PROTEINOVÁ DENATURUJÍCÍ ELEKTROFORÉZA (SDS PAGE) Denaturující proteinová elektroforéza (SDS PAGE - SDS Protein Acrylamide Gel Electrophoresis) je metoda, která se používá k separaci proteinů podle velikosti, na základě jejich migrace v gelu v elektrickém poli. SDS (sodium dodecylsulfát) je detergent, který se při PAGE přidává k vzorku proteinu, protein denaturuje a uděluje mu negativní náboj. U většiny proteinů dochází k rovnoměrnému přidělení negativního náboje na jednotku hmoty (standardně 1,4 g SDS / 1 g polypeptidu). U hodně hydrofóbních proteinů (např. membránové proteiny) není navázání SDS rovnoměrné a tyto proteiny migrují v gelu neproporcionálně své velikosti. Gel pro proteinovou elektroforézu lze vyrobit v různých koncentracích a o různých velikostech pórů. Velikost pórů určuje poměr složek akrylamidu a bisakrylamindu v gelu. Se vzrůstající koncentrací akrylamidu se póry v gelu zmenšují. V našem případě používáme poměr mezi akrylamidem a bisakrylamidem 1:30. Použité roztoky: 10% amonium persulfát 10% SDS 30% akryl bisakrylamid mix (29:1) TEMED 1,5 M Tris (ph 8,8) 1,5 M Tris (ph 6,8) Running buffer Vzorkový pufr Coomasie Brilliant Blue (CBB) CBB odbarvovací roztok Funkce některých důležitých chemikálií a pufrů: SDS: je silný detergent, který se používá k denaturaci a obalení proteinů negativním nábojem, k čemuž dochází při zahřátí na 100 C. Stíní tím vnitřní náboj polypeptidů, který je tím pádem zanedbatelný. Komplex má pak jednotkový náboj na hmotnostní jednotku. Proteiny migrují k anodě. Running buffer: stabilizuje ph během elektroforézy, protože během elektroforézy dochází k elektrolýze vody. V našem případě používáme Tris pufr. Glycin: slouží jako protiiont, který vyrovnává vnitřní náboj running bufferu, je lehce záporně nabitý a napomáhá zanoření proteinů do horního gelu. Po zanoření do gelu svůj náboj ztrácí a dál pohyb proteinů neovlivňuje.
Bisakrylamid: 1 molekula bisakrylamidu na sebe váže 2 molekuly akrylamidu a crosslinkuje je, čímž dochází k tvorbě gelu. Poměr bisakryamidu a akrylamidu určuje porozitu gelu. Ammonium persulfát: je zdrojem volných radikálů nutných pro polymeraci gelu. Vyšší množství volných radikálů má za následek snížení průměrné délky polymerního řetězce a snížení elasticity gelu. Měla by se používat nejnižší možná koncentrace volných radikálů, která ještě vede k polymerizaci. Katalyzátor polymerace gelu. TEMED: stabilizuje volné radikály, čímž zlepšuje polymeraci gelu. Míra polymerace a vlastnosti gelu závisí na koncentraci volných radikálů. Bromfenolová modř: používá se ke zviditelnění vzorku jak při nanášení na gel, tak pro orientaci migrace vzorků gelem. Je negativně nabitá a migruje spolu s proteiny k anodě, má malou molekulovou hmotnost, takže migruje rychleji než nejmenší proteiny (je vepředu jako první). Za neutrálního a alkalického ph je modře zbarvena. Glycerol: používá se k zatížení vzorků, aby klesly na dno jamky. Je nereaktivní, nenabitý a neinterferuje s průběhem elektroforézy. CBB: používá se k barvení proteinů. Kyselina octová v barvícím roztoku má za úkol stabilizovat proteiny v gelu. β-merkaptoetanol: používá se k denaturaci, redukuje disulfidické můstky v proteinech narušuje terciární a kvartérní struktury proteinů. Příprava pufrů Tris 1,5 M, ph 8,8 navážit 18,17 g Tris rozpustit v 80 ml dh2o upravit ph na hodnotu 8,8 doplnit do 100 ml dh2o Tris 1,5 M, ph 6,8 navážit 18,17 g Tris rozpustit v 80 ml dh2o upravit ph na hodnotu 6,8 doplnit do 100 ml dh2o
10% SDS rozpustit 10 g sodium dodecylsulfátu v 90 ml dh2o a zahřát max na 68 C, aby se SDS plně rozpustilo upravit ph na 7,2 pomocí HCl doplnit objem do 100 ml pokud SDS precipituje (za nízké teploty), rozpustit krystalky zahřátím na 37 C 10% amonium persulfát (APS) rozpustit 1 g APS v 8 ml dh2o doplnit objem do 10 ml rozplnit po 0,5 ml do eppendorfových zkumavek a zamrazit na -20 C po použití vyhodit, znovu nezamrazovat Vzorkový pufr 2X I 10 ml 1,5M Tris (ph 6,8) 6 ml 20% SDS 30 ml glycerolu 15 ml β-merkaptoetanolu 1,8 g bromfenolové modře doplnit objem do 100 ml dh2o rozplnit do zkumavek a zamrazit na -20 C 10X Running buffer rozpustit v 800 ml dh2o: 10 g SDS 30,3 g Tris 144,1 g glycinu doplnit objem do 1 l dh2o před použitím 10x naředit CBB R-250 450 ml metanolu 100 ml kyseliny octové 400 ml dh2o rozpustit 2,5 g CBB R-250 ve směsi připravené v předchozím kroku doplnit objem do 1 l dh2o
