Praktikum č. 9: Mikrobiologická diagnostika veterinárně významných zástupců rodů Borrelia, Brachyspira, Leptospira, Treponema. Cíle: 1. Seznámit se s morfologií a kultivačními vlastnostmi veterinárně významných zástupců spirochet. 2. Naučit se postupy bakteriologické diagnosticky borrelióz, leptospirózy, dyzentérie prasat. S P I R O C H É T Y Rod: Borrelia Borrelie jsou spirochety vysoce adaptované k přenosu z krev sajících členovců na obratlovce, u nichž některé druhy mohou vyvolat onemocnění označovaná jako borreliózy. Přehled vybraných druhů patogenních borrelií a jejich vektorů: B. anserina Hostitelem je drůbež v tropických a subtropických oblastech, přenašečem jsou klíšťata (Argas sp.) a krev sající hmyz. B. burgdorferi sensu lato (B. afzelii, B. andersonii, B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. japonica, a další) Původce Lymeské borreliózy. Postihován je člověk, z domácích zvířat hlavně pes, příležitostně kůň, skot a ovce. Přenašečem jsou klíšťata (Ixodes sp.). B. theileri - spirochetóza skotu, ovcí, koní (Afrika, Austrálie) B. coriaceae - původce epizootických abortů skotu (USA) B. anserina 8-20 µm dlouhé borrelie hledáme v roztěrech z krve, sleziny a jater. Nativní preparát mikroskopujeme technikou temného pole, můžeme barvit podle Giemsy, nebo lze využít imunofluorescenční techniky. Kultivaci provádíme na 6-10 denních kuřecích embryích. Pro důkaz antigenu nebo specifických protilátek lze použít imunodifusní testy. B. theileri Původce prokazujeme v krvi v horečnaté fázi onemocnění v nativním preparátu technikou temného pole nebo v roztěrech barvených podle Giemsy (20-30 µm dlouhé buňky). B. burgdorferi sensu lato Většina infekcí je subklinických. Sérologický průzkum ukazuje častou expozici lidí a zvířat v endemických oblastech k infekci borreliemi. Klinické příznaky závisí na lokalizaci borrelií 54
v organismu hostitele. U psů jsou uváděny horečka, latargie, artritídy, poruchy funkce srdce, ledvin a CNS. U koní jsou příznaky obdobné navíc je diagnostikována laminitída, uveitída, nefritída, hepatitída a encefalitída. Laminitída byla zjištěna u ovcí a skotu. Mikrobiologická diagnostika je komplikována nízkým počtem původců ve vzorcích z klinicky nemocných zvířat a náročností kultivace. Nejdříve se posoudí předchorobí (pohyb v endemické oblasti, přisátí klíšťat, charakteristické příznaky). Možný je průkaz borrelií v roztěrech z tkání a kloubních tekutin technikou temného pole, barvení podle Giemsy nebo imunofluorescenčními technikami (10-30 µm dlouhé buňky), ale výsledky je velmi těžké interpretovat. Kultivace je náročná a provádí se pouze ve specializovaných laboratořích, k množení borrelií se používá např. modifikované médium podle Kelleyho ve kterém se vzorky inkubují 6 týdnů za mikroaerofilních podmínek. K průkazu nízkého počtu borrelií ve vzorcích slouží rovněž techniky molekulární biologie (PCR), které umožňují rozlišit jednotlivá genospecies. Nejvíce je při diagnostice využíván průkaz specifických protilátek třídy IgM (nepřímá imunofluorescence, citlivější ELISA nebo Western imunoblot). Vzhledem k tomu, že v endemických oblastech jsou časté subklinické infekce, samotný průkaz vysokých titrů protilátek infekci nepotvrzuje. Rod Brachyspira Brachyspira hyodysenteriae Původce dyzentérie prasat, která postihuje hlavně prasata ve fázi výkrmu a způsobuje v chovech závažné ekonomické ztráty. Při patogenezi onemocnění se uplatňuje aktivní pohyb brachyspir v hlenu GIT, hemolytické a cytotoxické působení toxinů. Na rozvoji charakteristických patoanatomických změn na sliznici tlustého střeva (hemoragický až nekroticko - difteroidní zánět) se mohou společně s brachyspirami uplatňovat i další mikrobní druhy (např. Fusobacterium necrophorum, Bacteroides fragilis). Onemocnění je provázeno průjmem s výraznou příměsí krve a hlenu. Brachyspira