespavost, bolest a zvracení u pacientů s chronickou bolestí nerakovinného typu (chronic noncancer pain). Novotna et al. (2011) publikovali studii zabývající se léčbou spasticity u pacientů s roztroušenou sklerózou. Díky této studii byl v Německu schválen extrakt z konopí pod názvem Nabiximols (komerční název Sativex) obsahující THC a CBD v poměru 1:1 k léčbě pacientů s příznaky spasticity a dalšími příznaky s roztroušenou sklerózou. Přípravek Sativex ve formě orálního spreje je také schválen v České republice, Dánsku, Švédsku, Velké Británii a v dalších zemích. Nejnovější přípravek Namisol, kde účinnou látkou je dronabinol (obsahující více než 98 % čistého THC). Přípravek Namisol má být teprve uveden na trh. Namisol je podáván ve formě tablet. Tento přípravek je určen k léčbě spasticky u roztroušené sklerózy, kde byla předešlá léčba neúspěšná. Dále k poruchám chování u Alzheimerovy choroby, k léčbě neuropatické (postihující klouby) a chronické bolesti (Klumpers et al., 2012; Ahmed et al., 2015). 14

3. Popis a charakteristika Cannabis 3.1 Klasifikace Cannabis je jednoletá dvoudomá bylina se vzpřímenou lodyhou. Vyskytují se ovšem i rostliny jednodomé. U Cannabis se nachází šlechtěné i divoké typy, které se výrazně liší po morfologické stránce. Tyto odlišnosti mají za následek nejasnosti v taxonomickém zařazení. Někteří autoři uvádí Cannabis jako monotypický rod, zatímco jiní tvrdí, že sestává ze dvou druhů Cannabis sativa a C. indica. Dle Integrovaného taxonomického informačního systému (ITIS) patří C. sativa L. (konopí seté) do čeledi konopovitých (Cannabaceae), do řádu růžotvarých (Rosales), dále podruhy Cannabis sativa ssp. indica a Cannabis sativa ssp. sativa L. K Cannabis sativa ssp. sativa L. se řadí variety Cannabis sativa var. sativa L. a Cannabis sativa var. spontanea Vavilov (http://www.itis.gov). Toto řazení je ovšem stále diskutabilní. Kromě výše zmíněných variet existuje i mnoho kultivarů Cannabis. Obvykle lze rozeznat tři hlavní skupiny Cannabis sativa, indica a ruderalis. Nejvýznamnější z těchto tří skupin je sativa, která je dále rozdělena do dvou podskupin. První podskupinu tvoří Cannabis sativa, která má psychoaktivní účinky. Druhá podskupina zahrnuje Cannabis sativa L., která postrádá psychoaktivní účinky. C. sativa L. pojmenoval Carl Linnaeus v r. 1753. Druhá skupina představuje indica, jejímž objevitelem je Jean- Baptiste Lamarck. Poslední skupinu reprezentuje ruderalis, pojmenována v r. 1924 objevitelem Janischeviskym (Warf, 2014). Tyto skupiny lze od sebe odlišit podle vzhledu a patří mezi nejčastěji popisované. Sativa je obvykle vyšší s více větvemi a zastupuje spíše konopí typu fibre. Indica naproti tomu je nižší, má široké listy a využívá se pro lékařské účely (Fischedick et al., 2010). Poslední skupinu tvořící ruderalis se vyznačuje nízkým obsahem kanabinoidů, vypadající jako keř (Hillig a Mahlberg, 2004). Small a Cronquist (1976) tvrdili, že k rodu Cannabis se řadí dva podruhy sativa a indica. Tyto podruhy bylo možné dále rozdělit na tzv. divoký (zdomácnělý, původní) a domestikovaný (kultivovaný, spontánní) typ (Tab. č. 1). Problematické řazení a nejasnosti vedly ke zkoumání různých variant uvnitř rodu Cannabis na základě molekulárních markerů. 15

