Příprava materiálu byla podpořena projektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253 Část 10 Chromatografie v reverzním/obráceném módu (Reveresed-Phase chromatography, RP) Princip separace Termín chromatografie v reverzním módu popisuje situaci, kdy stacionární fáze je méně polární než fáze mobilní. Chemicky vázaný oktadecylsilan (ODS), n-alkan s 18 uhlíky, reprezentuje nejčastěji používanou stacionární fázi. Dalšími alternativami je vázaná oktylová skupina (C 8 ) nebo kratší alkyly a také cyklohexyl nebo fenyl. Fenylové skupiny jsou polárnější než alkyly. Voda bývá označována jako nejsilnější eluční médium v chromatografii, ale je to pravda pouze pro adsorpční chromatografii. Voda silně interaguje s aktivními centry silikagelu nebo aluminy, čím silně omezuje adsorpci molekul vzorku a ty jsou rychle eluovány. Pravý opak platí v reverzním módu: voda nesmáčí nepolární (hydrofobní) alkylové skupiny a nijak s nimi neinteraguje. Představuje proto rozpouštědlo s nejnižší eluční silou a vede k nevětší retenci analytů. Čím více je vody v mobilní fázi, tím jsou delší retenční časy. Tento fakt zachycuje i chromatogram níže. Benzen (2), chlorbenzen (3), o-dichlorbenzen (4) a jodbenzen (5) byly z kolony s reverzní fází eluovány směsí methanol voda v různých poměrech (jako 1 je označen signál solventu). Složky vzorku jsou zadržovány reverzní fází tím více, čím méně jsou polární. Retence proto klesá v řadě: alifatické uhlovodíky > látky obsahující indukované dipóly (např. CCl 4 ) > látky
obsahující permanentní dipóly (např. CHCl 3 ) > slabé Lewisovy zásady (ethery, aldehydy, ketony) > silné Lewisovy zásady (aminy) > slabé Lewisovy kyseliny (alkoholy, fenoly) > silné Lewisovy kyseliny (karboxylové kyseliny). Retenční čas také narůstá s rostoucím počtem uhlíků v řetezci, jak je patrné ze separace dec-1-enu (1), undec-1-enu (2), dodec-1-enu (3), tridec-1-enu (4) a tetradec-1-enu (5) na koloně ODS (viz obrázek níže). Obecným pravidlem je, že retence narůstá s rostoucí kontaktní plochou mezi molekulou analytu a stacionární fází, tj. s rostoucím počtem molekul vody, které jsou při interakci ze stacionární fáze uvolněny.
Látky s rozvětvenými řetězci jsou eluovány snadněji než odpovídající lineární řetězce. Nicméně přesný retenční mechanismus na reverzních fázích je složitý a není detailně popsán. Mobilní fáze při chromatografii v RP módu Mobilní fáze je obvykle tvořena směsí vody nebo vodného pufru a s vodou mísitelným organickým solventem, např.: Nicméně pro separaci vysoce nepolárních analytů v RP chromatografii je třeba použít nevodná rozpouštědla. Protože se v RP módu často používá gradientová eluce, musí být rozpouštědla vysoce čistá. Směsi vody s organickými rozpouštědly mají často výrazně vyšší viskozitu než čisté složky. Tento jev pro běžně používané směsi methanol voda, tetrahydrofuran voda a acetonitril voda je zachycen níže na obrázku. Maximální viskozity směsi s methanolem je dosaženo pro 40 % vody a dosahuje hodnoty 1,62 mpa s (25 C), což je skoro trojnásobek viskozity čistého methanolu a dvojnásobek viskozity vody. Tlakový spád na koloně je úměrný viskozitě a při gradientové eluci se mění. Vysoké hodnoty viskozity dosahují také směsi 80 % kyseliny octové ve vodě (2,7 mpa s při 20 C) nebo 40 % ethanolu ve vodě (2,8 mpa s při 20 C).
