Helicobacter pylori Výskyt a diagnostika ve FN Motol. Absolventská práce

Helicobacter pylori Výskyt a diagnostika ve FN Motol Absolventská práce Kateřina Vyskočilová Vyšší odborná škola zdravotnická a Střední zdravotnická škola Praha 1, Alšovo nábřeží 6 Studijní obor: Diplomovaný zdravotní laborant Vedoucí práce: MUDr. Jana Matějková Datum odevzdání práce: 23. dubna 2020 Datum obhajoby: červen 2020 Praha 2020

Prohlašuji, že jsem absolventskou práci vypracovala samostatně a všechny použité prameny jsem uvedla podle platného autorského zákona v seznamu použité literatury a zdrojů informací. Praha 23. dubna 2020 Podpis:

Děkuji MUDr. Janě Matějkové za odborné vedení absolventské práce. Děkuji také zaměstnancům mikrobiologické laboratoře ve Fakultní nemocnici v Motole za získání zkušeností během školní praxe a cenné rady při zpracování této práce.

Souhlasím s tím, aby moje absolventská práce byla půjčována v knihovně Vyšší odborné školy zdravotnické a Střední zdravotnické školy, Praha 1, Alšovo nábřeží 6. Podpis

Abstrakt VYSKOČILOVÁ, Kateřina. Helicobacter pylori Výskyt a diagnostika ve FN Motol. Praha 2020. Absolventská práce. VOŠ a SZŠ Praha 1. Vedoucí absolventské práce MUDr. Jana Matějková Helicobacter pylori je gramnegativní spirálovitá bakterie, způsobující celosvětově rozšířené infekce. Zodpovědná je především za svou souvislost s rozvojem chronické gastritidy, vředového onemocnění žaludku a duodena, a dále je také obávaným kancerogenem žaludku [2]. K průkazu H. pylori se používají invazivní a neinvazivní testy, které se od sebe vzájemně liší způsobem odběru biologického materiálu. Cílem předkládané absolventské práce bylo v rámci období od 1. 1. 2019 do 31. 12. 2019 pomocí těchto testů prokázat přítomnost bakterie ve vzorku pacienta a porovnat, která laboratorní metoda je pro záchyt bakterie nejvhodnější. V mikrobiologické laboratoři ve FN Motol bylo celkem přijato 1021 vzorků k ověření přítomnosti H. pylori. Práce se zaměřovala především na metody přímého průkazu bakterie. U vzorků pacientů byly nejčastěji prováděny 3 laboratorní metody: mikroskopie, test na průkaz ureázy a kultivace. Z celkového počtu vzorků se prokázala pomocí těchto testů pozitivita pouze u 21 pacientů. K potvrzení přítomnosti bakterie byla také využívána metoda vyšetření antigenu H. pylori ze vzorku stolice. Dalším cílem této práce bylo v rámci zmiňovaného období zpracování statistik, vycházejících z dat, poskytnutých pracovištěm. Cílem těchto statistik bylo např. zjištění, jak vysoký je počet pacientů, jejichž vzorky byly vyšetřovány v jedné z největších nemocnic v České republice ve Fakultní nemocnici v Motole. Statistiky se dále zabývaly výskytem infekce, způsobené H. pylori, v závislosti na věku pacientů, pohlaví či počtem onemocnění v rámci jednotlivých ročních období. V závislosti na pohlaví nepředstavoval záchyt infekce významný statistický údaj. Z hlediska pohlaví z celkových 1021 vyšetřovaných vzorků se jednalo o 531 žen a 490 mužů. Pozitivita se prokázala však pouze u 21 vzorků, 11 mužů (52 %) a 10 žen (48 %). Nejvyšší výskyt onemocnění byl zaznamenán v podzimních a jarních měsících. Největší výskyt infekce z hlediska věku byl zjištěn u věkové skupiny osob nad 61 let, zatímco u věkové kategorie do 20 let byl výskyt bakterie zaznamenán pouze u jednoho pacienta. Klíčová slova: Helicobacter pylori, chronická gastritida, vředové onemocnění, kancerogen, invazivní a neinvazivní testy, laboratorní metody

Abstract VYSKOČILOVÁ, Kateřina. Helicobacter pylori Prevalence and Diagnostics in Motol University Hospital. Prague 2020. Thesis. VOŠ a SZŠ Praha 1. Tutor MUDr. Jana Matějková Helicobacter pylori is a gram-negative, spiral-shaped bacterium, which causes worldwide infections. It is primarily responsible for some cases like chronic gastritis and gastric and duodenal ulcers. In addition, it plays an important role in stomach cancer [2]. Invasive and non-invasive tests are usually used to detect H. pylori, each of them has a different way to collect a biological material. The purpose of this thesis was to discover the evidence of the bacterium in samples from tested patients during 1. 1. 2019 to 31. 12. 2019, and to compare which laboratory method is the most suitable to detect this particular bacterium. The microbiological laboratory in Motol University Hospital received 1021 samples altogether to detect H. pylori. This thesis was focused mainly on methods of direct detection of the bacterium. The samples from patients were performed by the three most common methods like microscopy, urease test and cultivation. The results showed that only 21 patients were positive from the total. Furthermore, the H. pylori antigen test method from stool sample also confirmed the presence of this bacterium. The next purpose of this thesis was to provide statistical output from 1. 1. 2019 to 31. 12. 2019 based on the data issued by the workplace. The aim of this statistics was to find out the samples which were examined in one of the largest hospitals in the Czech Republic the Motol University Hospital. Statistics dealt with the prevalence of infections caused by H. pylori according to the patients' age, gender or number of diseases in a single season. Finally the data output showed that gender didn t play an important role in prevalence of this infection. In aspect of gender, out of the total number of 1021 samples 531 were women and 490 men. During this research, only 21 samples were positive. Eleven patients (52%) were men and ten patients (48%) women. The highest prevalence of infection was recorded in autumn and spring. The highest prevalence of the infection in terms of age was found in the age group of people over 61 years, while at ages under 20 years, the infection caused by this bacterium affected 1 patient only. Key words: Helicobacter pylori, Chronic Gastritis, Ulcers, Gastric Cancer, Invasive and noninvasive Tests, Laboratory Methods

Obsah Úvod... 9 1 Literární přehled... 10 1.1 Helicobacter pylori... 10 1.2 Cesty přenosu... 11 1.3 Etiopatogeneze... 11 1.4 Historie... 12 1.5 Typy onemocnění způsobené Helicobacter pylori... 13 1.6 Typy odběru biologického materiálu pro diagnostiku Helicobacter pylori... 19 1.7 Laboratorní diagnostika Helicobacter pylori... 21 1.7.1 Mikroskopie... 21 1.7.2 Kultivace... 21 1.7.3 Rychlý ureázový test... 22 1.7.4 Průkaz antigenu ve stolici... 22 1.7.5 Dechový test... 23 1.7.6 Ostatní metody... 24 1.8 Léčba infekce způsobené Helicobacter pylori... 25 1.9 Preventivní opatření... 27 2 Praktická část... 28 2.1 Preanalytická fáze... 28 2.2 Analytická fáze... 29 2.3 Laboratorní diagnostika Helicobacter pylori... 31 2.3.1 Stanovení produkce ureázy... 31 2.3.2 Zhotovení preparátu a mikroskopie... 33 2.3.3 Kultivace... 36 2.3.4 Hmotnostní spektofotometrie MALDI-TOF... 37 2.3.5 Stanovení citlivosti na antibiotika... 38 2.3.6 Průkaz Helicobacter pylori ve stolici... 40 2.4 Postanalytická fáze... 42 3 Statistické údaje... 43 4 Diskuze... 53 Závěr... 57

Seznam zkratek... 58 Seznam obrázků, tabulek a grafů... 59 Seznam použité literatury a zdrojů informací... 60

Úvod Na výběr tématu předkládané absolventské práce s názvem Helicobacter pylori Výskyt a diagnostika ve FN Motol měl vliv nejen můj zájem o tuto problematiku, ale také skutečnost, že infekci, způsobenou touto bakterií, prodělal i jeden z členů mé blízké rodiny. H. pylori je významný patogen, který je původcem řady onemocnění. Bakterie vstupuje do těla dutinou ústní a množí se v žaludku. H. pylori je zodpovědný především za chronickou gastritidu, žaludeční vředy a duodenální vředy. Zároveň je obávaným kancerogenem. Kromě adenokarcinomu žaludku způsobuje vzácné onemocnění - MALT lymfom. Jako jediná bakterie je prohlášena WHO organizací za kancerogen I. třídy. Dle odborné literatury bakterie kolonizuje žaludeční sliznici až jedné poloviny světové populace a ročně umírá na infekci způsobenou helikobakterem až 1 milion lidí [2, 19]. H. pylori se vyznačuje oproti jiným mikrobům atypickými biochemickými a kultivačními vlastnostmi. Proto je cílem teoretické části zvýšit všeobecné povědomí o dané problematice, správné laboratorní diagnostice a vhodné terapii. Během vykonávané dvouměsíční praxe v mikrobiologické laboratoři ve Fakultní nemocnici v Motole jsem měla možnost seznámit se s rutinní laboratorní diagnostikou H. pylori. První oddíl praktické části absolventské práce popisuje metodiku vykonávané práce (preanalytickou, analytickou a postanalytickou fázi). Cílem druhé poloviny praktické části bylo ověřit přítomnost bakterie pomocí jednotlivých laboratorních metod, zaměřených převážně na přímý průkaz bakterie a následně vyhodnotit, která metoda je k průkazu nejcitlivější. Závěr praktické části se soustřeďuje na statistické zpracování údajů, sbíraných po dobu dvanácti měsíců, které mi byly poskytnuty pracovištěm. Předmětem diskuze bylo zhodnocení jednotlivých statistik, které vycházely z poskytnutých údajů pracovištěm, zhodnocení dostupných metod pro ověření H. pylori a doporučení vhodných laboratorních metod a event. jejich kombinace. 9

