Změny genomu a jeho exprese u chronické lymfocytární leukémie Šárka Pospíšilová Centrum molekulární biologie a genové terapie Interní hematoonkologická klinika LF MU a FN Brno Konference DNA Analýza V, Praha 4. června 2008
Molekulárn rní Diagnostika CLL CLL - lymfoproliferativní onemocnění způsobené monoklonální expanzí zralých B-lymfocytů exprimujících CD5+; nejčastější typ leukémie u dospělých v západním světě CGH Arrays Expresní Microarrays MicroRNA Arrays Proteinové Arrays Detekce genů a jejich exprese na úrovni DNA, RNA, mirna i proteinů
Prognostické markery u B-CLL Mutační status genu pro těžký řetězec imunoglobulinu Mutace v IgV H znamenají lepší prognózu (přežití 8 vs. 25 let) Mutační status genu pro p53 (do 2 let od diagnózy zemře 6x více pacientů s p53 mutací) Chromosomální aberace: Trizomie 12 Delece 11q22 (ATM) Delece 13q14 (mirna) Delece 17p13 (Tp53) Exprese CD38, ZAP-70 na povrchu B-CLL lymfocytů
Analýza genové exprese u B-CLL buněk RNA Vzorek A RNA Vzorek B Oligomery Hybridizace Scan A Scan B Microarray Obraz A Obraz B Kombinace a vyhodnocení obrazů pomocí softwaru
Třídění podle mutačního statusu IgVH: Mutovaní versus nemutovaní (průnik T-testu T a SAM) Significance Analysis of Microarrays (SAM) Skupiny genů, které rozdělují pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH Geny nejlépe rozlišuj ující pacienty s mutovaným a nemutovaným IgVH.
Analýza dat: PTM analýza (podle Pavlidis Template Matching) LPL (lipoprotein lipase) nejvýznamnější gen, identifikovaný pomocí SAM, byl použit jako templát pro Template Matching Analysis a byly nalezeny geny s expresním profilem podobným jako má LPL.
Expresní čipová analýza B-CLL buněk: VÝSLEDKY bylo nalezeno asi 50 genů s rozdílnou mírou exprese u mutovaných a nemutovaných IgVH Potenciální prognostické markery (nalezené ve shodě s literaturou): LPL (lipoproteinová lipáza), ADAM29 (A Disintegrin And Metalloproteinase domain 29), ZAP7O (Zeta-chain-Associated Proteinová Kináza) Nový prognostický marker významně korelující se statutem IgVH: LAG3 (lymphocyte-activation gene 3, CD223) má úlohu při regulaci homeostázy T-lymfocytů
Analýza genové exprese u B-CLL buněk: Gene Number of samples tested p-value Gene expression level in samples with unmutated IgVH LAG3 Lymphocyte activation gene 3 94 (103 +poly) < 0,001 up-regulated LPL Lipoprotein lipase 94 (103) < 0,001 up-regulated ZAP70 ζ-chain associated protein kinase 70 kda 94 (103) < 0,001 up-regulated AICDA Activation-induced cytidine deaminase 69 (72) 0,006 up-regulated BCL2 B-cell-leukemia/lymphoma 2 73 (82) 0,031 down- regulated CLLU1 Chronic lymphocytic leukemia upregulated 1 70 (78) 0,032 up-regulated TCF7 Transcription factor 7 23 (25) 0,047 down- regulated SEPT10 Septin 10 23 (25) 0,056 up-regulated ADAM29 A disintegrin and metalloproteinase domain 29 73 (82) 0,267 down- regulated
IgVH UNMUT (n = 40) IgVH MUT (n = 54) gen exprese POZITI VNÍ NEGATI VNÍ POZITI VNÍ NEGATI VNÍ Procento správně určeného mutačního statusu LPL ZAP70 LAG3 3 geny 39 (97,5%) 39 (97,5%) 40 (100,0%) 38 (95,0%) 1 (2,5%) 1 (2,5%) 0 (0%) 2 (5,0%) 9 (16,7%) 22 (40,7%) 36 (66,7%) 3 (5,6%) 45 (83,3%) 32 (59,3%) 18 (33,3%) 51 (94,4%) 89% 80% 62% 95%
Příklad praktického využití nových expresních markerů mutačního statutu IgVH Fragmenta tační analýza před p terapií: IgVH klon VH 3 30 byl identifikován jako mutovaný. Fragmenta tační analýza pop terapii: primárn rní IgVH klon byl potlačen a byl detekován n nový dominantní klon VH 1-1 69 identifikovaný jako nemutovaný..
