Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie

Masarykova univerzita v Brně Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Oddělení mikrobiologie Aflatoxiny, jejich výskyt, význam a stanovení (Bakalářská práce studijního programu Biologie, oboru Obecná biologie směr Mikrobiologie) Jana Konečná Brno, 2008

Ráda bych poděkovala svému vedoucímu bakalářské práce Ing. Martinu Krskovi, CSc. především za trpělivost při výběru tématu a cenné rady při zpracovávání této práce. 2

Obsah 1. Cíl práce.....5 2. Úvod o aflatoxinech....6 2.1 Definice aflatoxinů.. 6 2.2 Historie objevení aflatoxinů.... 6 2.3 Druhy aflatoxinů, třídění a chemická charakteristika.....7 2.3.1 Aflatoxin B 1.....7 2.3.2 Aflatoxin B 2..... 8 2.3.3 Aflatoxin G 1.....8 2.3.4 Aflatoxin G 2.....9 2.3.5 Aflatoxin M 1.....10 2.4 Druhy rodu Aspergillus produkující aflatoxiny......10 3. Výskyt aflatoxinů....13 3.1 Faktory ovlivňující produkci aflatoxinů.. 13 3.1.1 Biologické faktory..... 13 3.1.2 Chemické faktory.......13 3.1.3 Fyzikální faktory........14 3.2 Druhy potravin a typy krmiv jež mohou aflatoxiny obsahovat.......14 3.3 Prevence vzniku aflatoxinů v krmivech a potravinách.......17 4. Klinický význam......18 4.1 Humánní klinický význam......19 4.2 Veterinární klinický význam.......22 5. Metody stanovení a identifikace aflatoxinů..... 25 5.1 Stanovení obsahu aflatoxinů v potravinách a krmivech.. 25 5.1.1 Fyzikálně chemické metody.......26 5.1.2 Biologické metody........27 5.2 Stanovení toxigenity........31 5.3 Povolené limity aflatoxinů v ČR........31 3

6. Dekontaminace a detoxikace aflatoxinů... 35 7. Diskuze..38 8. Závěr.....39 9. Seznam použité literatury.. 40 4

1. Cíl práce Problematice mykotoxinů se větší pozornost začala věnovat zejména v 60. letech 20. století. Poté proběhly studie různých druhů těchto toxinů. Jak jsem však zjistila, existuje v naší literatuře jen několik souhrnných prací, které by se zabývaly jak všeobecnou charakteristikou, tak i možným výskytem, klinickým významem a metodami stanovení těchto toxinů v různých druzích potravin a krmiv. Proto jsem si jako cíl své práce stanovila především podat formou literární rešerše s využitím dostupných zdrojů přehlednou charakterizaci jednoho z nejznámějších druhů mykotoxinů, aflatoxinů. V kapitolách významu zahrnu oblast humánní i veterinární, jelikož spolu velmi úzce souvisí. Ve své práci se budu snažit také uvést, pokud možno, nejnovější dostupná data týkající se množství aflatoxinů v potravinách a krmivech, jež jsou povolená legislativou České republiky. Jako jeden z posledních cílů bych také ráda nastínila určité možnosti předcházení vzniku těchto toxinů, případně způsoby, jak alespoň částečně řešit problém spojený s jejich dekontaminací. 5