1 Literární přehled 1.1 Helicobacter pylori Rod Helicobacter patří do subpopulace Proteobacteria, řádu Campylobacterales, čeledi Helicobacteraceae. Helicobacter pylori je gramnegativní tyčinka se zahnutým, či spirálovitým tvarem. Jedná se o fakultativně anaerobní tyčinky, jejichž délka je mezi 2-4 μm a šířka 0,5 1 μm. Bakterie často tvoří svazek 3-5 bičíků (Obrázek 1). Bičíky jsou dlouhé kolem 30 μm, a umožňují snadný pohyb v žaludečním hlenu. Bičík má na svém konci rozšířený tvar, který připomíná paličku, a je uložen unipolárně [1, 2, 11, 30]. Helicobacter pylori je velmi odolný vůči zevnímu prostředí. Od ostatních bakterií se liší svými charakteristickými biochemickými vlastnostmi. Tato bakterie nefermentuje cukry. Je charakteristická zejména svou vysokou ureázovou aktivitou. Mimo ureázu také produkuje další enzymy - například katalázu, oxidázu, kyselou a alkalickou fosfatázu, či fosfolipázu [1, 2, 31]. Obrázek 1 Helicobacter pylori pod elektronovým mikroskopem Zdroj: [13] 10

1.2 Cesty přenosu Bakterie je lidským patogenem, přenosným pouze z člověka na člověka. Přenos může proběhnout cestou přímou a nepřímou. Přímá cesta se může uskutečnit z matky na plod skrz placentu. Nepřímá cesta probíhá prostřednictvím kontaminovaných předmětů, infikovanou potravou, či vodou [1, 6]. Přenos bakterie může být fekálně-orální, orálně-orální, či iatrogenní. Fekálně-orální přenos H. pylori se uplatňuje především v rozvojových zemích, v závislosti na faktorech, jako je socioekonomický status, věk a geografická oblast. Pro vyspělé země s lepšími možnostmi správné hygieny probíhá přenos spíše orálně-orální cestou, kdy se bakterie vyskytuje u infikovaných osob v dutině ústní. Méně častým přenosem je přenos iatrogenní, který může být způsoben chybou ze strany zdravotnického personálu. V případě přenosu H. pylori tak může jít o přenos např. prostřednictvím nevydezinfikovaného endoskopu a dalších přístrojů, které lékař používá při vyšetření žaludku, a neprošly kvalitními dekontaminačními procesy, jako je sterilizace či dezinfekce [1, 8, 10, 11, 22]. 1.3 Etiopatogeneze Helicobacter pylori kolonizuje žaludeční sliznici až jedné poloviny světové populace. Na vzniku infekce se podílí řada jevů, které ovlivňují její frekvenci výskytu [19]. Významným problémem je nízký sociálně-ekonomický status obyvatelstva a špatné hygienické návyky. K tomuto dochází nejčastěji v rozvojových zemích, např. v Asii či Africe s prevalencí více než 80%. Při zvyšování socioekonomické úrovně její výskyt výrazně klesá. K šíření infekce dochází též v celých rodinách. Vlivem této skutečnosti může docházet k získání infekce již v dětství [6, 8, 11, 16, 26]. Infekce, způsobené H. pylori, postihují zejména dospělé a starší osoby. Nejčastější věkovou skupinou s predispozicí ke vzniku onemocnění jsou osoby starší 50 let. Jedná-li se o nosiče helikobakterové infekce, onemocnění se nemusí projevit žádnými typickými příznaky [16, 22, 26]. 11

1.4 Historie V rámci bakteriologických výzkumů a vyšetření po dlouhá léta platilo, že jsou bakteriemi osídlené všechny sliznice, kromě žaludeční. Předpokládalo se, že je ph žaludku natolik kyselé, že pro bakterie představuje abiotické prostředí. V průběhu postupných výzkumů se však potvrdil na žaludeční sliznici nález spirálovitých bakterií s bičíky [26]. V oboru gastroenterologie je jedním z největších úspěchů za posledních padesát let odhalení bakterie Helicobacter pylori. V medicíně se tak jedná o jeden z nejpodstatnějších objevů, který objasnil původce nemoci, její průběh, prognózu, a přispěl tím k možnosti vhodné léčby [1]. Zkoumáním neznámé bakterie, vyskytující se v žaludku pacientů, se v letech 1982-1983 zabývali australští lékaři - gastroenterolog Barry James Marshall a patolog Robin Warren, za pomoci mikrobiologa Stewarda Goodwina. Kultivace H. pylori byla velmi náročná. Bakterii se nedařilo vykultivovat po inkubaci 48 hodin při standardním postupu. O Velikonocích roku 1982 vědci zapomněli odečíst kultivační plotny. Po návratu k výzkumu, po 5 dnech volna, zjistili, že kolonie bakterií narostly na zapomenutých kultivačních plotnách. Během výzkumu dále zjistili, že se bakterie vyskytuje u pacientů, kteří trpěli zánětem žaludeční sliznice a peptickými vředy [1, 6, 22]. Bakterie byla podrobně zkoumána z hlediska morfologie, biochemických vlastností a její patogenity. Během pozorování ve světelném mikroskopu byla podle doktora Warrena blízká bakterii s názvem Campylobacter jejuni. Časem se však díky kvalitnějšímu elektronovému mikroskopu prokázalo, že má tato nová bakterie 3-5 obalených bičíků, na rozdíl od kampylobaktera, který má pouze 1 neobalený bičík. V rámci výzkumu byly prokázány další významné biochemické vlastnosti: neschopnost štěpení cukrů a mikroaerofilie. Jelikož těmito vlastnostmi připomínala rod Campylobacter, doktor Marshall proto bakterii označil jako Campylobacter pyloridis. Tento název byl časem upraven na Campylobacter pylori. Název Helicobacter pylori, který oficiálně bakterie získala roku 1989, se odvíjel od jejího spirálovitého tvaru (helix = spirála), a oblasti, kterou kolonizuje (pylorus) [1, 2, 10]. V 80. letech 20. století se objevitelům podařilo dokázat, že se Helicobacter pylori vyskytuje u pacientů, kteří trpí duodenálními či žaludečními vředy, a zároveň je zodpovědná za vznik chronických onemocnění žaludku. Klíčovou rolí v jejich výzkumu byl pokus, kdy doktor 12

Barry James Marshall vypil suspenzi s Helicobacter pylori, aby své okolí o patogenitě bakterie a možném získání nákazy orální cestou přesvědčil. K tomuto pokusu došlo roku 1984. Po uplynutí prvního týdne se dostavila nevolnost, zvracení žaludečních šťáv, únava a silný zápach z úst. Endoskopická vyšetření prokázala těžký zánět sliznice žaludku a masivní nález Helicobacter pylori. Následovala léčba doxycyklinem a subsalicylátem bismutu, díky které došlo k ústupu zdravotních obtíží. Desátého prosince roku 2005 získali oba lékaři Nobelovu cenu za fyziologii a lékařství [2, 6, 10, 16, 24]. 1.5 Typy onemocnění způsobené Helicobacter pylori Rizikovým faktorem vzniku řady onemocnění žaludku a duodena je přítomnost H. pylori. Mezi nejčastější choroby, které bakterie může způsobit, patří zejména akutní a chronická gastritida, gastroduodenální vředy, MALT lymfom (MALT= mucosa-associated lymphoid tissue) a adenokarcinom žaludku [2, 14]. Akutní gastritida Při akutní gastritidě dochází k akutnímu zánětu sliznice žaludku. Akutní fáze onemocnění, způsobená helikobakterem, je poměrně vzácná, a často přechází v chronickou formu onemocnění. K jejímu vzniku dochází v případě nevědomého alimentárního přenosu, či přenosu prostřednictvím kontaminovaných předmětů. Průběh onemocnění může být asymptomatický, avšak častým příznakem bývají gastrointestinální potíže v podobě zvracení a průjmu. Pacient může trpět nechutenstvím a bolestmi v epigastriu [2, 11]. Chronická gastritida K chronické gastritidě dochází vlivem dlouhodobé kolonizace gastroduodenálního traktu H. pylori. Při onemocnění dochází k postižení sliznice, které může přejít až v těžký zánět hlubších vrstev žaludeční stěny. Zánětlivé změny mají různý typ a rozsah. Vlivem těchto faktorů se rozděluje onemocnění na jeho dvě základní formy chronickou povrchovou gastritis a chronickou hlubokou gastritis [1, 2]. Dalšími faktory kromě přítomnosti H. pylori, které se podílejí na vzniku chronické gastritidy, jsou například infekce způsobené cytomegalovirem, toxické vlivy (v podobě požívání 13