MicroRNA aberantní exprese u B-CLL 13q14 locus is frequently deleted in CLL and mir-15a-mir-16-1 are down-regulated in more than 60% of CLL cases (Calin et al., PNAS 2002) mir-15 and mir-16 regulate Bcl2 (Cimmino et al., PNAS 2005; Calin et al., PNAS 2008) MicroRNAS could distinguish CLL samples that express unmutated IgVh gene from those that express mutated IgVh gene (Calin et al., NEJM 2005) mirnas could differentiate patients with a short interval from diagnosis to therapy (Calin et al., NEJM 2005)
mir15a mir16 mir17-5p mir17-3p mir18a mir19b mir19a mir20a mir20b mir21 mir23a mir23b mir24-2 mir29a mir29c mir29b mir34a mir34b mir34c mir92 mir142-3p mir142-5p mir146a mir146b mir155 mir181a mir181b mir181c mir181d mir195 mir221 mir222 mir223 mir372 mir373 Předběžné výsledky z QRT-PCR (analýza 35 microrna RNA) MICRORNA rozdílně exprimované u subtypů B-CLL (p=0.05): MUTATED IgVH VS. UNMUTATED IgVH: 1 GEN mir-18a MUTATED IgVH VS. ABNORMAL P53: 3 GENY mir-let 7, mir-92, mir-34 UNMUTATED IGVH VS. ABNORMAL P53: 3 GENY mir-let 7, mir-92, mir-34
Exprese mir-34a u B-CLL B pacientů mir-34a expression in patients ( vs. del/mut p53) 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 Normalised mirna 34a expression del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 del/mut p53 individual patients p= 0,00002 p= 0,000001 p= 0,27 p= 0,00001 18 16 16 14 14 12 10 8 6 4 Normalised mirna 34a expression 12 10 8 6 4 Normalised mirna 34a expression 2 2 0 0 Mean ±SE ±SD -2 Mean ±SE ±SD -2 unmut IGVH mut IGVH del/mut p53 del/mut p53 CLL subgroups CLL subgroups
DNA: Array-CGH u B-CLL pacientů CGH Labeling & Amplification Kits 44K Human CGH Microarray CGH Application Development Data Visualization & Analysis Tool
Rozlišení a pokrytí různých cytogenetických technik a technik založených na microarrays: Rozlišení Pokrytí Karyotypování > 10 Mb kompletní Cytogenetika acgh SKY > 2 Mb kompletní tradiční CGH > 2 Mb (cytoband) kompletní FISH (interfázní) 20 kb Sondově Specifické FISH (metafázní) 100 kb Sondově Specifické BAC 100 kb (Spektrální Genomika 2 Mb) kompletní cdna 2 kb pouze geny Oligo (60-mer) 0.06 kb kompletní
Využití Array-CGH pro detekci nebalancovaných chromozomových aberací Agilent Human Genome CGH Microarray; 4x44k CGH Microarrays 43,000 60-mer oligonukleotidových sond pokrytí celého genomu průměrná vzdálenost sond 30-35 kb 84% sond navrženo do intragenových oblastí (50% do intronů, 50% do exonů) + 16% sond do intergenových oblastí dobře charakterizovaný gen 1 sonda geny související s nádory 2 a více sond
Výsledky array-cgh u patienta č.1k: trisomie chromozomu 12, del 17p12-pter, del 18q12-q21, del 18q22-qter and monosomie chromozomu X; červeně = amplifikace, zeleně = delece chromozom 12 17 18 X p 13.32 p 13.2 p 12.3 p 12.1 p 11.22 p 13.2 p 12 p 11.31 p 11.22 p 22.32 p 22.2 p 22.12 p 21.3 p 21.1 q 12 q 13.12 q 13.2 q 14.1 q 14.3 q 21.1 q 21.31 q 21.33 q 23.1 q 23.3 q 24.12 q 24.21 q 24.23 q 24.32 q 12 q 21.2 q 21.32 q 22 q 23.2 q 24.1 q 24.3 q 25.2 q 12.1 q 12.3 q 21.2 q 21.32 q 22.1 q 22.3 p 11.3 p 11.22 q 12 q 13.2 q 21.1 q 21.31 q 21.33 q 22.2 q 23 q 25 q 26.2 q 27.1 q 27.3