2. Úvod o aflatoxinech 2.1 Definice aflatoxinů Aflatoxiny jsou nejčastější skupinou mykotoxinů, přírodních toxických látek produkovaných za určitých podmínek skupinou vláknitých hub neboli mikromycet. V současnosti známe více než 150 druhů těchto hub schopných produkovat 1 či více mykotoxinů, přičemž aflatoxiny produkuje několik významných druhů hub rodu Aspergillus (Šimůnek, 2004). Produkce aflatoxinů začíná po vytvoření konidií, maxima dosahuje v lag fázi a zhruba po 6 dnech se většinou snižuje (Malíř a kol., 2003). Aflatoxiny jsou přirozeně se vyskytující kontaminanty potravin. (Šimůnek, 2004) Jsou charakteristické svou termostabilitou, nerozloží je vaření či sterilizace (Malíř a Ostrý, 2004). Ani při skladování kontaminovaných potravin (konkrétně např. arašídů) při 23 C po dobu 2 let se obsah aflatoxinů v potravině nezměnil. Napadené potraviny je proto nutné zlikvidovat. 2.2 Historie objevení aflatoxinů Aflatoxiny patří mezi jedny z prvních objevených mykotoxinů, jejichž průkaz poukázal znovu na nebezpečí těchto látek pro člověka i pro hospodářská zvířata, a to zejména vzhledem k možné kontaminaci potravin a/nebo krmiv těmito látkami. Aflatoxiny byly objeveny poprvé v 60. letech 20. století, kdy v roce 1960 došlo na farmách v Anglii ke hromadnému úhynu více než 100 000 krůt a jejich mláďat, krmených mimo jiné i krmnou moučkou z podzemnice olejné dovážené z Brazílie (Šimůnek, 2004). Tato epidemie byla označena jako krůtí X onemocnění. Bylo pro ni charakteristické poškození jaterního parenchymu a proliferace epitelu žlučovodu (Malíř a kol., 2003). Nebylo možné identifikovat jako původce bakteriální ani virové agens, jednalo se tedy o intoxikaci. Později byl jako původce odhalen toxický metabolit, který dostal název aflatoxin dle svého hlavního producenta, vláknité houby druhu Aspergillus flavus ( Aspergillus flavus toxins ). Několik let poté byla zaznamenána epidemie hepatomu pstruhů v USA související, jak bylo později prokázáno, také s kontaminací krmiva aflatoxiny. V roce 1974 byla zaznamenána první epidemie aflatoxikózy u lidí ve více než 150 vesnicích v severozápadní Indii (Bennett a Klich, 2003). Tento případ se týkal několika set lidí vykazujících příznaky otravy a poškození jater doprovázené žloutenkou, což jsou jedny z hlavních příznaků související s aflatoxiny. V tomto případě došlo k úmrtí více než 100 tamních obyvatel. Po provedení testů na přítomnost aflatoxinů byl potvrzen nález aflatoxinu B 1 v kukuřici, kterou tito lidé zkonzumovali. 6

2.3 Druhy aflatoxinů, třídění a chemická charakterisitka Aflatoxiny jsou chemicky definovány jako komplexní organické látky (polycyklické, nesaturované, vysoce substituované kumariny) nebílkovinné povahy, vyznačující se nízkou molekulovou hmotností (do 700 g/mol) (Malíř a kol., 2003). Jsou produkovány jako sekundární metabolity některých druhů vláknitých hub rodu Aspergillus a vznikají biosyntézou, při níž jako primární konečné produkty vystupují mastné kyseliny a meziproduktem je malonyl-koenzym-a (Betina, 1994). Dělí se na základě jejich barvy pod krátkovlnným UV zářením (o vlnové délce 365 nm) a jsou označeny indexy dle pořadí, ve kterém vystupují na chromatografu při tenkovrstvé chromatografii (Sweeney a Dobson, 1998). Za základní tedy považujeme aflatoxiny B 1, B 2, které vykazují modré světélkování (označení z anglického blue = modrá) a G 1, G 2, které světélkují zeleně (označení z anglického green = zelená). Mezi aflatoxiny dalších řad můžeme uvést například toxiny řady M, jež byly nejprve zjištěny pouze jako metabolizovaná forma (po požití aflatoxinu B v potravě byly zjištěny v mléce hospodářských zvířat tomuto toxinu vystaveným), ale později byli nalezeni také přirození producenti těchto mykotoxinů (Malíř a kol., 2003). Dále zmiňme například aflatoxiny H (původně izolované z jater = hepar), P, Q atd. V dnešní době známe asi 20 druhů dosud identifikovaných aflatoxinů. Z hlediska třídění mykotoxinů podle různých charakteristik můžeme aflatoxiny zařadit do následujících skupin: a) dle chemické struktury: furanofurany b) dle biosyntézy: biosyntéza z polyketidů c) kvantitativně dle toxigenity: silně toxické d) kvalitativně dle toxigenity: hepatotoxiny, hematotoxiny, imunotoxiny,... e) dle účinku na buňku: karcinogenní 2.3.1 Aflatoxin B 1 (Ostrý a kol., 1997) Sumární vzorec: C 17 H 12 O 6 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_b1.htm): 7