Voda užitá pro HPLC musí být speciálně čištěna. Voda čištěná iontoměniči nemá dostatečnou čistotu a dvojnásobně destilovaná voda může mít dokonce vyšší obsah organických látek. Vodu pro HPLC je proto nejlepší kupovat nebo použít vodu získanou několikastupňovým čistícím systémem. Sterilní vodu lze získat filtrací přes membránový filtr 0,2 µm. Methanol má tu nevýhodu, že jeho směsi s vodou mají relativně vysokou viskozitu (viz výše), následkem čehož je tlak v systému mnohem vyšší než s jinými mobilními fázemi. Při manuální přípravě směsí methanolu a vody je třeba buď odděleně vážit obě komponenty, nebo odděleně odměřit objemy. Důvodem je výrazná objemová kontrakce, která způsobí, že konečné množství methanolu je větší než 50%, pokud byl počáteční objem 500 ml vody doplněn po rysku methanolem v odměrné baňce s objemem 1000 ml. Proto se liší retenční časy ve směsi methanol voda, která byla připravena ručně a vysokotlakým gradientem. Má-li eluent obsahovat soli pufru nebo ion-párová činidla, je preferovaným organickým rozpouštědlem methanol, neboť v něm jsou tyto látky rozpustnější než např. v acetonitrilu nebo terahydrofuranu.
Acetonitril je drahý, zvláště pokud je požadována vysoká čistota, aby neabsorboval v UV oblasti. Viskozita nečiní problémy. Při regeneraci acetonitrilu destilací vzniká azeotrop s bodem varu 76,7 C a obsahem acetonitrilu 84 %. Tetrahydrofuran je velice zajímavé rozpouštědlo z hlediska jeho vlivu na selektivitu separace. Jeho hrana absorpce UV 220 nm jej relativně vysoko. Obnovení počáteční rovnováhy po gradientové eluci s tetrahydrofuranem je pomalejší než s methanolem nebo acetonitrilem. Jakmile se jednou otevře láhev s THF (čistoty pro HPLC), rychle se začnou tvořit peroxidy, které mohou reagovat s analyty, a navíc jsou potenciálně nebezpěčné. V mnoha případech se nedoporučuje používat mobilní fáze s méně než 10 % organického rozpouštědla ve vodě. Je-li obsah takto nízký nebo nižší, nachází se stacionární fáze tohoto kartáčového typu (např. s alkyly C 18 ) ve špatně definované konformaci a ustavení rovnováhy trvá dlouhou dobu. (Ani pro gradienty se nedoporučuje začínat se složením 0 % B, ale raději alespoň 10 % B.) V prostředí s obsahem organického rozpouštědla vyšším než 10 % jsou alifatické řetězce více méně narovnány směrem od povrchu, zatímco při vyšším obsahu vody dochází k tzv. kolapsu, kdy analys nemůže interagovat s vnitřním povrchem pórů sorbetu, protože vysoce hydrofilní mobilní fáze povrch nesmáčí a nevstupuje do pórů. Existují ovšem i speciálně vyvinuté stacionární fáze vhodné pro analýzy s velkým obsahem vody (tzv. polar-embedded phases). Selektivita s síla solventu Trojúhelník selektivity s řadou solventů byl diskutován v předcházejících částech. Selektivita eluentu při separacích v reverzním módu je patrná z tohoto trojúhelníku, neboť efekty lokalizace, důležité v adsorpční chromatografii, zde nehrají žádnou roli. Pohled na obrázek níže ukazuje, že tři rozpouštědla, methanol, acetonitril a tetrahydrofuran jsou vhodnou volbou pro optimalizaci selektivity. V obrázku je trojúhelník jen s těmito třemi rozpouštědly. Obvyklým rozpouštědlem A v chromatografii na reverzních fázích je voda nebo vodný pufr. Síla binární směsi není v reverzním módu zcela funkcí obsahu B, ale závisí i na vlastnostech analytu a stacionární fáze.