Výsledky Array-CGH B-CLL B PacientaP cienta: del 13q14.2-q14.3 q14.3 chromozom 13
Kazuistika pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 del 13q14.2-q14.3 (3,7 Mb) včetně RB1
Kazuistika pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 del 17 včetně TP53
Kazuistika pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 del 2p24.2-p24.3, bialel. amp 2p24.3 (16027633-16135876) (MYCN)
Kazuistika pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 (del 5q14.3-q33.2(95 Mb), del 6q14.3-q22.1(40 Mb))
Kazuistika pacient Z: růžová 2005, hnědá 2006, béžová 2008 (del 18q21.2 (1Mb), bialel. amp 18q21.2 (3.5Mb), amp 18q21.31-q22.1 (8Mb))
Využití Array-CGH u B-CLL pacientů Komplexní analýza genomu Informace o amplifikacích a delecích jednotlivých genů včetně genů pro microrna Možnost průběžného sledování změn genomu v průběhu onemocnění (vliv léčby, změny při relapsu ) Výborné doplnění stávajících cytogenetických metod
Tp53 status u B-CLL pacientů Funkční analýza Tp53 pomocí FASAY 12% pacientů má Tp53 aberace 100% missense mutations 70% missense mutations
Distribuce Tp53 mutací srovnání s IARC mutační databází Identifikovali jsme 11 nových mutací dosud nepublikovaných v IARC databázi u B- CLL pacientů: Lys132Asn/Lys132Arg Val143Met Val157Gly/Val157Phe Val173Met Val216Met Tyr220Cys Tyr236Cys Tyr256Pro Cys275Tyr
Metodiky používané pro studium vlastností p53 mutantů: FASAY + Sekvenování (p53-mutované kolonie) I - FISH a array-cgh pro detekci 17p13 delece Western blotting pro analýzu hladiny proteinu Detekce funkčnosti proteinu p53: Real-Time PCR pro detekci exprese p53 - regulovaných genů Funkční proteinové čipy pro analýzu vazby protein-dna EMSA (electromobility shift assay) pro p53-dna interakce Reporter gene assays pro detekci aktivity mutantů v buňkách utlumení exprese wt-p53 a mut-p53 pomocí sirna/shrna, DNA expresí čipy a Real-time PCR
Funkční Proteinové Čipy pro analýzu aktivity p53 mutantů Cy3-labelled BAX promoter binding region
350,0 300,0 250,0 200,0 150,0 100,0 50,0 0,0 Příklad: vazba p53 mutantů na promotory genů GADD45 a mdm2 WT W 23A W23G R72P P82L M133T Q136X C141Y P151S P152L G154V R 175H E180K R 181C R 181H H 193R R196X R209X R213X P219S Y220C S227T H 233N H 233D N 235D N235S S241F G245C G245S G245D R 248W R 248Q I251M L252P T256I L257Q E258K L265P V272L R 273C R 273H P278L R280K E286A R306X R306P G325V R 337C L344P S392A NC1 GADD45 MDM2
Využit ití genomických přístupů u leukémi mií: výzkum i klinická praxe Jedinečné nástroje pro analýzu genomu a genové exprese objasnění funkce genů Význam pro molekulárn rní diagnostiku a personalizovanou medicínu
Poděkov kování : FN BRNO, Interní hematoonkologická klinika, Centrum Molekulární Biologieie a Genové Terapie Martin Trbušek Jana Kotaškov ková Jitka Malčíkov ková Boris Tichý Kateřina Staňo-Kozub Kozubík Šárka Pavlová Yvona Brychtová Michael Doubek Jiří Mayer Ústav patologie Jana Šmardová
Děkuji za pozornost