Tab. č. 1: Klasifikace Cannabis sativa (upraveno podle Small a Cronquist, 1976) 3.2 Obecná charakteristika C. sativa vykazuje pohlavní dimorfizmus, přičemž na jedné rostlině se tvoří samčí a na druhé samičí květenství. Obecně jsou samčí rostliny vyšší, útlejší a mají také kratší životní cyklus v porovnání se samičími rostlinami. Samčí květenství tvoří latu, která může být větvená. Květenství je dále složeno z variabilního počtu květů. Samčí květy jsou složeny z 5 okvětních lístků s významnými tyčinkami, většinou bez listů. Z prašníku dospělé rostliny se uvolňuje pyl, který je přenášen větrem. Naproti tomu samičí květy jsou spíše nenápadnější a mají jednodušší strukturu (Moliterni et al., 2004). 3.3 Karyotyp a genetická charakteristika Ming et al. (2011) uvedli, že pro Cannabis sativa je charakteristický systém XX/XY, kde samičí pohlaví je homogametické (XX) a samčí heterogametické (XY). C. sativa má dvě sady chromozomů (2n = 20), karyotyp se skládá z 18 autozomů a jednoho páru pohlavních chromozomů (X nebo Y). Dle Sakamoto et al. (1998) je přibližná délka haploidního samičího genomu 818 Mb 16

a pro samčí genom je 843 Mb, rozdíl je způsoben dlouhým raménkem chromozomu Y. Chromozomy u C. sativa mají malou velikost, liší se od 2.6 do 3.8 µm. Chromozomy lze rozlišit pomocí jejich délky a umístění centromery (Obr. č. 2). Autozomální sada obsahuje 8 párů metacentrických chromozomů (m) a jeden pár submetacentrických chromozomů (sm) obsahující satelity (sat) a organizátor jadérka (nor). Pro samčí rostliny je tedy u C. sativa formulován haploidní karyotyp (Obr. č. 1) jako 8m + 1sm (sat) + Xm/Ym, pro samičí rostliny 8m + 1sm (sat) + Xm (Divashuk et al., 2014). Obr. č. 1: Karyotyp C. sativa samčí a samičí rostliny červeně zbarveny subtelometrické repetice CS-1 (upraveno podle Divashuk et al., 2014) Obr. č. 2: Idiogram haploidní sady chromozomů u C. sativa. Chromozomy obsahují subtelometrické CS-1 repetice, telomerické repetice typu Arabidopsis, dále 45S rdna, 5S rdna (upraveno podle Divashuk et al., 2014) 17

U Cannabis je chromozom Y subtelocentrický, je u něho typický satelit vyskytující se na konci krátkého ramene a je zřejmě příčinou odlišné délky samčího a samičího genomu. Chromozom X je submetacentrický a je možné nalézt na jeho krátkém konci satelit. Chromozom Y v porovnání s chromozomem X je větší, což je u savců naopak (Sakamoto et al., 1998). Ukázalo se, že v terminální oblasti chromozomu Y je uloženo 100 až 200 kopií dlouhých rozptýlených jaderných elementů (LINE) retrotranspozonů s repetitivními sekvencemi. Bylo potvrzeno, že se retrotranspozony náhodně inzertují do variabilní oblasti v genomu. Z jakého důvodu jsou uloženy právě v terminální oblasti chromozomu Y je nejasné, ale pravděpodobně jejich uložení v této oblasti stojí za větší délkou chromozomu Y (Sakamoto et al., 2000). Sakamoto et al. (1995) za použití polymorfismu náhodně amplifikované DNA (RAPD) (viz. kap. 5.2.1) objevili specifickou nukleotidovou sekvenci, která je charakteristická pouze pro samčí pohlaví. Tato sekvence byla nazvána DNA sekvence spojovaná se samčím pohlavím u C. sativa (MADC1). Sekvence MADC1 nezahrnuje dlouhé otevřené čtecí rámce. V r. 2011 došlo k prvnímu osekvenování genomu C. sativa dostupné v Národním centru pro biotechnologické informace (NCBI) s kódem AGQN00000000 (Van Bakel et al., 2011). 18