alkoholu, kouření a působení některých léků), autoimunitní onemocnění (perniciózní anemie či Crohnova choroba) a další možné vlivy, které se vyskytují již v menší frekvenci [2, 11]. Žaludeční vředy Z hlediska anatomie byl žaludeční vřed popsán roku 1835. Jeho popis zpracoval francouzský patolog Jean Cruveilhier. Jedná se o zánětlivé onemocnění, které postihuje gastroduodenální sliznici zažívacího ústrojí [8, 35]. K výskytu žaludečních vředů dochází nejčastěji podél zakřivení žaludku v oblasti antra. Z hlediska příčiny jsou gastroduodenální vředy rozděleny na dva typy - vředy primární a sekundární. Primární vředy představují onemocnění, které se nazývá vředová choroba. Jedná se o chorobu se známou příčinou, kterou způsobuje přítomnost bakterie H. pylori v gastroduodenální oblasti. Sekundární vředy vyjadřují chorobu, která má též známou příčinu, avšak není bakteriálního původu [2, 8, 18]. Rizikové faktory pro vznik sekundárních vředů Vzhledem ke skutečnosti, že sekundární vředy představují multifaktoriální onemocnění, existuje více vlivů, které je způsobují. Mezi nejčastější faktory patří zejména užívání nesteroidních antirevmatik (NSAIDS = non-steroidal anti-inflammatory drugs), kortikoidů, či působení stresu. Pro vředovou chorobu i pro sekundární vředy je neovlivnitelným faktorem vzniku onemocnění věk pacienta. Prevalence vzniku gastroduodenálních vředů je výrazně vyšší u starších lidí. Často postihují zejména seniory. V tomto případě se jedná o vředy stařecké [3, 7, 8, 12]. Projevy onemocnění Pro peptické vředy je charakteristická bolest v nadbřišku či zvracení. Bolest břicha přichází až několik hodin po jídle, nebo při delším lačnění v noci. Mezi další příznaky spadá také typické pálení žáhy. Na příznaky onemocnění má vliv i roční období, řada potíží se projevuje nejčastěji v jarním a podzimním období [6, 9]. 14

Komplikace peptických vředů Během onemocnění může dojít k určitým komplikacím. Jednou z nich je krvácení. Krev je vylučována z organismu např. zvracením, nebo je obsažena v natrávené formě ve stolici, která má pak černou barvu (tzv. meléna) [6, 18]. Jednou z hlavních příčin krvácení z vředu je překrvení sliznice v místě jeho výskytu. Život ohrožující příčinou krvácení je perforace vředu, vyznačující se prudkou bolestí. Pokud dojde k zánětu pobřišnice, jedná se o velmi vážný stav, vyžadující okamžitý chirurgický zákrok [6, 18]. Krvácení může být vyvoláno také například požitím léku acylpyrin. Acylpyrin obsahuje kyselinu acetylsalicylovou, která snižuje agregaci trombocytů, čímž může zhoršit krvácivé projevy [3, 8]. Obrázek 2 Antrální vřed žaludku Zdroj: [27] Obrázek 3 Duodenální vřed Zdroj: [28] 15

Karcinom žaludku Jako kancerogen I. třídy byla prohlášen H. pylori roku 1994. Po karcinomu plic se řadí žaludeční karcinom mezi druhé nejčastější maligní onemocnění na celém světě. Z hlediska nejčastější příčiny úmrtí v Evropě na maligní onemocnění se staví na čtvrtou pozici [11, 20]. Nejvyšší prevalence onemocnění žaludečním karcinomem, způsobeným H. pylori, je zejména u obyvatel žijících v rozvojových zemích (např. Asie či Latinská Amerika), kde se stává často první příčinou úmrtí [10]. Na vzniku žaludečního karcinomu má vliv také věk a pohlaví. U mužů je riziko vzniku žaludečního karcinomu dvakrát vyšší, než u žen. Z hlediska věku karcinom nejčastěji postihuje věkovou skupinu mezi 50. - 70. rokem. U pacientů mezi 30. 35. rokem je riziko vzniku karcinomu velmi nízké, avšak dojde-li k jeho propuknutí, průběh onemocnění je mnohdy agresivnější [20, 21]. Mezi další faktory, které mohou ovlivnit vznik nádoru žaludku, patří například nedostatek vitaminu C, dědičné predispozice, kouření, či špatné stravovací návyky [14, 22]. Obrázek 4 Karcinom žaludku - endoskopie Zdroj: [25] 16

Vznik zhoubného karcinomu žaludku Ke karcinomu žaludku dochází v případě, dojde-li k nádorovému zvrhnutí některé z buněk. V porovnání se zdravou buňkou dochází k pomalému stárnutí a nekontrolovatelnému růstu. Tímto vlivem tak dochází ke kumulaci buněk a vzniku tumoru. Maligní nádor je schopen prorůstat do okolí, a je schopen metastazovat (zakládat v těle vzdálená dceřiná ložiska). K metastázám dochází, dojde-li k roznosu nádorové buňky z původního ložiska do mízních uzlin. K takovému rozsevu dochází cestou mízních cév mízou. Šíření nádorových buněk může být rovněž krevní cestou. Nádorové buňky se mohou roznést do dalších vzdálených orgánů např. do kostí, jater či plic [21]. Hlavním zástupcem malignit žaludku je až z 95 % adenokarcinom, vznikající v žaludeční sliznici. Tento typ karcinomu vzniká při dlouhotrvající chronické gastritidě a při procesu kancerogeneze může dojít ke vzniku gastritické chronické atrofie (zmenšení velikosti původně normálně vyvinutého orgánu). Dále se může rozvinout intestinální metaplazie (přeměna epitelu žaludeční sliznice v jiný typ - intestinální) či dysplazie žaludeční sliznice (stav, který je prekurzorem adenokarcinomu žaludku dochází k poruše vývoje buněk žaludeční sliznice a jejich nesprávnému vyzrávání) [14, 21, 22]. Dělení karcinomů Karcinomy žaludku se dají rozlišit podle několika kriterií dle hloubky invaze a podle histologického typu [11]. Hloubka invaze rozlišuje karcinom na časný a pokročilý. Časný karcinom žaludku zahrnuje všechny nádory, které pronikají do mukózy a submukózy. Při správném léčebném postupu bývá doba přežití 5 let u 90 % pacientů. Pokročilý karcinom žaludku proniká hlouběji a doba přežití 5 let je pouze u 30 % pacientů [11, 20]. Histologicky se dá karcinom rozlišit na 2 typy: difúzní a intestinální. Intestinální karcinom, za jehož hlavní prekurzor se považuje chronická gastritis, je spojen právě s patologickým působením H. pylori. Tento typ karcinomu převažuje v oblastech, ve kterých je výskyt onemocnění vysoký. U difúzního typu karcinomu nebyl jeho vztah k působení H. pylori dodnes potvrzen. Difúzní typ je na rozdíl od typu intestinálního více agresivní [10, 14, 17, 20]. 17

Příznaky karcinomu žaludku Zásadním problémem při včasném určení diagnózy je fakt, kdy v počátečním stádiu onemocnění pacient často necítí žádné klinické příznaky. Onemocnění tak probíhá ve většině případů asymptomaticky. K rozvoji příznaků dochází většinou v pokročilé fázi nemoci. Mezi nejčastější příznaky patří: zvracení natrávené krve, váhový úbytek, meléna (přítomnost natrávené krve ve stolici) nechutenství, pálení žáhy či špatné trávení. Tyto příznaky jsou však nespecifické a mohou být přítomny i u řady jiných onemocnění žaludku [8, 11, 21]. MALT lymfom Jedná se o vzácné onemocnění, vyvolané maligními změnami slizniční lymfatické tkáně, nazývané MALT (mucosa associated lymphoid tissue). Důsledkem těchto změn může být vznik primárního žaludečního lymfomu, nazvaného též jako maltom, primární non- Hodgkinův lymfom, či MALT lymfom. Jedná se o třetí nejčastější podtyp Non-Hodgkinských lymfomů. Pro onemocnění je charakteristická přítomnost lymfatických folikulů. Téměř u všech pacientů s MALT lymfomem byla prokázána pozitivita na H. pylori. MALT lymfom většinou nepředstavuje vysoký stupeň malignity. Při včasné diagnostice onemocnění a nasazení vhodné eradikační antibiotické terapie může dojít k úplné regresi (ústupu) nádoru [2, 12, 14, 22, 23]. 18