Lze však získat několik odhadů, které umožní získat dobrou aproximaci složení mobilní fáze, jestliže je nutné vyzkoušet k nalezení nejlepší selektivity více než jeden solvent. Lze použít následující rovnici: Φ B1 / P B1 = Φ B2 / P B2 kde Φ je objemový zlomek daného rozpouštědla a P je jeho polarita v reverzní fázi. Byly navrženy určité hodnoty P (pro vodu je P vždy 0); následující údaje pocházejí od Snydera a kol.: P voda 0 P methanol 3,0 P acetonitril 3,1 P tetrahydrofuran 4,4 Alternativně lze použít i nomogram, který je založen na mnoha experimentálních datech získaných pro malé organických molekuly. Ve skutečnosti, by každá z těchto látek dávala mírně odlišný nomogram; v obr. níže je grafická reprezentace průměrného chování (může být pro velké molekuly poněkud odlišné). Příklad Poskytuje-li separace s 70 % methanolu dobrou retenci, ale špatnou selektivitu, jaká jiná směs by mohla být odzkoušena?
Řešení Z rovnice: Φ P 0,7 3,0 MeOH MeOH Φ ACN = = = = P ACN 3,1 0,68 68 % nebo 0,7 3,0 Φ THF = = 0, 48 = 48 % 4,4 Z nomogramu: Φ ACN = 60 % nebo Φ THF = 45 % Je zřejmé, že obě metody dávají pouze hrubý odhad. Obrázek dole ukazuje vliv změny složení mobilní fáze na separaci. Vzorkem byl extrakt z devětsilu (Petasites hybridus). Separace je nejlepší s acetonitrilem. Tetrahydrofuran dává široké málo rozdělené píky. S methanolem jsou píky rozmyté (chvostují) a ve druhé části chromatogramu je selektivita oproti acetonitrilu horší. Pro jemné vyladění selektivity lze přidat malé množství třetího rozpouštědla. Protože to ale obvykle komplikuje vývoj metody, všeobecně se to nedoporučuje. Možnými aditivy jsou dichlormethan (pro chlorované analyty) nebo N,N-dimethylformamid (pro aromatické aminy a N-heterocykly).
Nastavení hodnoty ph pufru je pro ionizované analyty zcela zásadní. Mají-li být separovány bazické látky, může být nutné přidat konkurenční bázi, např. malé množství triethylaminu, která interaguje se zbylými silanolovými skupinami jinak přístupnými analytu. V tomto případě je však mnohem vhodnější použít stacionární fázi vhodnou pro takový typ vzorku. Jako univerzální aditivum se doporučuje octan amonný, ale při použití moderních stacionárních fází nebývá nezbytný. Stacionární fáze Stacionární fáze v reverzním módu jsou více nebo méně hydrofobní a tato vlastnost je charakterizována hydrofobicitou H. Obecně platí, že retenční časy jsou tím delší, čím více
uhlíkových atomů tvoří stacionární fázi. (Důvodem je to, že objem vázaných nepolárních řetězců, tj. objem aktuální stacionární fáze, je pro delší řetězce vyšší než pro kratší řetězce; retence je přímo úměrná objemovému poměru stacionární a mobilní fáze.tento jev zachycuje níže ukázaný obrázek. Vliv délky uhlíkového řetězce vázaného na silikagelu na retenční čas hydrofobních solutů Znamená to tedy, že retence je větší čím delší je alkylová část (C 18 je delší než C 8 ), čím větší je hustota pokrytí těmito řetězci (počet skupin na nm 2 na povrchu), čím větší je stupeň pokrytí zbytkových silanolových skupin silanizačním činidlem (end-capping), čím silnější je vrstva organické stacionární fáze (polymerní vrstvy mají větší retenci než monomerní) nebo souhrnně, čím větší je obsah uhlíku na stacionární fázi určený elementární analýzou. Větší retence znamená, že analýza trvá delší dobu nebo je třeba vyšší obsah rozpouštědla B. Stacionární fáze s vysokou retencí jsou vhodné pro polární analyty, které nemají