4. Sekundární metabolity Sekundární metabolity jsou organické látky, které rostlina nutně nepotřebuje ke svému životu, jsou tedy pro rostlinu neesenciální. Mezi sekundární metabolity Cannabis patří kanabinoidy, alkaloidy, flavonoidy, stilbenoidy a mnohé další (Flores-Sanchez a Verpoorte, 2008). Do r. 2009 bylo izolováno 525 sloučenin z Cannabis sativa L. (Radwan et al., 2009). Kanabinoidy jsou řazeny do tří skupin. První skupinu tvoří endogenní kanabinoidy (endokanabinoidy), které jsou syntetizovány v lidském těle a také u živočichů. Druhou skupinu představují rostlinné kanabinoidy (fytokanabinoidy). Poslední skupinou jsou syntetické kanabinoidy (Fisar, 2009). 4.1 Endokanabinoidy a endokanabinoidní systém Endokanabinoidní systém lidského těla je složen z kanabinoidních receptorů, dále jejich endogenních ligandů a enzymů, metabolizující tyto ligandy. V r. 1988 byl identifikován CB1 receptor (Devane et al., 1988) a v r. 1990 došlo k jeho naklonování (Matsuda et al., 1990). Následně v r. 1993 došlo k naklonování receptoru CB2 (Munro et al., 1993). Kanabinoidní receptory (CB1 a CB2) patřící do skupiny receptorů jsou spojeny s G-proteinem (Devane et al., 1988). CB1 receptor je kódovaný genem CNR1. CB1 receptor působí v mozku, konkrétně ovlivňuje míchu, hypofýzu, ale také štítnou žlázu a nadledvinky. Dále má vliv na tukové, jaterní a svalové buňky, trávicí trakt, ledviny, plíce, srdce a reprodukční orgány (Pertwee, 1997). Receptor CB2 je spojen s imunitním systémem (Howlett et al., 2002). CB2 receptor se nachází především v buňkách a orgánech imunitního systému. Tento receptor nemá spojitost s psychoaktivními účinky kanabinoidů na rozdíl od receptoru CB1. CB2 receptor je kódován genem CNR2 a jeho aminokyselinová sekvence je tvořena přibližně 360 amynokyselinami. Recepetory CB1 a CB2 vykazují 44% shodu v aminokyselinových sekvencích (Munro et al., 1993). CB2 receptor a některé prvky endokanabinoidního systému mají potenciální terapeutické využití v souvislosti s neurodegenerativními změnani u Alzheimerovy nemoci (Benito et al., 2003). Aktivace CB2 receptoru nebo další přídavných mechanismů může přispět k léčbě Parkinsonovy choroby (García-Arencibia et al., 2007). 19

Patrně se vyskytuje ještě další kanabinoidní receptor, který vykazuje vazodilatační účinky (Begg et al., 2005; Offertáler et al., 2003). Agonisté (látka, která po navázání na receptor vyvolávající fyziologické změny s biologickým významem) endogenních kanabinoidních receptorů syntetizovaných živočišnou tkání se nazývají endokanabinoidy. Mezi nejvýznamnějšími endokanabioidy patří anandamid (arachidonoylethanolamid) a 2-arachidonoylglycerol (Devane et al., 1992; Mechoulam et al., 1995). Selektivní agonisté receptoru CB2 mají potenciál v terapeutickém využití kanabinoidů, zejména pro analgetické (proti bolesti), protizánětlivé a protirakovinné účinky. 4.2 Fytokanabinoidy Hillig a Mahlberg (2004) popsali kanabinoidy jako terpenofenolické sloučeniny typické pouze pro rostliny konopí. Kanabinoidy jsou produkovány v trichomech, kde jsou syntetizovány na povrchu listů rostlin. Mezi nejvíce prostudované kanabinoidy patří THC (delta-9-trans-tetrahydrokanabinol) a CBD (kanabidiol). Gaoni a Mechoulam (1964) popsali chemickou strukturu THC (Obr. č. 3). Uvedli také, že THC má psychoaktivní účinky. THC se řadí mezi omamné látky, proto je obsah THC důležitým faktorem pro rozlišení chemického fenotypu rostliny. V r. 1940 došlo k izolaci CBD (Obr. č. 3), chemická struktura byla objasněna v r. 1963 (Mechoulam a Shvo, 1963). Obr. č. 3: Chemická struktura THC a CBD (upraveno podle Hillig a Mahlberg, 2004) Obsah THC se liší v samičím květenství je obsah THC nejvyšší, nižší obsah vykazují listy a nejméně THC je obsaženo ve stonku. Naproti tomu semena a kořeny neobsahují kanabinoidy. Záleží také na konkrétním vývojovém stádiu rostliny a dále 20