Název podle Chemical abstracts: Cyclopenta [c] furo [3 2 :4,5] furo [2,3-h] [1]benzopyran-1,1 1-dione, 2,3,6a, 9a-tetrahydro-4-methoxy-, (6aR-cis)- Jiný název: 6-methoxydifurocoumarone Molekulová hmotnost: 312 Fyzikální vlastnosti: Popis: světle žluté krystaly, emituje v UV světle modrou fluorescenci Bod tání: 268 269 C Rozpustnost: nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech, málo rozpustný ve vodě (10-20 µg/ml), dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech Producenti: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.3.2 Aflatoxin B 2 Sumární vzorec: C 17 H 14 O 6 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_b2.htm): Název podle Chemical abstracts: Cyclopenta[c] furo [3 2 :4,5] furo [2,3,-h] [1] benzopyran-1,1 1-dione, 2,3,6a,8,9,9a-hexahydro-4-,ethoxy-,(6aR-cis)- Jiný název: Dihydro-aflatoxin B 1 Molekulová hmotnost: 314 Fyzikální vlastnosti: Popis: světle žluté krystaly, emituje v UV světle modrou fluorescenci Bod tání: 286 289 C Rozpustnost: nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech, málo rozpustný ve vodě (10 20 µg/ml), dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech Producenti: Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.3.3 Aflatoxin G 1 Sumární vzorec: C 17 H 12 O 7 8

Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_g1.htm): Název podle Chemical abstracts: 1 H, 12H-furo [3 2 :4,5] furo [2,3-h] pyrano [3,4-c] [1] benzopyran-1,12-dione,3,4,7a,10a-tetrahydro-5-methoxy-,(7ar-cis)- Jiný název: - Molekulová hmotnost: 328 Fyzikální vlastnosti: Popis: bílý až světle žlutý prášek, emituje v UV světle modrozelenou fluorescenci Bod tání: 244 246 C Rozpustnost: nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech, málo rozpustný ve vodě (10 20 µg/ml), velmi dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech Producenti: Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.3.4 Aflatoxin G 2 Sumární vzorec: C 17 H 14 O 7 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_g2.htm): Název podle Chemical abstracts: 1 H, 12H-furo [/3 2 :4,5] furo [2,3-h] pyrano [3,4-c] [1] benzopyran-1,12-dione,3,4,7a,9,10,10a-hexahydro-5-methoxy-,(7ar-cis)- Jiný název: Dihydro-aflatoxin G 1 Molekulová hmotnost: 330 Fyzikální vlastnosti: Popis: světle žluté krystaly, emituje v UV světle zelenou fluorescenci Bod tání: 237 239 C 9

Rozpustnost: nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech, málo rozpustný ve vodě (10 20 µg/ml), velmi dobře rozpustný v polárních organických rozpouštědlech Producenti: Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.3.5 Aflatoxin M 1 Sumární vzorec: C 17 H 12 O 7 Strukturní vzorec (převzato z www.fermentek.co.il/aflatoxin_m1.htm): Název podle Chemical abstracts: Cyclopenta[c]furo[3 2 :4,5]furo[2,3-h] [1]benzopyran-1,1 1-dione, 2,3,6a,9a-tetrahydro-9a-hydroxy-4-methoxy Jiný název: 4-hydroxyaflatoxin B 1 Molekulová hmotnost: 328 Fyzikální vlastnosti: Popis: emituje v UV světle modro - fialovou fluorescenci Bod tání: 299 C Rozpustnost: nerozpustný v hexanu, málo rozpustný v benzenu, rozpustný v metanolu, ethanolu, acetonitrilu, chloroformu, směsi methanol:ether (1:1) Producenti: Aspergillus parasiticus, Aspergillus nominus 2.4 Druhy rodu Aspergillus produkující aflatoxiny Taxonomické zařazení rodu Aspergillus je následující (Ostrý a Škarková, 2003): říše: Fungi oddělení:ascomycota řád: Eurotiales čeleď: Trichocomaceae rod: Aspergillus Druhy produkující aflatoxiny patřící do podrodu Circumdati, sekce Flavi (Malíř a kol., 2003): akceptované druhy: 10

Aspergillus flavus 2 morfotypy: tzv. L-kmen: sklerocium v průměru > 400 µm, nižší produkce aflatoxinů nebo atoxigenní a tzv. S-kmen: sklerocium < 400 µm, vyšší produkce aflatoxinů (Probst a kol., 2007 ). Pouze asi polovina kmenů tohoto druhu hub produkuje aflatoxiny, avšak pokud již k produkci dochází může dosahovat množství až 10 6 µg/kg (Bennett a Klich, 2003). Obrázek č. 1: Aspergillus flavus, konidiofor s řetízky konidií, SEM (převzato z http://botany.natur.cuni.cz/pdf/kubatova/3.04%20eurotiales-asp%20sekce%20flavi.pdf): Aspergillus nominus (Malíř a kol., 2003) Obrázek č. 2: Aspergillus nominus, konidiofory s konidiemi (převzato z http://botany.natur.cuni.cz/pdf/kubatova/3.04%20eurotiales-asp%20sekce%20flavi.pdf): Aspergillus parasiticus 11