Odbarvovací roztok 450 ml metanolu 100 ml kyseliny octové doplnit do 1 l dh2o Příprava gelu Dolní gel (separační) 12%; 1 gel 1,6 ml dh2o 2 ml 30% akryl bisakrylamidu 1,3 ml Tris, ph 8,8 50 µl 10% SDS 50 µl APS 2 µl TEMEDu Horní gel (zaostřující) 5%; 1 gel 1,4 ml dh2o 330 µl 30% akryl bisakrylamidu 250 µl Tris, ph 8,8 20 µl 10% SDS 20 µl APS 2 µl TEMEDu Dolní i horní gel se míchá čerstvě. Jako poslední se k roztoku přidává APS a TEMED. Roztok se velmi pečlivě zamíchá a pipetou se nalije mezi sestavená skla, cca do 2/3 objemu. Nalitý roztok se převrství butanolem a gel se nechá ztuhnout. Po ztuhnutí se butanol vylije, namíchá se čerstvý horní gel (TEMED a APS jako poslední), pečlivě se promíchá a pipetou se nanese na dolní gel. Mezi skla se vloží hřebínek, který nám v gelu vytvoří jamky pro nanesení vzorku. Horní gel se nechá zatuhnout, hřebínek se vyndá a jamky se mohou propláchnout destilovanou vodou. Takto připravený gel mezi skly se použije k sestavení elektroforézy. Příprava vzorků Příprava buněčných lyzátů buněčnou suspenzi zamrazte na -80 C/min 12h rozmrazte při teplotě 37 C (vodní lázeň, do úplného rozmražení) buněčný lyzát centrifugujte 900xg/30min/20 C ihned po ukončení centrifugace opatrně odeberte supernatant (roztok, obsahuje proteiny)
odebraný supernatant skladujte v lednici nebo -20 C do analýzy proveďte analýzu proteinů pomocí SDS-PAGE (kvalitativní - molekulová hmotnost proteinů) a stanovte koncentraci proteinů ve vzorku metodou dle Bradfordové (kvantitativní stanovení celkového množství proteinů). Příprava vzorků pro SDS PAGE Vzorek proteinů (např. buněčný lyzát) smíchám v poměru 1:1 se vzorkovacím pufrem (2X I) a 5 10 minut povařím při 100 C. Vzorek stočím na centrifuze na maximum (cca 5000 otáček) po dobu 1 minuty. Takto připravený vzorek můžu nanést do jamky v gelu. V závislosti na tom, jaký marker molekulových hmotností používám, je možné, že bude potřeba stejným způsobem připravit a zavařit i marker (pozor! ready to use se již nevaří!). Elektroforéza Pomocí dvou skel s gelem sestavím vnitřní vaničku na horní pufr. Místo jednoho skla mohu případně použít plastovou vložku. Vaničku vložím do vany a do obou naliji running buffer. Do horní až úplně po vrch, do dolní tak, aby spodní elektroda byla ponořena v pufru. Postupně nanesu do první jamky marker molekulových hmotností (podle druhu markeru nanáším 3 5 µl) a do každé další jamky vzorek (po dohodě se školitelem). Vanu zakryji víkem, připojím elektrody ke zdroji (pozor na (+) a (-), musí vše lícovat!!!) a ten spustím. Napětí nastavím na 90 V a nechám cca 15 minut běžet (minimálně po dobu, než mi vzorky zajedou do gelu a vytvoří jednu linii). Poté mohu napětí zvednout na 120 V. Elektroforéza běží cca 1 1,5 hodiny, podle použitého napětí. Barvení Po dokončení elektroforézy opatrně od sebe oddělím skla, mezi kterými mám gel. Od gelu odříznu horní zaostřovací gel a odříznu i kousek horního rohu u markeru. Tím si označím orientaci gelu. Gel vložím do misky s CBB a nechám míchat na míchačce přes noc. Druhý den sliji CBB (lze použít opakovaně), gel propláchnu v destilované vodě a dám odbarvovat do odbarvovacího roztoku do té doby, než se gel úplně neodbarví a nezůstanou obarvené pouze proteiny. Odbarvovací roztok lze měnit dle potřeby. Po obarvení gelu lze gel krátkodobě skladovat v destilované vodě a naskenovat, případně vložit do sušícího roztoku na noc a pak vložit mezi celofán, vypnout do rámečku a nechat uschnout. Takto lze gel dlouhodobě skladovat.