na podmínkách prostředí. Dlouhodobé skladování způsobuje částečné znehodnocení THC světlem, teplotou a přítomností kyslíku (Lindholst, 2010). Tetrahydrokanabivarin (THCV) je homolog THC a vyskytuje se u Cannabis. THCV působící jako antagonista (látka vázající se na receptor, ale nevyvolávající biologickou odpověď) receptoru CB1 a CB2 (Thomas et al., 2005), (viz. kap. 4.1). CBD nemá psychoaktivní účinky a nedokáže aktivovat receptory CB1 a CB2, na rozdíl od THC. Englund et al. (2013) tvrdí, že CBD může potlačovat nežádoucí psychoaktivní účinky THC. CBD má tedy terapeutické účinky, zejména ve spojitosti s CB1 a CB2 receptory. V 70. letech 20. století došlo ke studiu biosyntézy kanabinoidů (Shoyama et al., 1975). Bylo zjištěno, že z geranylu pyrofosfátu a kyseliny olivetové vzniká kyselina kanabigerolová (CBGA). CBGA slouží jako substrát pro syntázu kyseliny kanabidiolové (CBDAS) a syntázu tetrahydrokanabinolové kyseliny (THCAS) (Fellermeier a Zenk, 1998). Z CBGA za přítomnosti THCAS vzniká tetrahydrokanabinolová kyselina (THCA), případně kyselina kanabidiolová (CBDA) za přítomnosti CBDAS (Obr. č. 4) (Morimoto et al., 1998; Taura et al., 1996; Fellermeier et al., 2001). Obr. č. 4: Biosyntéza kanabinoidních kyselin (1) isopentenyl difosfát, (2) dimethylalyl difosfát, (3) geranyl difosfát, (4) olivetová kyselina, (5) CBGA, (6) CBCA, (7) THCA, (8) CBDA (Fellermeier et al., 2001) 21

Neutrální kanabinoidy jsou v rostlinách méně obsaženy. Ve větší koncentraci se v rostlinách nacházejí karboxylové kyseliny, ze kterých jsou kanabinoidy syntetizovány. V rostlině se kanabinoidy vyskytují ve formě kanabinoidních kyselin (THCA, CBDA). Kanabinoidy v neutrální formě vznikají dekarboxylací přímo v rostlině nebo po vysušení. Z THCA vzniká dekarboxylací neutrální forma THC, obdobně z CBDA vzniká dekarboxylací CBD (Mechoulam a Ben-Shabat, 1999). 4.3 Chemické fenotypy Jedním ze způsobů, jak lze rozdělit poddruhy Cannabis sativa je pomocí chemických fenotypů podle obsahu THC, CBN (kannabinol) a CBD a použitím vzorce: x = [THC] + [CBN] / [CBD]. Fetterman et al. (1971) stanovili dva typy chemotypů u Cannabis sativa. První chemický fenotyp byl typ drug, kde poměr (x) byl vyšší než 1 a převládající typem kanabinoidu byl THC. Druhý chemický fenotyp byl typ fiber, kde převládající látkou byl CBD a poměr (x) je menší než 1. Konopí typu drug, které má vyšší obsah THC je velmi těžce morfologicky rozeznatelné od typu fiber s nižším obsahem THC. Typ drug (marihuana) byl v r. 2008 nejvíce nelegálně užívaná droga na světě (Howard et al. 2008). Small et al. (1975) definovali tři fenotypy dle obsahu THC a CBD. Fenotyp I obsahoval více než 0,3 % THC a méně než 0,5 % CBD. Fenotyp III obsahoval méně než 0,3 % THC a fenotyp II zahrnoval více než 0,3 % THC a více než 0,5 % CBD. Poté stanovili také čvrtý fenotyp. De Meijer et al. (2003) pozorovali tři chemotypy a pomocí analýzy RAPD (viz. kap. 5.2.1) zjistili, že dědičnost je určena jedním lokusem B se dvěma kodominantními alelami (BT a BD). Chemotyp rostlin typu fiber (CBD) má genotyp BD / BD, zatímco chemotyp rostlin typu drug (THC) vykazuje genotyp BT / BT. Chemotyp rostlin typu intermediate (CBD/THC) je heterozygot s BD / BT alelami. Po křížení rostlin typu fiber a drug bylo potomstvo heterozygotní (CBD/THC). V F2 generaci byl zjištěn Mendelovský štěpný poměr 1:2:1, kdy vznikly chemotypy (CBD:CBD/THC:THC). Dále De Meijer a Hammond (2005) se zabývali dědičností určitého chemotypu, konkrétně se snažili vysvětlit genetický mechanismus, který je zodpovědný za akumulaci kanabigerolu (CBG). Model konverze CBG, který slouží jako prekurzor THC a CBD je shrnut v obr. č. 5. Akumulace CBG je řízena alelou B0, která se vyvinula z alely BD. Z toho tedy vyplývá, že drug chemotyp (THC) může vykazovat genotyp nejen BT / BT, ale také genotyp BT / B0, totéž platí u fiber chemotypu (CBD) mající genotyp BD / BD a BD / B0. 22