pilosicoli Původce spirochetózy střeva prasat (chronický zánět tlustého střeva). Tento druh brachyspir se jedním koncem zanořuje do apikálního konce enterocytů tlustého střeva bez porušení inegrity buněčné memrány, tak indukuje zánětlivou reakci sliznice. Velký počet přichycených brachyspir se v histologických řezech sliznice jeví jako falešný kartáčový lem. Onemocnění je provázeno občasnými průjmy, omezená funkce tlustého střeva vede ke snížení přírůstků. B.pilosicoli bývá kromně prasat izolována ze psů, ptáků i člověka. Brachyspira intermedia Tento druh je považován za původce spirochetové kolitis prasat. Brachyspira alvinipuli Původce spirochetózy střeva drůbeže. Vyšetřovaný materiál: 1. rektální výtěry se vkládají se do transportního média např. dle Amiese s aktivním uhlím. 2. z uhynulých zvířat lze odebrat změněnou sliznici slepého střeva nebo kolónu. 3. výkaly nemocných zvířat se mohou odebírat do pufrovaného fyziologického roztoku jako 10% suspenze. 55
Mikroskopický průkaz. Nejvhodnějším materiá-lem pro mikroskopické vyšetření jsou seškraby ze změněné sliznice střeva nebo výkaly. Suspenzi vzorku ve fyziologickém roztoku mikroskopujeme na tmavém poli nebo ve fázovém kontrastu. Fixované roztěry a otiskové preparáty barvíme ředěným karbolfuchsinem nebo krystalovou violetí 4-6 minut, impregnujeme stříbrem nebo vyšetříme imunofluorescenční technikou. Když se podaří při zvětšení 1000x zastavit 3-5 typických buněk, je nález považován za velmi průkazný, zvláště jsou-li u prasat zjištěny charakteristické klinické příznaky. B.hyodysenteriae tvoří 0,26-0,36 µm široké a 6-10 µm dlouhé buňky s 2-4 spirálami. Při vyšetřování nativních preparátů je patrný charakteristický flexní pohyb, provázený rotací kolem vlastní osy v podobě lodního šroubu nebo vývrtky). Kultivační průkaz. B.hyodysenteriae je anaerobní mikroorganismus, který snáší jen nízkou koncentraci kyslíku. Dobře roste na čerstvě připravených nebo redukovaných půdách s tryptózou a sójovým peptonem, obohacených o 5-15% ovčí krve a 400 µg. ml -1 spectinomycinu, případně směs spectinomycinu, vankomycinu a colistinu. K obohacení tekutých půd je možno použít i 10% bovinního fetálního, telecího nebo králičího séra. Vyšetřované vzorky kultivujeme přímo na pevná selektivní média nebo vzorky zpracujeme náročnějším postupem, který je založen na filtraci suspenze. Ze seškrabů změněné střevní sliznice nebo výkalů připravíme 10% suspenzi ve fyziologickém roztoku a odstředíme při nízkých otáčkách. Supernatant se zfiltruje přes membránové filtry. Naočkované půdy se inkubují v atmosféře H 2 + CO 2 při teplotě 37 o nebo 42 o C po 2-6 dnů. Identifikace. Kultury serpulin rostou ve formě jemného průsvitného filmu, který přesahuje o 0,5-1 mm inokulační čáry, tvoří kolonie o průměru 0,5-3 mm. B.hyodysenteriae vytváří zónu úplné hemolýzy, která se při prodloužené inkubaci zvětšuje. B.pilosicoli a nepatogenní B.innocens tvoří částečnou hemolýzu.v nativním nebo fixovaném preparátě ověříme přítomnost typických spirálovitě zakřivených buněk. Získané primokultury serpulin lze diferencovat polymerázovou řetězovou reakcí. Diferenciální diagnostika. V tlustém střevě prasat se přirozeně vyskytují i nepatogenní treponemy jako např. B. innocens a B.murdochi, které ztěžují přímé vyhodnocování nativních i fixovaných preparátů. Tabulka č. 4: Biochemická aktivita brachyspir porciního původu VLASTNOST B.hyodysenteriae B.pilosicoli B.innocens β hemolýza úplná částečná částečná indol + - - hydrolýza Na-hippurátu - + - α - glukozidáza + - - α - galaktozidáza - + + β - glukozidáza + - + Rod: Treponema T. paraluiscuniculi Je to původce spirochetózy králíků. Je založena především na mikroskopickém průkazu treponem ve změněném sekretu sliznic pohlavní aparátu králíků a v sekretu pod strupy. 56