1.6 Typy odběru biologického materiálu pro diagnostiku Helicobacter pylori Pro detekci infekce slouží několik diagnostických metod, které jsou závislé na různých faktorech. Mezi tyto faktory patří také například jejich dostupnost a cena, a v neposlední řadě také věk pacienta. Diagnostické metody pro průkaz H. pylori lze rozdělit dle způsobu odběru na invazivní a neinvazivní [1, 19, 30]. Invazivní odběr Pro invazivní odběr je základním materiálem pacientův vzorek gastroduodenální tkáně, získaný bioptickým endoskopickým odběrem. Takto odebraný vzorek slouží k přímému průkazu infekčního agens pomocí mikroskopie, kultivace či průkazu produkce ureázy [1, 3, 8]. Neinvazivní odběr Neinvazivní odběr nevyžaduje, na rozdíl od odběru invazivního, endoskopicky odebranou tkáň. Zde se využívá stolice ke stanovení přítomnosti antigenu hledané bakterie či dechová zkouška se značeným izotopem uhlíku 13 C [1, 19, 22]. Pro vyšší senzitivitu a specificitu testu je vhodné odebrat biologický materiál oběma způsoby. Umožní to tak přesnější diagnostiku infekce. Nepřímý průkaz infekčního agens se provádí prostřednictvím sérologického vyšetření. Důležitý faktor pro správnou diagnostiku je rychlý transport vzorku do laboratoře. Vzorek by měl být do laboratoře transportován co nejrychleji - přibližně do 2 hodin po zákroku, aby tak nedošlo k jeho možnému znehodnocení [1, 8, 11]. Endoskopické vyšetření Pro správné určení diagnózy pacienta je důležité zvolit vhodnou diagnostickou metodu. Ve druhé polovině 20. století byla rentgenová diagnostika gastrointestinálních chorob zcela nahrazena specifičtějším endoskopickým vyšetřením [8, 18]. Endoskopie představuje vyšetření, které lékaři umožňuje prohlédnout a zhodnotit stav vnitřních orgánů, a zároveň je vhodnou metodou pro identifikaci zdroje krvácení do trávicího traktu. V případě potřeby umožňuje provést bioptický odběr vzorku sliznice pomocí optického přístroje endoskopu. Při biopsii je vhodné odebrat 4-5 vzorků z několika různých 19

míst, která jsou postižena. Vzorky, získané biopsií, se využívají pro histologické a kultivační vyšetření, či rychlý ureázový test [16, 17, 18, 22]. Pro vyšetření jícnu, žaludku a duodena se využívá speciální přístroj gastroskop (ohebná sonda), který lékaři pomáhá rozlišit různá gastrointestinální postižení - např. peptický vřed, zánětlivý proces (gastritida), či nádor. Při podezření na infekci, způsobenou H. pylori, představuje gastroskopie jedno z prvních vyšetření pacienta. Zákrok probíhá pod lokálním znecitlivěním hltanu speciálním anestetikem ve formě spreje. Pacient během vyšetření leží na levém boku a jeho otevřenými ústy je zaveden gastroskop, který prochází hltanem do jícnu, a odtamtud dále do vyšetřovaného orgánu. Standardní doba vyšetření se pohybuje v řádu 10 minut [3, 8, 17, 18]. Pro vyvarování se komplikacím, spojeným s endoskopickým vyšetřením, je důležité správné zavedení sondy a šetrný přístup při pohybu sondou během vyšetření. Ačkoli se jedná o rutinní vyšetření, které běžně nezpůsobuje pacientovi žádné komplikace, může dojít vlivem nešetrného provedení např. ke krvácení či perforaci [8, 17]. Další komplikací může být iatrogenní přenos bakterií na pacienta, způsobený nedostatečným mechanickým a dekontaminačním očištěním přístroje a dalších nástrojů, souvisejících s vyšetřením. V případě nedodržení dekontaminačních procesů tak může mimo iatrogenního přenosu dojít také k falešné pozitivitě výsledků [1, 22]. 20

1.7 Laboratorní diagnostika Helicobacter pylori V následujících kapitolách jsou uvedeny principy jednotlivých laboratorních metod, sloužících k průkazu Helicobacter pylori. 1.7.1 Mikroskopie Mikroskopie patří mezi základní diagnostické metody přímého průkazu bakterií. Preparát pro mikroskopický průkaz Helicobacter pylori se zhotovuje ze vzorku biopticky odebrané tkáně z duodena či žaludku, která je do laboratoře transportována v transportním médiu. Bioptická tkáň je nanesena na sterilní podložní sklíčko a následně je prostřednictvím rohu druhého podložního sklíčka rozdrcena. Poté se tato tkáň rozetře po ploše podložního sklíčka. Vzniklý preparát je zafixován nad plamenem a následně obarven. V rámci mikrobiologického průkazu jsou preparáty barvené nejčastěji barvením podle Grama, které rozlišuje bakterie na základě složení jejich buněčné stěny na grampozitivní a gramnegativní. H. pylori je v mikroskopu pozorovatelný pod imerzním objektivem jako gramnegativní tyčinka růžovočervené barvy [12, 30]. 1.7.2 Kultivace Kultivace H. pylori je velmi náročná. Bakterie vyžaduje pro svůj růst speciální obohacená média, která navíc obsahují antibiotika, potlačující růst běžné mikroflóry [31]. Helikobakter ideálně roste v mikroaerofilním prostředí s malým množstvím kyslíku, které se pohybuje v rozmezí 2-5 %, dále obsahuje oxid uhličitý z 5-10 % a zbytek tvoří dusík. Další důležitou podmínkou pro optimální růst je také dostatečná vlhkost. Ideální kultivační teplota je 37 C a ph 5,5 [22, 31]. Nejpoužívanějšími kultivačními půdami je čokoládový agar, krevní agar a komerčně vyráběný Pylori agar. Šedě zbarvené kolonie na půdách vyrostou v rozmezí 4-7 dnů. Jsou velmi drobné, maximální průměr nepřesahuje 1 mm, průhledné, na krevním agaru netvoří hemolýzu. H. pylori se nejčastěji kultivuje ze vzorků gastroduodenální sliznice. V případě prokázané pozitivity bakterie pomocí kultivačního vyšetření se dále provádí průkaz citlivosti na antibiotika [1, 7, 8, 22, 31]. 21

1.7.3 Rychlý ureázový test Další metodou, která též ke svému provedení vyžaduje endoskopicky odebraný vzorek, je rychlý ureázový test. Detekce ureázy slouží k ověření přítomnosti Helicobacter pylori ve sliznici žaludku. Ureáza, produkovaná helikobakterem, rozkládá močovinu (ureu) na oxid uhličitý a amoniak [8, 19]. Žaludeční či duodenální tkáň je vystavena médiu, obsahujícímu močovinu s indikátorem. V případě, že je helikobakter přítomný ve stanovovaném vzorku, uvolní se amoniak, který v rozmezí několika minut až jedné hodiny změní barvu indikátoru. Jako indikátor bývá použita fenolová červeň, která mění své zbarvení v závislosti na ph prostředí. Při neutrálním ph má indikátor žlutou barvu, kdežto v alkalickém prostředí je červený. Nedojde-li ke změně zbarvení indikátoru do 60 minut, test se považuje za negativní [1, 4, 10, 38]. Test je v současnosti využíván s oblibou pro jeho dobrou dostupnost, rychlost, spolehlivost a finanční nenáročnost. Senzitivita a specificita testu se pohybuje v rozmezí 90 98 % [4, 12, 19]. 1.7.4 Průkaz antigenu ve stolici Test stanovení antigenu Helicobacter pylori ve vzorku stolice pacienta představuje neinvazivní metodu, která využívá k detekci antigenu H. pylori přítomnost monoklonální protilátky, jež je zabudovaná v nitrocelulózové membráně testu. Tato monoklonální protilátka je namířena proti zmiňovanému antigenu H. pylori [29]. Vzorek stolice je ředěn prostřednictvím ředícího pufru a následně jsou 3 kapky vzniklé suspenze přeneseny do testovací jamky, která obsahuje membránu s rozptýlenou monoklonální protilátkou. Test se vyhodnocuje po 10 minutách. Pokud vzorek stolice obsahuje antigen H. pylori, dojde k jeho vazbě na monoklonální protilátku. Pozitivita reakce se prokáže vznikem červeného proužku v okénku pro odečet. Správné provedení testu je potvrzeno vznikem zeleného proužku, který se objeví v okénku pro odečet v místě kontroly [19, 29]. Metoda představuje spolehlivou diagnostiku aktivní infekce a zároveň je vhodná pro kontrolu úspěšnosti eradikační léčby. Výhodou tohoto testu je vysoká citlivost a rychlost testu. 22

Nevýhodou testu je však fakt, že test udává pouze kvalitativní údaje a nevyjadřuje tak kvantitu antigenu ve vzorku [19, 22, 29]. 1.7.5 Dechový test Mezi metody, které již nevyžadují ke svému provedení gastroduodenální tkáň pacienta, řadíme dechový test, popsaný již roku 1987. Test slouží jakožto screeningová metoda přímého průkazu, která se používá před indikací endoskopie [1, 5]. Pacientovi je perorálně podána močovina se značeným izotopem uhlíku 13 C či 14 C o známé koncentraci. Rozdíl mezi zmíněnými značenými izotopy spočívá v jejich radioaktivitě. Izotop uhlíku 13 C je stabilní přirozený izotop bez radioaktivní zátěže. Jeho podání v rámci dechového testu je vhodné zejména u žen v graviditě či u dětí. Izotop uhlíku 14 C představuje pro pacienta zcela minimální radioaktivní zátěž. Od testů s izotopem 14 C se však v této době ustupuje pro jeho delší poločas rozpadu zejména u dětí a v dnešní době jsou nahrazovány za testy s izotopem uhlíku 13 C [1, 5, 10]. Je-li v žaludku přítomen H. pylori, začne produkovat enzym ureázu, čímž dojde k hydrolýze močoviny. Dochází tak k rozštěpení urey na amoniak a oxid uhličitý. Pozitivním výsledkem testu je pacientem vydechovaný oxid uhličitý, který obsahuje značenou složku v podobě 13 CO2 či 14 CO2. Během testu dochází k měření značených částic v určitých časových intervalech, přičemž maxima je dosaženo kolem dvacáté minuty. Prostřednictvím hmotnostního spektrometru se provádí analýza vydechnutého vzduchu [10, 30]. Pro správný výsledek testu je nezbytné, aby pacient podstoupil test nalačno. Ke zkreslení výsledku testu dochází v případě přítomnosti bakterií v dutině ústní, které mohou produkovat ureázu. K dalšímu možnému falešnému výsledku dechového testu může dojít v případě předchozí antibiotické léčby pacienta v uplynulých měsících. V tomto případě se pacientovi doporučuje provádět test minimálně měsíc po ukončení léčby. Stejné doporučení platí i u pacientů, kteří během posledních 4-6 týdnů užívali inhibitory žaludeční sekrece [11, 12]. Výhoda dechového testu spočívá především v neinvazivním způsobu odběru vzorku, vysoké specificitě, senzitivitě (až 90-95%) a jednoduchém provedení. Nevýhodou je však ekonomická náročnost [12]. 23