et al., 2009a) Obr. č. 5: Model pro regulaci odlišné konverze CBG (V) (upraveno podle De Meijer De Meijer et al. (2009a) stanovili genetický faktor, který zabraňuje biosyntéze kanabinoidu. U homozygotů s alelami 0 / 0 probíhá normální syntéza kanabinoidu, kdežto u homozygotů s recesivní nulovou alelou o / o dochází k zástavě syntézy. U heterozygotů 0 / o je syntéza silně potlačena. Recesivní alela o je označována také jako vyřazovací (knockout) alela, která slouží k inaktivaci určitého genu a segreguje se nezávisle na předchozích lokusech. Vyřazovací alela může být využita při zkoumání léčiv u Cannabis. De Meijer et al. (2009b) zkoumali mechamismus, který řídí podíl kanabichromenu (CBC), který má potenciální farmaceutické využití, v celkovém podílu kanabinoidu u C. sativa. CBC převládá u mladých rostlin a jeho obsah se snižuje s dospíváním rostliny. U některých variant rostlin se nachází prolonged juvenile chemotyp, který je příčinou značného obsahu CBC přetrvávajícího až do dospělosti rostlin. Tento chemotyp je spojen s určitými fenotypovými znaky a je determinován lokusem C nebo BC a není závislý na lokusu B. Locus C kóduje CBC syntázu, která přeměňuje CBG (V) na CBC (V). Aktivita CBC syntázy v porovnání s CBD a THC syntázou je proměnlivá, vysokou aktivitu lze pozorovat u mladých rostlin. 23

5. Metody molekulární biologie využívané při studiu genetické variability Při studiu genetické variability se v molekulární biologii využívají zejména molekulární markery. Tyto molekulární markery jsou založeny na detekci sekvenčního polymorfizmu DNA, přičemž je můžeme rozdělit na přímé a nepřímé metody. Mezi přímé metody se řadí sekvenování a metody pro detekce SNP. Nepřímé metody založené na fingerprintingu (otisku DNA) zahrnují například RFLP, AFLP markery. Jiné dělení může být dle analýzy markerů na markery využívající PCR a markery založené na hybridizaci. Markery slouží k sestavování map, kde je polymorfizmus v nukleotidové sekvenci dostačující. Dále jsou markery vhodné pro identifikaci genů a fylogenetické studie. Markery jsou také uplatněny při markery asistované selekce (MAS). U rostlin se DNA vyskytuje ve dvou formách jaderná a mimojaderná, u Cannabis je zkoumána chloropastová DNA. 5.1 Starší molekulární metody bez využití PCR 5.1.1 Izoenzymy Mezi nejstarší používané molekulární markery, využívané ve šlechtění rostlin a v určování vztahů mezi populacemi, patří izoenzymy (Lewontin a Hubby, 1966). Izoenzymy (izozymy) jsou enzymy, které pocházejí z jednoho organismu, lišící se svým složením a jsou umístěny na odlišných lokusech. Izoenzymy jsou schopné katalyzovat stejnou reakci a lze je detekovat pomocí různých technik, mezi něž patří například elektroforéza. Alloenzymy (allozymy) jsou enzymy, které jsou podmíněny různými alelami na stejném lokuse. Výhodou používání izoenzymů je, že jsou reprodukovatelné, ale získání čitelného pattern vzorku může být technicky náročné. Hillig (2005) analyzoval allozymy ze 157 vzorků Cannabis. 5.1.2 RFLP markery Další metodou, která byla použita u Cannabis, je metoda využívající polymorfismu délek restrikčních fragmentů (RFLP). Markery RFLP jsou kodominantní a vysoce polymorfní. RFLP je založená na rozštěpení a rozpoznávání vzorků DNA dvou a více jedinců 24

