Verze: 1.2 Datum poslední revize: 24.9.2014 Nastavení real-time PCR cykleru Light Cycler 480 Instrument (Roche) generi biotech
OBSAH 1. Nastavení teplotního profilu...3 1.1. Nastavení nového teplotního profilu...3 2. Alelická diskriminace...3 2.1. Nastavení pro alelickou diskriminaci...3 3. Kvantifikace genové exprese...5 3.1. Nastavení pro genovou expresi...5 4. Detekční formáty...7 generi biotech 2/10
1. Nastavení teplotního profilu 1.1. Nastavení nového teplotního profilu 1.1.1. Při volbě Program an experiment vyberte možnost Experiment Creation a dále New Experiment 1.1.2. Zvolte typ destičky (průhledná nebo bílá) 1.1.3. V tabulce Run Protocol v části Setup vyberte z rozbalovací nabídky Detection Format 2. Alelická diskriminace 2.1. Nastavení pro alelickou diskriminaci Pro alelickou diskriminaci vyberte jeden následujících detekčních formátů (viz Kap. 4): V módu Quantification zvolte možnost 3 Colors Hydrolysis Probes a při spouštění runu pak vyberte fluorescenční kanály FAM (465-510) a VIC/HEX (533-580) V módu Endpoint Genotyping (SNP Analysis) zvolte možnost Dual Color Hydrolysis Probes s kanály FAM (465-510) a VIC (533-580) Nezadávat volbu Color Compensation (ta je pro HRM a melting), zde se zadává Continuous Acquision mode (fluorescenci snímá kontinuálně) Acquision Mode (snímání fluorescence) Single (data snímá pouze 1x během každého cyklu, na konci zvoleného kroku 2.1.1. Nastavte kroky teplotního profilu uvedeného v manuálu ke kitu a zvolte objem reakce 20 µl generi biotech 3/10
Ukázka správného nastavení: FAM: (465-510), VIC/Hex (533-580): Oblasti excitace: Oblasti emise: generi biotech 4/10
3. Kvantifikace genové exprese Verze: 1.2 Datum poslední revize: 24.9.2014 3.1. Nastavení pro genovou expresi Pro kvantifikaci vyberte následující detekční formát (viz Kap.4): V módu Quantification zvolte možnost Monocolor Hydrolysis Probe a při spouštění runu pak vyberte fluorescenční kanál FAM (465-510) Nezadávat volbu Color Compensation (ta je pro HRM a melting), zde se zadává Continuous Acquision mode (fluorescenci snímá kontinuálně) Acquision Mode (snímání fluorescence) Single (data snímá pouze 1x během každého cyklu, na konci zvoleného kroku 3.1.1. Nastavte kroky teplotního profilu uvedeného v manuálu ke kitu a zvolte objem reakce 20 µl 3.1.2. Pro vyhodnocení zvolte možnost Absolute Quantifiction Data lze vyhodnotit dvěma způsoby: a) Second Derivative Maximum Method určí hodnotu Ct jako bod, kde se křivka pro daný vzorek prudce zvedá Převzato z manuálu výrobce cykleru: LightCycler480 II_Manual_V1.5 generi biotech
b) Fit Points Method v oblasti exponenciální log fáze amplifikační křivky jsou zvoleny body, které protne přímka. Hodnota Ct je dána místem, kde tato přímka protne linii thresholdu. Převzato z manuálu výrobce cykleru: LightCycler480 II_Manual_V1.5 generi biotech 6/10
4. Detekční formáty Verze: 1.2 Datum poslední revize: 24.9.2014 Detekční formáty vhodné pro alelickou diskriminaci Detekční formáty vhodné pro genovou expresi Applications Product Characterization Quantification Assay Detection Format Dyes Excitation (nm) Detection (nm) SYBR Green l SYBR Green I 465 510 Monocolor Hydrolysis Probe / UPL Probe Dual Color* Hydrolysis Probes / UPL Probes 3 Colors Hydrolysis Probes 4 Colors Hydrolysis Probes FAM 465 510 FAM VIC/Hex/Yellow 555 FAM VIC/Hex Cy 5/Cy 5.5 LightCycler Cyan 500 FAM LightCycler Red 610 Cy 5/Cy 5.5 465 533 465 533 618 440 498 533 618 510 580 510 580 660 488 580 610 660 Melting Curve Genotyping (SNP Analysis) Endpoint Genotyping (SNP Analysis) Monocolor HybProbe Probes Monocolor HybProbe Probes Multicolor HybProbe Probes Dual Color* Hydrolysis Probes Fluorescein (Donor) LightCycler Red 640 Fluorescein (Donor) LightCycler Red 640 Fluorescein (Donor) LightCycler Red 610 LightCycler Red 640 Cy 5/Cy 5.5 FAM VIC 498 640 498 640 465 498 498 498 465 533 510 610 640 660 510 580 Melting Curve Genotyping (SNP Analysis) Gene Scanning, Mutation Discovery, and Methylation Analysis SimpleProbe Probes Fluorescein 465 510 High Resolution Melting HRM Dye 465 510 *Universal color compensation objects for dual color FAM/VIC and UPL assays generi biotech
Seznam detekčních formátů cykelru LightCycler 480 Real-Time PCR System: Dostupné na: http://lifescience.roche.com generi biotech 8/10