1.7.6 Ostatní metody Mezi další metody průkazu Helicobacter pylori patří např. molekulárně diagnostické metody či sérologický průkaz protilátek [30]. Molekulární techniky prokazují ve vyšetřovaném vzorku genetický materiál bakterie, v podobě nukleových kyselin. Hlavním představitelem molekulárně diagnostických metod je metoda PCR (polymerase chain reaction). Výhoda této metody spočívá v její vysoké citlivosti a specificitě, neboť umožňuje průkaz H. pylori i ve vzorcích vysoce kontaminovaných dalšími mikroby. Nevýhodou je však finanční náročnost vyšetření. Molekulárně diagnostické metody jsou v současnosti na experimentální bázi a v rámci běžné klinické diagnostiky jsou upřednostňována jiná vyšetření pro průkaz H. pylori [10, 22, 25, 30]. K průkazu H. pylori se rovněž využívají sérologická vyšetření protilátek v séru pacienta. Protilátky mohou být stanovovány rovněž ve slinách či v moči infikovaných osob. Výsledkem pozitivních sérologických testů bývá zvýšení hladiny určité třídy protilátek nejčastěji IgG a v nižší míře také protilátek třídy IgM a IgA. Falešná negativita výsledku může nastat u malých dětí, vzhledem k pomalému nástupu imunitní odpovědi. U pacientů s chronickou gastritidou může i po úspěšné eradikační léčbě sérologická pozitivita s vysokou hladinou IgG protilátek přetrvávat déle (i více než půl roku). Mezi nejčastěji používané sérologické metody patří zejména ELISA a Western blot [1, 30]. 24

1.8 Léčba infekce způsobené Helicobacter pylori Vždy je nutné zvážit terapii v souvislosti s klinickým obrazem. Při potvrzení gastroduodenální infekce, vyvolané H. pylori, je nutné ihned začít s terapií. V této kapitole jsou uvedeny nejčastější zástupci medikamentů pro léčbu infekcí, spojených s nákazou H. pylori, a podstata eradikační terapie. H2 blokátory V rámci léčby peptických vředů duodena a žaludku patřily v 80. letech 20. stol. mezi léky první volby H2 blokátory, které úspěšně snižují sekreci chlorovodíkové kyseliny tím, že blokují H2 histaminový receptor v antru žaludku jeho krycí buňky. Mezi nejčastější zástupce patří například Ranitidin či Famotidin. Jejich nevýhodou však je častý vznik recidiv infekce. V dnešní době se užívají spíše v rámci prevence peptických vředů [8, 18]. Inhibitory protonové pumpy V rámci léku první volby a k eradikaci (vymýcení) mikroba jsou používány zejména inhibitory protonové pumpy (PPI). PPI jsou schopny svým účinkem zablokovat protonovou pumpu, která tvoří kyselinu chlorovodíkovou na základě podnětů. V současnosti patří mezi jejich nejčastější zástupce např. Omeprazol, Rabeprazol, Lansoprazol či Pantoprazol [11, 18]. Nejvyužívanějším zástupcem inhibitorů protonové pumpy je lék s názvem Helicid (Omeprazol). Výhodou PPI je dobré vstřebávání v tenkém střevě a minimum nežádoucích účinků [3, 22]. Antibiotické preparáty V rámci základního eradikačního schématu se nejčastěji využívá trojkombinace PPI spolu se 2 antibiotiky. Jelikož se stává bakterie v léčbě čím dál více rezistentní, je nezbytné provést test citlivosti na antibiotika. Nejčastěji využívanými antibiotiky v rámci trojkombinace s PPI jsou amoxicilin s metronidazolem či amoxicilin s clarithromycinem. Zvolená trojkombinace se obvykle užívá po dobu 7 14 dnů [15, 16, 19, 32]. 25

Amoxicilin Amoxicilin patří mezi antibiotika penicilinové řady. Jedná se o beta-laktamové antibiotikum s baktericidním účinkem (vlivem tohoto účinku dochází k usmrcení mikroba). Mechanismus účinku amoxicilinu spočívá v inhibici syntézy buněčné stěny bakterie. Obvyklá dávka pro dospělého je 1 1,5 g po 8 hodinách perorální podání [30, 32]. Předností amoxicilinu je jeho dobrá vstřebatelnost, minimální toxicita a dobrá snášenlivost. Rezistence na amoxicilin je nízká a poměrně vzácná, proto je toto antibiotikum nejčastěji využíváno v rámci terapie infekcí, způsobených H. pylori. Penicilinová antibiotika však často způsobují u pacientů alergické reakce, kdy může dojít např. k výsevu vyrážky (vzhled jako kopřivka) či anafylaktickému šoku [15, 30, 32]. Clarithromycin Clarithromycin je širokospektré antibiotikum, patřící do skupiny makrolidů. Jedná se o antibiotikum s bakteriostatickým účinkem (vlivem tohoto účinku dochází k zástavě množení a růstu mikroba). Mechanismus účinku clarithromycinu spočívá v blokaci proteosyntézy v bakteriálních buňkách, čímž dochází k omezení jejich dalšího množení [1, 30, 32]. Jejich předností je dobrý průnik do tkání a netoxičnost [33]. Obvyklá dávka pro dospělého je 500 mg po 12 hodinách perorální podání. Rezistence clarithromycinu je indikována častěji, než u amoxicilinu. Makrolidy se často nasazují u pacientů s alergií na antibiotika penicilinových řad [15, 19, 32]. Metronidazol Metronidazol je důležitým zástupcem skupiny antibiotik s názvem nitroimidazoly. Jedná se o antibiotikum s baktericidním účinkem. Narušuje DNA anaerobních bakterií. Metronidazol rovněž působí na prvoky. Obvyklá dávka pro dospělého je 500 mg po 8 hodinách. Předností metronidazolu je jeho dobrý průnik do tkání. Při užívání medikamentu pacienti často popisují kovovou pachuť v ústech [8, 30, 32, 33]. 26

Mezi další antibiotika, která jsou rovněž využívána v rámci trojkombinace s PII, patří např. fluorochinolonová širokospektrá antibiotika s baktericidním účinkem (např. levofloxacin), či tetracyklinová antibiotika, která svým bakteriostatickým účinkem inhibují proteosyntézu. Dále se využívají rovněž rifamycinová antibiotika. Zde je hlavním zástupcem např. rifampicin. Jedná se o širokospektré antibiotikum s baktericidním účinkem. Během léčby však vzniká častá rezistence [8, 32, 34]. Další léčiva Mezi další skupiny léků, využívaných pro léčbu infekce způsobené H. pylori, se řadí antacida (neutralizují kyselý obsah žaludku) či komplexní soli vizmutu. Vizmutové preparáty mají toxický účinek na H. pylori. Bývají též užívány v rámci kombinační léčby, vedoucí k eradikaci [11, 15, 22]. Všechna onemocnění, která H. pylori způsobuje, je nutné řešit komplexně. Kromě medikamentózní léčby je zároveň nutné dodržovat režimová a dietní opatření. Pro správnou diagnostiku onemocnění je důležité podstoupit příslušná vyšetření (např. endoskopické vyšetření). Dojde-li ke komplikacím onemocnění (např. karcinom žaludku), je nutný např. chirurgický zákrok, a případně další léčba dle závažnosti onemocnění (např. chemoterapie) [8, 11]. 1.9 Preventivní opatření Na vzniku peptických onemocnění se podílí také stravovací návyky. V rámci prevence je vhodné dodržovat jistá doporučení a dietní opatření. Nadměrná konzumace potravin, zvyšujících sekreci kyseliny chlorovodíkové (HCl), může být rizikovým faktorem pro tvorbu gastroduodenálních vředů. Dietní opatření spočívají ve vynechání potravin, které podporují produkci HCl a dráždí sliznici žaludku. Mezi tyto rizikové potraviny patří především alkohol, kofeinové nápoje, sycené nápoje (limonády), tučné a pálivé pokrmy [7, 8]. Ke snížení produkce HCl je jedním z nejpřirozenějších antacid pravidelná strava v častějších intervalech a v menších dávkách (zhruba 6x denně). Poslední denní příjem potravy je doporučen 4 hodiny před spaním, neboť se právě v noci stimuluje produkce HCl [18]. 27