dostatečnou retenci na fázích s nízkým obsahem uhlíku ani v mobilních fázích s vysokým obsahem vody. Nepolární analyty je vhodné separovat na stacionárních fázích s nízkým obsahem uhlíku, kde mají kratší retenční časy a pro jejich eluci stačí méně organického rozpouštědla. Další vlastností reverzních fází je silanolová aktivita. Jak bylo zmíněno v předcházejících částech textu, není možné ze sterických důvodů derivatizovat veškeré silanolové skupiny na povrchu silikagelu. Zbylé silanoly je třeba odstínit (end-capping) reakcí se sekundárním
derivatizačním činidlem nebo stericky odstínit. Komerčně dostupné reverzní fáze se výrazně liší v silanolové aktivitě, protože zbylé silanoly nemají odstíněny kompletně. Ačkoliv pro většinu separací jsou aktivní silanoly nežádoucí (obzvlášť pro separace bazických látek), pro separaci silně hydrofilních (polárních) látek jsou stacionární fáze s určitou silanolovou aktivitou výhodné. Silanolová aktivita má dva rysy: 1) neionizované silanoly (v kyselé mobilní fázi) jsou donory vodíkových vazeb s určitým stupněm kyselosti A, 2) ionizované silanoly (v neutrálních nebo bazických mobilních fázích) mají kationickou výměnnou aktivitu C. Další charakteristikou reverzních fází je míra jejich chování jako akceptory vodíkových vazeb (parametr B) pravděpodobně díky sorbovaným molekulám vody a jejich sterický odpor S vzhledem k objemným analytům. Každá reverzní fáze na trhu má svůj soubor měřitelných parametrů H, A, B, C a S. Mohou být stanoveny, prezentovány a porovnávány. Tyto parametry pomáhají identifikovat vzájemně podobné a odlišné sorbenty. Parametr vzdálenost/odlišnost F S se vyjadřuje faktorem shody dvou kolon: F [12,5( H H )] + [100( S S )] + [30( A A )] 2 2 2 2 1 2 1 2 1 S = 2 2 + [143( B2 B1 )] + [83( C2 C1 )] Dvě fáze 1 a 2 jsou shodné (a jedna může nahradit druhou) jestliže je F S nízké, tj. 3. Naopak se liší (a má cenu kolonu 2 vyzkoušet, jestliže kolona 1 nedává uspokojivou separaci), jestliže je F S vysoké. Hodnoty C se určují zvlášť pro použití kolony v kyselé mobilní fázi (ph = 2,8) a při neutrálním ph = 7,0. Neobsahuje-li vzorek kyseliny a ionizované báze, parametry B a C jsou irelevantní a nezahrnují se do výpočtu F S. Příklad
Vypočítejte hodnoty F S fází Prontosil C18 AQ a Platinum EPS C18 vůči oktadecylové fázi Genesis AQ, jestliže byly použity v kyselé mobilní fázi. Parametry selektivity jsou následující (dle Snyder, Dolan a Carr, J. Chromatogr. AError! Bookmark not defined.) Genesis AQ Prontosil C18 AQ Platinum EPS C18 H 0,961 0,973 0,614 S 0,037 0,011 0,162 A 0,155 0,057 0,330 B 0,008 0,006 0,018 C(2,8) 0,061 0,125 0,720 C(7,0) 0,234 0,288 1,730 Řešení Protože mobilní fáze je kyselá, musí být ve výpočtu zahrnut i parametr C (2,8). Srovnání kolony Prontosil C18 AQ (kolona 1) a Genesis AQ (kolona 2): F = [12,5(0,973 0, 961)] + [100(0, 011 0, 037)] + [30( 0, 057 + 0,155)] 2 2 2 S 2 2 = 7,7 + [143(0, 006 0, 008)] + [83(0,125 0, 061)] Analogicky vypočítaná hodnota F S pro Platinum EPS C18 versus Genesis AQ je 58. Kolona Prontosil je velmi podobná koloně Genesis, ačkoliv nejsou obě zcela identické. Mohou být vzájemně nahrazeny, není-li jedna z nich dostupná. Na druhé straně, Platinum se liší od Genesis hodně a nelze jí použít místo ní. Nicméně může být zajímavé ji použít pro kontrolu, zda jsou všechny píky opravdu separovány při validaci metody. Výsledky těchto výpočtů potvrzují chromatogramy níže.