stejného druhu. RFLP metoda využívá restrikčních endonukleáz a je založena na rozdílu restrikčních fragmentů vzniklých po rozštěpení endonukleázami. Po separaci na agarovém gelu následuje hybridizace imobilizovaných fragmentů s radioaktivně značenou sondou. Tato metoda RFLP se využívala nejvíce v polovině 90. let 20. století, ale při studiu genetické variability Cannabis se neosvědčila. Nebyly stanoveny žádné RFLP markery u konopí a ani v r. 2004 nebyly známy ani žádné molekulární mapy s využitím RFLP markerů u Cannabis (Mandolino a Carboni, 2004). 5.2 Markery založené na PCR 5.2.1 RAPD markery S objevem polymerázové řetězové reakce (PCR) v r. 1983 se metoda RFLP přestala využívat. Od r. 1990 se začaly využívat RAPD markery (Williams et al., 1990). RAPD je založená na PCR, která využívá krátké primery (obvykle 10 bází dlouhých) s náhodnou sekvencí. Jsou-li k dispozici dvě totožná místa pro nasednutí primeru na protilehlých DNA řetězcích, dojde k vytvoření produktu PCR. Následně tyto produkty PCR jsou odděleny na agarovém gelu a jsou obarveny ethidiem bromidem. Sakamoto et al. (1995) za použití metody RAPD objevili MADC1 (viz. kap. 3.3). Předpokládali, že gen určující samčí nebo potlačující samičí pohlaví se nachází pouze na chromozomu Y. Jagadish et al. (1996) využili metodu RAPD k rozlišení 51 vzorků C. sativa z různých zdrojů. Jako výsledek získali amplifikované fragmenty vzorků, které vykazovaly jasné rozdíly mezi vzorky, byly také informativní a opakovatelné. Dále také doložili, že RAPD je užitečná pro forenzní studie u rostlin. Gillan et al. (1995) provedli srovnání metody vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) a RAPD. Pomocí HPLC byly identifikované rostliny rozděleny do 3 skupin. V rámci těchto tří skupin, dvě skupiny nešly vzájemně rozlišit. Za pomoci metody RAPD bylo možné rozlišit všechny skupiny kromě dvou rostlin. Byla tedy dokázána vyšší rozlišovací schopnost metody RAPD (než pouhé využití samotné metody HPLC). Shirota et al. (1998) využili kombinaci metod RAPD a RFLP. Za pomoci metody RFLP ze 14 vzorků genomické DNA Cannabis bylo získáno 23 odlišných pruhů Těchto 14 vzorků bylo rozštěpeno za pomocí 6 různých restrikčních endonukleáz. Za použití metody RFLP nebylo možné pozorovat genetickou variabilitu mezi jednotlivými kmeny (vzorky) Cannabis, ale za použití metody RAPD byly viditelné mezidruhové rozdíly (intra-kmenové). 25

Tato kombinace metod RFLP a RAPD se ukázala být vhodná k rozlišení mezi chemotypy drug, intermediate a fiber typů. Další práce zabývající se genetickou strukturou a variabilitou pomocí RAPD markerů využívala 6 variant vzorků C. sativa, z každé varianty bylo použito 10 rostlin. Tato práce doložila, že se nemusí brát zřetel na pohlaví rostliny a štěpný poměr během výběru vzorků pro identifikaci. Dále také uvedli, že stupeň polymorfismu RAPD markerů pro odlišné varianty mohl být od 31,1 % až po 97,1 % (Forapani et al., 2001). Jednou z nevýhod RAPD metody je její nízká reprodukovatelnost mezi laboratořemi, z toho důvodu byla také objevena nová metoda pro sekvenčně specifickou amplifikovanou oblast (SCAR), která je přesnější. Umožňuje rychlou identifikaci zejména u jednodomého konopí a u samčích rostlin během procesu plánovaného rozmnožování. SCAR markery mohou mít využití u časného screeningu, dále také mohou sloužit k určení obsahu kanabinoidů, kvality vlákniny a rovněž mohou být potenciálně využity u MAS. Díky této metodě byla identifikována další nukleotidová sekvence MADC2, opět neobsahovala žádné dlouhé otevřené čtecí rámce (Mandolino et al., 1999). Törjék et al. (2002) identifikovali SCAR markery MADC5 a MADC6. Dva primery (OPD05 and UBC354) vytvořily specifické pruhy u samčích rostlin. Tyto dva DNA fragmenty byly izolovány, naklonovány a sekvenovány. Oba markery se ukázaly být doposud neznámé, byly pojmenovány MADC3 (OPD05961) and MADC4 (UBC354151). Poté tyto markery byly pomocí metody SCAR přeměněny na SCAR markery, které korelovaly s pohlavím u segregující F2 populace a byla prokázána úzká spojitost se samčím fenotypem. Tyto vytvořené SCAR markery byly nazvány (SCAR323 MADC5 a SCAR119 MADC6) dohledatelné v NCBI s kódy AF364954 (MADC5) a AF364955 (MADC6). Využitím bulkové segregační analýzy (BSA) a metody RAPD byly popsány tři markery spojované s chemotypy. Dva markery byly spojovány s THC (OPB061000 a OPA072100) a jeden s CBD (UBC109620). Pomocí metody SCAR byl odvozen marker B190/B200 z markeru OPB061000. Marker B190/B200 se ukázal být kodominantní (De Meijer et al., 2003). 5.2.2 AFLP markery Metoda založená na polymorfismu délek amplifikovaných fragmentů (AFLP) se využívá k stanovení fylogenetických vztahů a genetické variability. Výhodou této metody je, že lze aplikovat na DNA jakéhokoliv původu a složitosti. AFLP spočívá v kombinaci použití restrikčních enzymů a PCR. 26