2 Praktická část Princip metody Mezi základní diagnostická vyšetření Helicobacter pylori spadá mikroskopie, kultivace a průkaz ureázové aktivity. V laboratoři byla prováděna identifikace bakterie na přístroji MALDI-TOF (hmotnostní spektrofotometrie). Standardní součástí je stanovení citlivosti na antibiotika. V laboratoři se provádí také vyšetření antigenu Helicobacter pylori ve stolici. Místo provádění metody Biologický materiál se zpracovával ve Fakultní nemocnici v Motole v mikrobiologické laboratoři č. 20-10019 Laboratoř cystických fibróz. Zásady bezpečnosti práce Klinický materiál byl zpracováván v hazard boxu. Během manipulace s materiálem byly dodržovány obecné bezpečnostní zásady využití rukavic, ochranného oděvu (plášť a předepsané oblečení), sepnuté vlasy. Veškeré práce byly prováděny v souladu s provozním řádem laboratoře, a biologický materiál byl likvidován dle příslušné směrnice. 2.1 Preanalytická fáze Odběr primárního vzorku a transport Zmíněná vyšetření jsou prováděna u pacientů s podezřením na onemocnění, způsobené Helicobacter pylori. Diagnostická vyšetření, která vyžadují bioptický odběr tkáně, jsou prováděna v rámci endoskopického vyšetření žaludku a duodena. Tato vyšetření provádí vyškolený personál za použití speciálních klíštěk. Tkáň je následně vložena do speciálního transportního média BHI (Brain Heart Infusion) při pokojové teplotě a zasílá se do laboratoře. V laboratoři musí být odebraný materiál zpracován do 2 hodin. Při provedení neinvazivního testu na průkaz antigenu Helicobacter pylori ve stolici přichází do laboratoře sterilní zkumavka se stolicí pacienta. Stolici si odebírá pacient sám z její libovolné části a vzorek přináší svému ošetřujícímu lékaři, který jej poté společně s žádankou zasílá do laboratoře. 28

Příjem vzorku do laboratoře Při příjmu vzorku do laboratoře je nutné zkontrolovat, zda je doplněn průvodní žádankou. Vzorek je následně označen štítkem, který obsahuje jméno, příjmení, rodné číslo a datum a čas odběru. Po řádné kontrole, zda odpovídají údaje na žádance údajům na klinickém vzorku, je biologický materiál následně předán ke zpracování do příslušné laboratoře podle typu požadovaného vyšetření. Omezení V laboratoři nemohou být zpracovávány vzorky, které byly odebrány více než před 2 hodinami, či vzorky, u kterých nebyl dodržen správný transport (např. správná teplota). Též se nemohou zpracovávat vzorky s nedohledatelnou dokumentací a s nedohledatelnými základními údaji. Dále nesmí být používány kultivační půdy a vyšetřovací soupravy, které jsou již po uplynutí expirační doby. 2.2 Analytická fáze Analytická fáze začíná v té chvíli, kdy jsou vzorky přijaty do laboratoře, označeny příslušnými štítky a roztříděny dle požadovaných vyšetření do konkrétních laboratoří. Tato kapitola zahrnuje popis činností a seznam přístrojů, pomůcek, spotřebního materiálu a reagencií, které jsou využity v rámci analytické fáze pro laboratorní diagnostiku Helicobacter pylori. Využívané přístroje a pomůcky Anaerobní zvony Plynový kahan Izoelektrický zapalovač Termostat Hmotnostní spektrofotometr MALDI-TOF Mikroskop 29

Reagencie Barviva pro Gramovo barvení (krystalová violeť, Lugolův roztok, aceton, ředěný karbolfuchsin) Půda Helicobacter pylori výrobce a dodavatel Dulab Anaerocult Anaerocult C MERCK Imerzní olej HELICO AQUA TEST výrobce Semtex AB, dodavatel JK Trading Brain Heart Infusion (BHI) výrobce a dodavatel OXOID Pylori K-SeT - firma Coris BioConcept Destilovaná voda Matrice Spotřební materiál Jednorázové bakteriologické kličky / kovové bakteriologické kličky Sterilní podložní sklíčka Čtverečky Štítky Gumové rukavice Pasteurova pipeta Párátka Popisovací tužky / lihový fix Pinzeta 30

Příprava k výkonu činnosti: Po přijetí biologického materiálu do laboratoře se provede kontrola shody údajů na materiálu a žádance. Do laboratorního informačního systému (LIS) jsou zapsány všechny potřebné údaje ze žádanky. LIS následně vygeneruje čárový kód s číslem materiálu. Poté se automaticky vytiskne příslušný počet štítků, kterými je označen biologický materiál, žádanka, a další využívaný materiál v rámci testování (např. ureázový test). 2.3 Laboratorní diagnostika Helicobacter pylori V následujících kapitolách jsou uvedeny pracovní postupy jednotlivých metod k průkazu Helicobacter pylori, prováděné v mikrobiologické laboratoři ve Fakultní nemocnici v Motole, a následně hodnocení jejich výsledků. 2.3.1 Stanovení produkce ureázy Ve Fakultní nemocnici v Motole byl prováděn v rámci rutinních testů pro diagnostiku Helicobacter pylori ureázový semikvantitativní test HELICO AQUA TEST. Pracovní postup: 1. Vhodný biologický materiál je biopticky odebraný kus tkáně z antra či těla žaludku (či z dvanácterníku) 2. Po rozbalení testu a vytemperování testovací soupravy se do testovací jamky (do středu žlutého filtračního papíru) pomocí sterilní Pasteurovy pipety odebere kus pacientovy tkáně, která byla uložena v transportním médiu BHI 3. Poté se přidá do testovací jamky 1 kapka destilované vody tak, aby zvlhčila celou plochu filtračního papíru 4. Následně se přesunutím pohyblivého okénka zavře testovací jamka a nechá se inkubovat při pokojové teplotě 5. Výsledek se odečítá nejprve po 5, 30, a následně i po 60 minutách hodnotí se změna barvy terčíku (změna barvy indikátoru) K falešné pozitivitě výsledku může dojít vlivem přítomnosti jiných bakterií. 31

Obrázek 5 Ureázový test HELICO AQUA - testovací sada (vlevo), kazeta s testovací jamkou (vpravo) Zdroj: Autor Hodnocení výsledků: Ureázový test: Tabulka 1: Výsledky ureázového testu Barva žlutá červená/purpurová Výsledek negativní pozitivní Intenzita růžového zbarvení odpovídá množství H. pylori ve vzorku. Pokud změna barvy disku proběhla až za několik hodin, výsledek je považován za negativní Výsledek testu se hodnotil po 5, 30 a následně po 60 minutách. Po 5 minutách: Pokud došlo již v tomto časovém intervalu ke změně barvy ze žluté na červenou, test potvrzuje přítomnost Helicobacter pylori ve vzorku a další inkubace není nutná. Test může být ukončen. Inkubace pokračuje v případě, pokud do 5 minut nedošlo ke změně barvy. Po 30 minutách: Došlo-li ke změně barvy ze žluté na purpurovou, test se považuje za pozitivní. V tomto případě může být test ukončen a není již nutná další inkubace. Pokud nedojde k žádné barevné reakci, inkubace pokračuje. 32

Po 60 minutách: Došlo-li ke změně barvy ze žluté na purpurovou, test potvrzuje přítomnost Helicobacter pylori ve vzorku a je ukončen. V případě, že ani po 60 minutách nedošlo ke změně barvy a zůstává žlutá, jedná se o negativní nález. Obrázek 6 Pozitivní ureázový test Zdroj: Autor 2.3.2 Zhotovení preparátu a mikroskopie Pro mikroskopický průkaz helikobakterové infekce se používá biopticky odebraná tkáň nejčastěji z těla, či antra žaludku, která je transportována v BHI. V případě, kdy lékař nepožaduje kultivační průkaz, provádí se mikroskopický průkaz v kombinaci s ureázovým testem (z téhož bioptického vzorku). V tomto případě do laboratoře přichází většinou pouze jeden vzorek tkáně z těla žaludku či z antra. Pracovní postup: 1. Připravené sterilní podložní sklíčko se označí na základě čísla pacienta 2. Jeden vzorek tkáně je přenesen pomocí sterilní Pasteurovy pipety na sterilní podložní sklíčko 3. Tkáň je pomocí rohu druhého podložního sklíčka rozdrcena a rozprostřena na celou plochu podložního sklíčka 4. Tímto způsobem vzniklý nátěr se zafixuje nad plamenem 5. Následně je nátěr obarven základním diagnostickým barvením pode Grama 6. Na hotový preparát se nanese kapka imerzního oleje a následně se pozoruje pod mikroskopem při zvětšení 10 x 100 33

Gramovo barvení Jedná se o základní diagnostické barvení, které rozdělí bakterie podle složení buněčné stěny na grampozitivní a gramnegativní. Pracovní postup: 1. Fixovaný a usušený preparát se položí na stojan, který je umístěn nad výlevkou 2. Na preparát se pomocí Pasteurovy pipety nanese na 20 vteřin krystalová violeť 3. Poté se krystalová violeť slije a nanese se na 20 vteřin Lugolův roztok (roztok jódu v jodidu draselném) 4. Slití a oplach vodou 5. Dalším krokem je odbarvení acetonem aceton se nanáší tak dlouho, dokud odchází barva 6. Oplach vodou 7. Posledním barvivem je ředěný karbolfuchsin v poměru 1:10 8. Po minutě se karbolfuchsin slije, preparát se opláchne vodou 9. Preparát se usuší nad plamenem Hodnocení výsledků Gramova barvení: Tabulka 2: Výsledky Gramova barvení Barva Výsledek modrá (modro-fialová) G+ růžová (růžovo-červená) G- nestejnoměrné obarvení Glab G+ = grampozitivní G- = gramnegativní Glab = gramlabilní 34