F S je mírou odlišnosti dvou stacionárních fází v pětirozměrném prostoru vytýčeném osami H, S, A, B a C. Takový prostor si lze těžko představit, neboť naše vnímání je limitováno na dva nebo tři rozměry. Obrázek níže ukazuje rozdělení několika fází C 8 a C 18 ve dvoujrozměrném souřadném systému hydrofobicity a silanolové aktivity (silanolová aktivita nebyla separována do dvou dříve zmíněných parametrů A a C). Fáze C 8 jsou méně hydrofobní než C 18, proto jsou lokalizovány v levé polovině grafu, zatímco oktadecylové fáze jsou převážně v pravé horní polovině. Moderní fáze s vynikajícími a dobře definovaným způsobem vazby modifikujícího (zde hydrofobního) ligandu na silikagel s nízkým obsahem kovů jsou ve spodní části grafu, kdežto staré fáze jsou v části horní. Tyto dvojrozměrné reprezentace jsou užitečné, nicméně celý koncept parametru F S je mnohem komplexnější.
Pro separaci bazických analytů se doporučuje použít takové stacionární fáze, které jsou pro tento typ látek určené. Jinak píky chvostují (což lze potlačit aditivy do mobilní fáze, ale tento postup není elegantní). Protože se rovnováha mezi mobilní a stacionární fází při chromatografii na reverzních fázích ustavuje rychle, snadno lze provádět gradientovou eluci. Čas potřebný pro znovuobnovení rovnováhy musí být určen individuálně, ale v mnoha případech stačí čas odpovídající pěti objemům kolony k dosažení reprodukovatelných výsledků. Vývoj metody při chromatografii na reverzních fázích Při separacích na reverzních fázích je obvykle prvním krokem při vývoji metody použití gradientu z 10 na 100 % solventu B. Doporučený postup pro neionizovatelné analyty Je dobré použit stacionární fázi C 8 nebo C 18 s mobilní fází voda methanol bez pufru při asi 40 C, pokud je k dispozici termostat (jinak při teplotě laboratoře).
1. Nastavit % B nebo rozsah gradientu tak, aby retenční faktory byly mezi 1 a 10 (nebo 1 a 20 pro obtížné separace). Pokud není separace dobrá, změnit selektivitu kroky v následujícím pořadí: 2. Změnit organické rozpouštědlo B. 3. Použít jako složku B směs organických rozpouštědel. 4. Vybrat jinou stacionární fázi (pokud možno jiného typu. V tomto případě bude pravděpodobně nutné začít znova krokem 1. 5 Změnit teplotu. 6. Optimalizovat fyzikální parametry jako rozměry kolony, velikost částic nebo rychlost průtoku mobilní fáze. Doporučený postup pro iontové analyty Použít stacionární fáze C 8 nebo C 18 vhodné pro bazické analyty s mobilní fází pufrmethanol s pufrem o ph = 2,5 při asi 40 C, pokud je k dispozici termostat. 1. Nastavit % B nebo rozsah gradientu. Pokud není separace dobrá: 2. (a) změnit ph nebo (b) použít iontově-párovou chromatografii. 3. Nastavit % B. 4. Změnit rozpouštědlo B. 5. (a) změnit ph nebo (b) změnit ph a činidlo pro tvorbu iontových párů 6. Změnit teplotu. 7. Změnit stacionární fázi na fenylovou nebo s kyano modifikaci. 8. Optimalizovat fyzikální parametry.