Základem AFLP je detekce genomových restrikčních fragmentů. Na začátku je DNA rozštěpena díky restrikčním enzymům a dvouvláknové adaptéry (krátký oligonukleoid připojen k DNA, poskytující vazebné místo pro primer při amplifikaci neznámé nukleové kyselině) se vážou na konce DNA fragmentů. Následně je vytvořen templát DNA. Sekvence adapterů a přilehlé restrikční místo slouží jako vazebné místo pro primer k amplifikaci restrikčních fragmentů. Metoda zahrnuje tři základní kroky. Prvním z nich je restrikce DNA a navázání oligonukleotidových adaptérů. Dále navazuje selektivní amplifikace sady restrikčních fragmentů. Posledním krokem je gelová analýza amplifikovaných fragmentů. Díky této metodě je možno sady restrikčních fragmentů zobrazit, aniž bychom potřebovali znát jejich nukleotidovou sekvenci. Pomocí AFLP lze analyzovat více fragmentů současně. Obvykle je možno na polyakrylamidovém gelu amplifikovat a detekovat 50 100 restrikčních fragmentů (Vos et al., 1995). AFLP markery se používají více než RAPD, polymorfismus sekvencí mezi dvěma mikrosatelity (ISSR) a mikrosatelity z důvodu detekovatelnosti vyššího počtu pruhů (McGregor et al., 2002). Dalším důvodem používání AFLP markerů je jejich větší opakovatelnost ve srovnání s RAPD a ISSR markery (Ferdinandez a Coulman, 2002). Flachowsky et al. (2001) použili metodu AFLP, aby identifikovali pohlavní markery u konopí. Dále uvedli, že AFLP markery jsou vhodné pro konstrukci genetické mapy pro konopí. V rámci této studie objevili velký počet markerů specifických pro samčí rostliny. AFLP markery byly využity pro rozlišení nelegální a legálních kultivarů Cannabis. Datwyler a Weiblen (2006) označili metodu AFLP za nejúčinnější metodu pro rozlišování kultivarů Cannabis, protože existuje větší počet markerů ve srovnání se STR (krátkými tandemovými repeticemi), RAPD metodami. 5.2.3 Mikrosatelity Mikrosatelity STR, opakování jednoduchých sekvencí (SSR) jsou velmi variabilní a jsou proto vhodné pro identifikaci. Pomocí STR je také možné určit genetickou příbuznost odlišných rostlin. STR jsou repetitivní sekvence, které jsou složeny až z 6 bází v definovaném genetickém lokusu. Počet opakování repetic se může pohybovat v rozmezí 2 až 100 bp, například CTCTCTCTCTCTCT (Weber a May, 1989). Obvykle se mikrosatelity nacházejí v nekódujících oblastech autozomální nebo gonozomální DNA (Köhnemann et al., 2012). Vysoká úroveň polymorfizmu mikrosatelitů u jednotlivců je zajištěna díky replikačnímu 27