Hodnocení výsledku mikroskopie: Při pozorování mikroskopického preparátu se hodnotí přítomnost charakteristických gramnegativních tyčinek v 50 zorných polích. Preparát se sleduje v mikroskopu při zvětšení 10 x 100. Negativní výsledek: nejsou nalezeny typické G- tyčinky Slabě pozitivní výsledek: nález 1-10 G- tyčinek (pozitivita na jeden +) Pozitivní výsledek: nález 11-100 G- tyčinek (pozitivita na dva ++) Silně pozitivní výsledek: nález více než 100 G- tyčinek (pozitivita na tři +++) Obrázek 7 Mikroskopický preparát antra žaludku barvený Gramovým barvením Zdroj: Autor Obrázek 8 Preparát antra žaludku obarvený Gramem - identifikace vzorku Zdroj: Autor 35

2.3.3 Kultivace V případě, kdy lékař zažádá o provedení kultivačního vyšetření, je nutné, aby vzorek přišel do laboratoře v duplicitní formě tj. 2 kusy tkáně odebrané ze stejného místa. Pro lepší záchyt se posílají do laboratoře 2 párové vzorky s duplicitním odběrem tj. dvakrát z těla žaludku a dvakrát z antra. Vzorky jsou zasílány do laboratoře v BHI. Bez zaslání duplicitního vzorku není možné vyšetření provést. Pracovní postup: 1. K provedení kultivace se používá duplicitní tkáň. 2. Vzorek se pomocí bakteriologické kličky přenese na speciální kultivační půdu pro diagnostiku Helicobacter pylori. 3. Na kultivační plotně se tkáň rozočkuje sterilní bakteriologickou kličkou po celé ploše. 4. Rozočkované plotny jsou ukládány do anaerobních zvonů, do kterých je současně přidáván sáček s anaerocultem. 5. Poté se kultivuje 72 hodin (3 dny) za teploty 37 C. Naroste-li na agaru kolonie H. pylori, k dalšímu ověření se následně využívá přístroj MALDI-TOF, který funguje na principu hmotnostní spektofotometrie. Hodnocení výsledku kultivace: Na speciální kultivační půdě pro diagnostiku Helicobacter pylori se hodnotí morfologie narostlých kolonií a ověřuje hmotnostním spektrofotometrem. Na základě pozitivní kultivace se následně provádí stanovení citlivosti na antibiotické preparáty. Tabulka 3: Výsledky kultivace Výsledek testu pozitivní negativní Charakteristika kolonií Velmi drobné kolonie, šedé zbarvení, průhledné Na kultivační půdě nevyrostly žádné kolonie 36

Obrázek 9 Helicobacter pylori na speciální kultivační půdě Zdroj: Autor 2.3.4 Hmotnostní spektofotometrie MALDI-TOF Pro identifikaci či ověření bakterií z biologického materiálu se využívá přístroj MALDI-TOF, který funguje na bázi hmotnostní spektofotometrie s laserovou desorpcí a ionizací za účasti matrice s průletovým analyzátorem [37]. Postup: 1. Materiálem pro stanovení je vykultivovaná kolonie, která je izolována na pevném agaru. 2. Na nerezovou destičku se nanese pomocí párátka malé množství narostlé kultury 3. Následně se přidá pomocí pipety 1 µl matrice 4. Po zaschnutí se destička se směsí matrice a vzorku vloží do přístroje 5. Vyhodnocení vzorku probíhá pomocí počítače (speciální softwarový systém) 37

Obrázek 10 Nerezová destička s nanesenými vzorky (vzorky již zakápnuté matricí) Zdroj: Autor Hodnocení výsledku hmotnostní spektrofotometrie MALDI-TOF: Přístroj sám vygeneruje výsledek na základě spektra, výsledek se automaticky zaznamená do laboratorního systému. Ve výsledku je uveden název bakterie a skóre, které udává míru spolehlivosti dourčení. V případě nízkého skóre systém nabídne možné alternativy. Na základě porovnání s narostlou kulturou je možno takový výsledek akceptovat nebo celý postup zopakovat. 2.3.5 Stanovení citlivosti na antibiotika Citlivost na antibiotika se provádí na základě pozitivního kultivačního vyšetření. Při stanovení citlivosti k lékům volby se u H. pylori provádí tzv. E-test, určený pro stanovení MIC vhodného antibiotika. Umělohmotný proužek je napuštěn antibiotikem s koncentračním gradientem. Dále jsou uvedeny preparáty, které lze využít při terapii, a u kterých se v mikrobiologické laboratoři testuje citlivost: Clarithromycin, Rifampicin, Amoxicilin, Levofloxacin, Metronidazol a Tetracyklin. Pro test jsou využity 3 agarové plotny pro H. pylori. Na každou plotnu se vkládají dva proužky, které se pokládají naproti sobě. 38

Pracovní postup: 1. Všechny 3 plotny se označí štítkem s čárovým kódem a datem, a zároveň je na plotně uvedeno, jaké proužky s antibiotiky budou na plotny kladeny 2. Agarové plotny se hustě naočkují narostlým kmenem H. pylori pomocí bakteriologické kličky, a to všemi směry 3. Pomocí pinzety vypálené nad plamenem se na půdy kladou jednotlivé proužky napuštěné antibiotikem 4. Agarové plotny se následně vloží do anaerobního zvonu s anaerokultem a uzavřené se kultivují v termostatu při teplotě 37 C 72 hodin 5. Po 72 hodinách se odečítá MIC Hodnocení výsledků stanovení citlivosti na antibiotika: Výsledkem testu je stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) jednotlivých antibiotik. MIC se stanoví na základě toho, v jakém místě koncentrace antibiotika dojde k protnutí vzniklé elipsy. Obrázek 11 Stanovení citlivosti Helicobacter pylori na antibiotika Citlivost bakterie na tetracyklin vlevo, v místě vzniklé elipsy je MIC Vpravo vyjádřena rezistence na clarithromycin Zdroj: autor 39

2.3.6 Průkaz Helicobacter pylori ve stolici Ve Fakultní nemocnici v Motole je využíván in vitro diagnostický test Pylori K-SeT od firmy Coris BioConcept. Tento test obsahuje 20 kazet, které jsou uzavřené v plastových obalech, a 20 lahviček pufrového rozpouštědla HC Dilution Buffer po jednom mililitru. Pylori K-SeT test slouží k detekci antigenů Helicobacter pylori ze vzorku stolice. Na každý vzorek se používá jedna kazeta. Pracovní postup: 1. Ze sterilní zkumavky se vzorkem stolice pacienta se pomocí plastové špejle odebere přibližně 80 mg stolice 2. Po otevření zkumavky s 1 ml rozpouštědla HC Dilution Buffer se špejle s tímto množstvím stolice vloží dovnitř, a utáhne se víčko 3. Tato směs se následně homogenizuje na třepačce 4. Následně se z obalu vyjme testovací souprava v podobě plastové kazety, která se označí čárovým kódem, a do určené jamky (na pravém konci viz obrázek 12) se nakapou 4 kapky HC Dilution Buffer se stolicí 5. Po 10 minutách se odečítá výsledek, který se objeví v okénku pro odečet Obrázek 12 Stanovení antigenu Helicobacter pylori ve stolici testovací sada Pylori K-Set (vpravo), z níž vyjmutá testovací kazetka (v popředí), pufrové rozpouštědlo HC Dilution Buffer (uprostřed), sterilní zkumavka se vzorkem stolice (vlevo) Zdroj: autor 40

Hodnocení výsledku průkazu antigenu Helicobacter pylori ve stolici: Výsledky testů se odečítají na základě vzniklých linek. Negativní výsledek = vznikne linka pouze v místě C (C = kontrola) Pozitivní výsledek = vznikne linka v místě kontroly - v místě T (T = testovací pozice) vznikne linka - intenzita zbarvení odpovídá kvantitě antigenu Chybný výsledek = nevytvoří se kontrolní linka v místě C test je nutné opakovat Obrázek 13 Negativní výsledek testu průkazu antigenu Helicobacter pylori (Písmeno C vyjadřuje pozitivní kontrolu) Zdroj: Autor Obrázek 14 Pozitivní výsledek testu průkazu antigenu Helicobacter pylori Zdroj: [36] 41

2.4 Postanalytická fáze Po provedení příslušných vyšetření je vygenerován výsledek. Ve výsledku je uvedeno hodnocení jednotlivých testů: pozitivní či negativní. Správnost výsledku vyšetření je kontrolována vysokoškolským pracovníkem. Při pozitivní kultivaci je uveden název infekčního agens, citlivost k antibiotikům a metoda průkazu. Výsledky všech testů jsou evidovány v laboratorním programu a po kontrole správnosti jsou odesílány k tisku. 42

3 Statistické údaje V rámci této části absolventské práce byly zpracovány statistické údaje, které vycházely z dat poskytnutých pracovištěm. Tato data byla sbírána po dobu jednoho roku v období od 1. ledna 2019 do 31. prosince 2019. 1200 1000 Počet pozitivních a negativních vzorků ve sledovaném období 1000 800 600 400 200 0 21 Pozitivní vzorky Negativní vzorky Graf 1: Celkový počet negativních a pozitivních vzorků ve FN Motol za rok 2019 Na grafu č. 1 je vyjádřen celkový počet vyšetřených vzorků za rok 2019. V mikrobiologické laboratoři bylo zpracováno celkem 1021 vzorků k průkazu či vyloučení přítomnosti Helicobacter pylori, přičemž se ve výsledku jednalo pouze o 21 pozitivních vzorků. 43

Graf 2: Celkový počet vyšetřených vzorků v rámci sledovaného období v závislosti na pohlaví Graf č. 2 ukazuje celkový počet vzorků bioptického materiálu vyšetřených ve stanoveném období v závislosti na pohlaví. Celkem bylo vyšetřeno 1021 vzorků, z toho 490 u mužů a 531 u žen. Z předložených dat vyplývá, že téměř 48% vzorků pocházelo od mužů a 52% od žen. 44