Pokud se ani přes tyto kroky separace nezlepší, bude nutné použít jinou separační metodu (iontově-výměnnou, adsorpční nebo vylučovací chromatografii). Jak již bylo uvedeno, bazické analyty mohou být problematické. Důvod je znázorněn níže na obrázku. Pokud je zásada ionizována stejně jako přítomné zbylé silanolové skupiny (neutrální ph), projeví se smíšený retenční mechanismus založený jak na hydrofobních, tak na iontových interakcích, což vede k chvostování a nestabilním podmínkám separace. Smíšený mechanismus lze v některých případech potlačit použitím pufrů v mobilní fázi. Jestliže to nepomůže, je doporučené pracovat při kyselém ph, protože mnoho stacionárních fází na bázi silikagelu není stabilních při vysokém ph. Nejslibnější jsou zde speciálně upravené stacionární fáze pro separaci bazických analytů, mají nízký obsah volných silanolů, které jsou dobře stíněné, jsou založené na vysoce čistém silikagelu s velmi nízkými koncentracemi kationtů těžkých kovů, nebo obsahují další navázané polární skupiny. Kyselé analyty nejsou kritické, protože se nemůže uplatnit iontová interakce (aniont analytu se neváže na aniontovou formou disociovaného silanolu). Obecně by se nemělo zapomenout na to, že ionizované analyty jsou hydrofilní, a proto mají nízkou retenci. Při nízkém ph se to týká zásad, při vysokém ph kyselin. Aplikace Běžné vzorky separované technikou RP jsou vodné roztoky např. biologických vzorků, farmaceutických formulací, nápojů apod. Protože voda je nejslabším eluentem, mohou být vodné vzorky přímo dávkovány bez zvláštní předúpravy (ačkoliv se velmi doporučuje filtrace nebo centrifugace). Tablety sedativa byly rozpuštěny ve vodě a roztok byl přefiltrován a
nadávkován. Jakékoliv jiné alternativní metody analýzy vzorků tohoto typu léčiv trvají mnohem déle. Vynikající účinnost separace metodou RP-HPLC v biotechnologickém výzkumu je dokumentována v dalším chromatogramu. Je zde separace tryptického hydrolyzátu normální a mutované formy tkáňového plasminogenového aktivátoru. Tento protein je tvořen 527 aminokyselinami a má molekulovou hmotnost ~ 67 000 Da. Mutovaná forma se liší jedinou aminokyselinou, což vede ke změně retenčního času jednoho specifického fragmentu.
17 polycyklických aromatických uhlovodíků, které jsou v analýze životního prostředí označeny za prioritní polutanty, lze separovat během 15 minut.
Obrázek níže zachycuje separaci komplexní směsi aromatických látek v benzínu s takovým rozlišením, které lze obvykle spíše očekávat od separace plynovou chromatografií s kapilární kolonou. Hydrofobně interakční chromatografie Interakce mezi analytem a reverzní fází mohou být tak silné, že vodná mobilní fáze bez přídavku organického rozpouštědla by byla příliš slabá. Organická rozpouštědla však nejsou při některých separacích proteinů použitelná, mohla by způsobit jejich denaturaci a následnou ztrátu biologické aktivity. Čistě vodné mobilní fáze jsou vhodné pouze pro separaci na slabě hydrofobních stacionárních fázích; byly proto vyvinuty stacionární fáze s desetinou až setinou obsahu uhlíku běžných reverzních fází. Dosahuje se toho nízkým povrchovým pokrytím funkčními skupinami s krátkými řetězci, jakými jsou např. butyl nebo fenyl. Proteiny jsou pak
zadržovány v systému pomocí mobilní fáze mající vysoký obsah solí (např. 1 mol l -1 a více) a eluovány gradientem klesající koncentraci této soli. Tato pro bílkoviny vhodná metoda separace, která je variantou chromatografie na reverzní fázi, se označuje jako hydrofobně interakční chromatografie (HIC z angl. hydrophobic interaction chromatography; obr. Níže, separace několika peptidů technikou HIC na RP klesající koncentrací soli ve vodě).
Jak je patrné z tab. 10.1, složení mobilní fáze má výrazný vliv na retenční chování. Další příklad je ukázán ve Figure 7.4.