skluzu (nepřesnému spárování řetězců vedoucí k expanzi repetice nebo vzniku kličky, což má za následek zmenšení repetice) (Levinson a Gutman, 1987). Gilmore a Peakall (2003) idetifikovali 15 mikrosatelitů u Cannabis sativa ze 48 vzorků. Tvrdili, že tyto mikrosatelity byly hypervariabilní a informativní. Dále potvrdili, že jsou užitečné pro rozlišování genetické variability a také pro forenzní analýzy. Alghanim a Almirall (2003) vytvořili 11 mikrosatelitů 3 STR dinukteotidové motivy a 8 mikroatelitů trinukleotiodových motivů. Dále uvedli, že tyto mikrosatelity jsou užitečné pro určování genetické příbuznosti u konopí. Dinukleotidy GA/CT představují 50 % všech mikrosatelitů nalezených u C. sativa. Dále se u konopí vyskytují trinukleotidy GTT/CAA, které tvoří 16 %, 15 % jsou zastoupeny trinukleotidy AAG/TTC a nejméně (10 %) se vyskytující trinukleotidy jsou GAT/CTA (tab. č. 2). Tab. č. 2: Charakteristika mikrosatelitů u Cannabis sativa (upraveno podle Alghanim a Almirall, 2003). Hsieh et al. (2003) izolovali mikrosatelity, které obsahovaly jednoduché repetitivní motivy složené ze 6 bp. Pro sestrojení primeru byla použita flanking DNA. Tato flanking DNA byla 90 bází dlouhá na 5 konci a na konci 3 pouze obsahovala 26 bází. Köhnemann et al. (2012) stanovili 15 STR markerů u Cannabis. Dále uvedli, že tato metoda je rychlá a tyto STR markery mohou pomoci zejména policii při vyšetřování nelegálního obchodu s konopím. Celkově jsou mikrosatelity u Cannabis sativa L. shrnuty v tabulce č. 3. 28

Tab. č. 3: Mikrosatelity známé u Cannabis sativa L. (upraveno podle Mandolino a Carboni, 2004). 5.2.4 EST-SSR markery Místa s expresní adresou (EST) jsou sekvence, které jsou odvozeny z klonů cdna. V databázi NCBI jsou dostupné EST sekvence, konkrétně u Cannabis sativa je k dispozici 12 903 EST sekvencí. EST sekvence mohou posloužit pro tvorbu markerů, například SSR. Tento způsob identifikace SSR markerů je rychlý a levný. EST-SSR markery mohou být přímo spojeny s geny. Tato metoda identifikace SSR markerů založených na EST se stala jednou z důležitých metod v analýze genetické rozmanitosti, identifikace genotypů a u MAS (Wei et al., 2011). 29

Gao et al. (2014) identifikovali 3 442 EST-SSR makerů. Nejvíce vyskytující se motivy byly trinukleotidové AAG/CTT (17,96 %), následovány dinukleotidovými motivy AG/CT (12,89 %), dále trinukleotidové motivy AAT/ATT (8,63 %). Nejméně se vyskytující byly trinukleotidové motivy AGC/CGT (1,03 %) (Tab. č. 4). Alghanim a Almirall (2003) uvedli, že dinukleotidy GA/CT jsou nejvíce zastoupeny (50 %) ze všech mikrosatelitů nalezených u C. sativa. Gao et al. (2014) tvrdili, že nejhojnější jsou trinukleotidové AAG/CTT (17,96 %). Rozdíl může být způsoben využitím odlišných technik při vývoji SSR markerů. Alghanim a Almirall (2003) použili sondu, kdežto Gao et al. (2014) využili databázi transkriptomu. Tab. č. 4: Četnost výskytu EST-SSR markerů u Cannabis založená na počtech motivů (upraveno podle Gao et al., 2014). 5.2.5 ITS markery Další metodou používanou pro identifikaci Cannabis sativa L. je metoda srovnávání sekvencí jaderné ribozomální DNA vnitřní přepisované mezerníky (ITS1 a ITS2) (Siniscalco Gigliano et al., 1997). Siniscalco Gigliano (1998) provedl konstrukci restrikční mapy fragmentů PCR obsahující kompletní ITS2 sekvenci u Cannabis. Metoda ITS je velmi senzitivní, postačuje malé množství rostlinného materiálu (50 mg) k spolehlivému určení Cannabis. Celkově bylo použito 7 různých restrikčních endonukleáz, délka fragmentů ITS2 byla 218 bp. Autor zároveň navrhuje využití mapy ve forenzní praxi, nikoliv v laboratoři k rutinnímu použití. Kohjyouma et al. (2000) provedli analýzu nukleotidových sekvencí v nekódující oblasti chloroplastové DNA. Zaměřili se také na ITS. Dospěli k závěru, že ITS markery jsou vhodné pro určování genetické variability u Cannabis sativa. 30