Pozitivní vzorky v závislosti na pohlaví 10 žen 11 mužů Muži Ženy Graf 3 Vyjádření počtu pacientů s pozitivním průkazem H. pylori v závislosti na pohlaví Graf č. 3 vyjadřuje rovněž rozdělení pacientů na základě pohlaví, avšak zahrnuje pouze 21 pacientských vzorků, u nichž byla potvrzena přítomnost Helicobacter pylori. Z grafu vyplývá, že pozitivní průkaz onemocnění u žen (10) i mužů (11) je téměř na stejné úrovni. V procentech se tak jedná o 48% žen a 52% mužů. 45

Výskyt Helicobacter pylori v průběhu sledovaného období Měsíc Počet pacientů leden 1 únor 2 březen 1 duben 5 květen 1 červen 0 červenec 0 srpen 2 září 0 říjen 2 listopad 4 prosinec 3 Tabulka 4: Počet pacientů s pozitivním nálezem H. pylori v závislosti na době výskytu Tabulka č. 4 představuje výskyt helikobakterové infekce u pozitivních 21 pacientů v průběhu sledovaného období dvanácti měsíců. Z tabulky je patrné, že nejvyšší výskyt infekce byl zaznamenán v dubnu, kdy se jednalo o pět pozitivních nálezů. V listopadu se potvrdila infekce u čtyř pacientů a v prosinci u třech pacientů. V měsících únor, srpen a říjen byl pozitivní výskyt vždy u dvou pacientů a v lednu, březnu a květnu u jednoho. V červnu, červenci a září nebyl zaznamenán žádný pacient s pozitivním nálezem H. pylori. 46

Počet pozitivních pacientů v závislosti na ročním období Zima 19% pacientů Jaro 33% pacientů Podzim 38% pacientů Léto 10% pacientů Graf 4: Četnost pacientů s pozitivitou na H. pylori v závislosti na ročním období Graf č. 4 představuje vyhodnocení výsledků v závislosti na ročním období. Tento výzkum byl proveden s cílem porovnání výsledků s odbornou literaturou, ve které je uvedeno, že k infekcím, spojeným s patologickým působením Helicobacter pylori (zejména k vředové chorobě žaludku a duodena), dochází nejčastěji na jaře či na podzim [6]. Výše uvedené výsledky tabulky č. 4 i grafu č. 4 se s odbornou literaturou shodují, neboť přestože se jedná o nízký statistický soubor pacientů, nejvyšší výskyt byl zaznamenán hlavně v jarních a podzimních měsících. Z výše uvedeného grafu č. 4 vyplývá, že nejvyšší procento pacientů se vyskytuje na jaře (33 %) a na podzim (38 %). Léto z hlediska zkoumaného období představuje nejnižší výskyt pozitivních pacientů. V tomto období bylo pozitivních pouze 10 % pacientů. V zimě se jednalo o 19 % pacientů s pozitivním průkazem. 47

Laboratorní diagnostika Helicobacter pylori pomocí doporučených metod Pacient Pohlaví Věk Mikroskopie Ureázový test Kultivace Párový vzorek Mikroskopie Ureázový test 1 Muž 66 ++ Do 3 hod Neprovedena ++ Do 3 hod 2 Muž 75 Negativní Do 3 hod Pozitivní Negativní Do 3 hod 3 Muž 43 Negativní Do 3 hod Negativní Nezaslán Nezaslán 4 Muž 26 Negativní Do 3 hod Negativní Negativní Negativní 5 Žena 48 + Do 3 hod Pozitivní Negativní Negativní 6 Muž 51 ++ Do 3 hod Neprovedena Negativní Negativní 7 Žena 44 Negativní Po 20 min Negativní Negativní Negativní 8 Žena 66 Zcela oj. Do 3 hod Pozitivní Negativní Negativní 9 Žena 74 ++ Do 3 hod Neprovedena Negativní Negativní 10 Muž 24 Negativní Po 20 min Negativní Negativní Negativní 11 Žena 79 ++ Po 20 min Neprovedena Nezaslán Nezaslán 12 Žena 75 +++ Po 20 min Neprovedena +++ Po 20 min 13 Žena 66 +++ Po 20 min Neprovedena Negativní Negativní 14 Muž 76 ++ Do 3 hod Neprovedena Nezaslán Nezaslán 15 Muž 84 +++ Po 20 min Neprovedena Negativní Do 3 hod 16 Muž 63 ++ Po 20 min Neprovedena Negativní Negativní 17 Muž 82 + Po 20 min Neprovedena Negativní Negativní 18 Muž 16 +++ Po 20 min Pozitivní Nezaslán Nezaslán 19 Žena 72 + Negativní Negativní Nezaslán Nezaslán 20 Žena 50 ++ Do 3 hod Neprovedena ++ Do 3 hod 21 Žena 31 + Do 3 hod Pozitivní + Do 3 hod Tabulka 5: Testování pacientů pomocí různých kombinací laboratorních metod V tabulce č. 5 jsou předložena data týkající se jednotlivých pacientů, u kterých byl alespoň jeden z doporučených testů pozitivní. Jedná se o 21 pacientů, 10 žen a 11 mužů. Dále je uveden věk vyšetřovaného, věkový rozptyl je 16 až 84 let, většina pacientů je starších 60 let. Následně jsou uvedeny testy v pořadí, jak byly prováděny. Jako první je zmíněna mikroskopie, která se provádí rutinně u všech vyšetřovaných vzorků. U pěti vzorků nebyla bakterie Helicobacter pylori mikroskopicky prokázána. U pozitivního záchytu je uvedena kvantita pohybující se od jednoho do třech křížků. Ve 4 vzorcích byl masivní mikroskopický nález. V dalším sloupci jsou předloženy výsledky rychlého ureázového testu: u 9 vzorků byl test pozitivní do 20 minut, u 11 do 3 hodin po nanesení bioptického vzorku do testovací komůrky. U jednoho vzorku byl test negativní. Následná kultivace byla prováděna pouze u vzorků, které 48

vykazovaly pozitivitu alespoň v jednom z předchozích testů, a zároveň byl zaslán duplicitní vzorek určený právě pro kultivaci. U více než poloviny vzorků, konkrétně u 11, nebyla kultivace vůbec založena vzhledem k absenci duplicitního vzorku. U pěti vzorků byla kultivace úspěšná a bylo tedy možné provést stanovení citlivosti k lékům volby (viz tabulka č. 6). Poslední oddíl mapuje nálezy u párových vzorků (z antra nebo těla žaludku). U pěti pacientů nebyl párový vzorek zaslán, u 10 pacientů byl vzorek zaslán, ale jak mikroskopie, tak ureázový test byly negativní. 4 vzorky měly pozitivní mikroskopický nález i pozitivní ureázový test, u dvou pacientů byl pozitivní pouze ureázový test. Graf 5: Věkové rozložení pacientů s infekcí způsobenou H. pylori Graf č. 5 prezentuje věkové rozložení pacientů s pozitivním záchytem Helicobacter pylori jednou z uvedených metod. Největší podíl zaujímají pacienti ve věkové skupině nad 61 let (12 pacientů), naopak nejméně, jeden pacient, reprezentuje věkovou skupinu do 20 let. Ve věkové kategorii 21-40 let byla prokázána přítomnost bakterie u 3 pacientů, a ve skupině pacientů 41-60 let se jednalo o 5 případů infikovaných helikobakterem. 49

Stanovení citlivosti na antibiotika Antibiotikum Pacient Amoxicilin Clarithromycin Tetracyklin Rifampicin Levofloxacin Metronidazol 2 Citlivý Citlivý Rezistentní Rezistentní Citlivý Citlivý 5 Citlivý Rezistentní Citlivý Rezistentní Rezistentní Rezistentní 8 Citlivý Rezistentní Citlivý Rezistentní Rezistentní Rezistentní 18 Citlivý Citlivý Citlivý Rezistentní Citlivý Citlivý 21 Citlivý Rezistentní Rezistentní Rezistentní Rezistentní Citlivý Tabulka 6: Testování citlivosti antibiotik V tabulce č. 6 jsou výsledky testování citlivosti k lékům volby. Z předložených údajů vyplývá, že citlivost na antibiotické preparáty byla stanovena pouze u pěti pacientů, u kterých byl zaslán rovněž požadavek na provedení kultivace. Všechny vyšetřované kmeny byly citlivé k amoxicilinu, naopak všechny vykazovaly rezistenci k rifampicinu. Totožné byly výsledky u clarithromycinu a levofloxacinu: kmeny u pacienta č. 2 a 18 byly k oběma preparátům citlivé, u zbylých pacientů (5, 8 a 21) byla prokázána rezistence. U tetracyklinu a metronidazolu byla citlivost, resp. rezistence rozložena téměř rovnoměrně: 3 kmeny citlivé a 2 kmeny rezistentní. 50

Počet vzorků s požadavkem na vyšetření antigenu Helicobacter pylori Graf 6: Stanovení antigenu Helicobacter pylori ve stolici Ve výše uvedeném grafu č. 6 jsou prezentována data týkající se počtu vzorků, u kterých byl požadavek na průkaz antigenu Helicobacter pylori ve stolici. Celkem bylo vyšetřeno 163 vzorků, pozitivní byly pouze 4, u 159 vzorků nebyl antigen ve stolici prokázán. 51