T. pallidum Jedná se o původce syfilitídy člověka (lues, syphilis, přijíce) Rod: Leptospira Rod Leptospira se dříve členil na dva druhy, patogenní L.interrogans a saprofytický L.biflexa. Dnes se druhy leptospir (genospecies) klasifikují na základě homologie DNA a antigenní struktury do několika genospecies (L.borgpetersenii, L.interrogans sensu stricto, L.kirchneri, L.meyeri, L.weilii aj.), 23 sérologických skupin a více než 250 sérovarů. Sérovary se společným antigenem náleží do společné sérologické skupiny. Existují sérovary sérologicky příbuzné, které patří dle odlišností v DNA do různých druhů. Např. sérovar hardjo patří k dvěma různým druhům, L.borgpetersenii a L.interrogans. Leptospiry vyvolávají leptospirózy, což jsou celosvětově rozšířené infekce člověka a zvířat, jejichž rezervoáry jsou různé druhy zvířat. Leptospirózy se nejčastěji klinicky manifestují: Kůň latentní infekce (s poz. titrem protilátek) periodická ophtalmie ( měsíční slepota ) akutní icterohemoragická a meningo-encefalitická forma (horečka, anorexie, deprese, icterus, občasné aborty) skot latentní infekce (někdy provázené leptospirurií) aborty neplodnost (L. interrogans serovar hardjo) porody slabých telat (neonatální mortalita) akutní infekce - hematurie a icterus, sporadicky i nervové příznaky prasata primárně latentní infekce (často provázené leptospirurií - L. interrogans serovar pomona) aborty, neplodnost (L. interrogans serovar pomona, L. interrogans serovar icterohaemorhagiae) akutní infekce (haemoglobinurie, horečka, žloutenka) pes akutní forma icterohemoragická horečka (v prvních 3 dnech), s urémií a nervovými příznaky pak generalizované onemocnění chronická forma únava, malátnost, nechutenství, křeče, poruchy gastrointestinálního traktu latentní forma pozitivní titr protilátek, vylučování leptospir močí U koček se leptospiróza vyskytuje relativně zřídka. 57
Vyšetřovaný materiál: krev (sérum) - pro sérologické vyšetření moč - pro mikrobiologické vyšetření ledviny - leptospiry přežívají v této tkáni po několik dnů od úhynu zvířete Zpracování moči nelze-li moč vyšetřit během 20 min. po odběru, musí se neutralizovat 0,1 N HCl nebo 0,1 N NaOH chceme-li udržet morfologii leptospir po několik dnů, přidáme na 20 ml moči 1,5 ml 10% formalínu (leptospiry jsou usmrceny) mikroskopujeme na temném poli, případně ve fázovém kontrastu moč pro kultivační vyšetření se ředí 1:10 s 1% roztokem bovinního sérového albumínu a přepravuje se do laboratoře, případně se může několik kapek moči asepticky přidat do kultivačního média Zpracování ledvin z vnitřní tkáně ledviny Pasteurovou pipetou získáme trochu tkáně, kterou macerujeme v kapce destilované vody a mikroskopujeme na temném poli část tkáně ledviny asepticky kultivujeme do vhodného média část ledviny konzervujeme 10% formalínem pro histologické vyšetření ledvinnou tkáň abortovaných plodů lze vyšetřovat imunofluorescenčními technikami (ledviny selat jsou vhodnější než ledviny telat, které často autolyzují) Přímé mikroskopické vyšetření. Leptospiry se nedají rozlišit ve světelném mikroskopu v procházejícím světle. Velmi špatně se barví anilínovými barvivy. Můžeme je však mikroskopovat technikou temného pole a imunofluorescenčními technikami. Pasáž materiálu přes laboratorní zvířata. K infekci jsou vysoce vnímavá morčata a zlatí křečci. Po i.p. podání 0,5-1,0 ml infekčního materiálu za 15-60 min. získáme kardiální punkcí krev pro kultivaci, dále při zvýšení tělesné teploty a v odstupu několik dnů. Kultivační vyšetření. Leptospiry izolujeme z nekontaminovaného materiálu v Korthofově půdě, Fletcherově polotuhém médiu aj.. Kontaminovaný materiál se může filtrovat přes bakteriologické filtry (0,45 µm) a pak očkovat do půd s přídavkem 200 µg. ml -1 5- fluorouracylu, případně vankomycinu a polymyxinu B. Kultury se pěstují při 30 o C po dobu až několik týdnů. Jednou týdně se mikroskopicky kontroluje růst. Poznámky: 58