Obrázek č. 3: Aspergillus parasiticus, fialidy a řetízky konidií, skanovací elektronový mikroskop(sem), (převzato z http://www.aflatoxin.info/aflatoxin.asp): nově popsané druhy: Aspergillus argentinicus Aspergillus bombycis Aspergillus pseudotamarii Aspergillus zhaoqingensis nutné potvrzení molekulárně biologickými metodami: Aspergillus tamarii Obrázek č.4: Aspergillus tamarii, konidiofor, konidie, skanovací elektronový mikroskop (SEM), (převzato z http://botany.natur.cuni.cz/pdf/kubatova/3.04%20eurotiales- Asp%20sekce%20Flavi.pdf): 12

3. Výskyt aflatoxinů 3.1 Faktory ovlivňující produkci aflatoxinů Tvorba mykotoxinů je především závislá na druhu vláknité houby, ale ovlivňuje ji také řada dalších faktorů vedoucích k souhře enzymatických aktivit buňky a z toho vyplývající možnosti produkce toxinů. Mezi podmínky vedoucí k této souhře můžeme zařadit biologické, chemické a fyzikální faktory prostředí (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004). Tyto faktory mohou produkci mykotoxinů ovlivňovat už během pěstování (na poli), před i v průběhu sklizně úrody a také během její přepravy a uskladňování. 3.1.1 Biologické faktory a) Přítomnost více druhů toxigenních vláknitých hub v substrátu: antagonistické nebo synergické vztahy mezi nimi: synergismus mezi aflatoxinem B 1 a diacetoxyscirpenolem, deoxynivalenolem, ochratoxinem A nebo T-2 toxinem b) Směsná kultura: obvykle vede k poklesu produkce mykotoxinů c) Přítomnost spor jiného kmene, případně druhu v médiu: pokles produkce aflatoxinů houbami druhu Aspergillus flavus při příměsi spor hub netoxigenního druhu Aspergillus niger; ochrana před kontaminací mikromycetami druhu Aspergillus flavus pokud je na kukuřici přítomná houba druhu Fusarium moniliforme (Malíř a kol., 2003) d) Hmyz narušující povrch rostlinných orgánů následně kontaminovaných sporami: narušení vnějšího povrchu zrn např. u kukuřice během vývojové fáze plodiny nejčastěji jedinci druhu Sitophilus zeamais, Ostrinia nubilalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea se stává ideální vstupní branou infekce mikromycetami (Gorman a Kang, 1991). 3.1.2 Chemické faktory a) Přísun energie (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004) b) Přísun nezbytných chemických látek: jako vstupy do metabolismu c) Přísun kyslíku, tzn. aerobní podmínky: koncentrace O 2 v prostředí pod 1% vede k útlumu produkce aflatoxinů d) Vliv cukrů: produkce aflatoxinů houbami druhu Aspergillus flavus probíhá do 50% sacharózy v prostředí (Ostrý, 1998) e) Vliv solí: produkce aflatoxinů na substrátu obsahujícím do 14% NaCl (Malíř a kol., 2003) f) Vliv dalších chemických látek aktivujících enzymatické systémy mikromycet: polychlorované bifenyly, rozpouštědla, některé mikroelementy přídavek zinku, kadmia, 13

železa a molybdenu vedou ke zvýšené tvorbě aflatoxinů, naopak např. kofein může tvorbu částečně inhibovat (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004) g) ph: nejčastěji probíhá produkce aflatoxinů při ph mezi 3,5 a 8, s optimem okolo ph 6 (Sweeney a Dobson, 1998) 3.1.3 Fyzikální faktory (Šimůnek, 2004; Suchý a Herzig, 2004) a) Teplota substrátu a vnějšího prostředí: nejvhodnější je obvykle rozmezí 16 až 30 C s optimem okolo 25 C, u hub druhu Aspergillus flavus tvorba aflatoxinů při teplotě pod 16 C nebyla prokázána b) Vlhkost substrátu vhodná k produkci aflatoxinů: min. 16% c) Relativní vlhkost vzduchu: min.65% d) Osmotické vlastnosti substrátu, především vodní aktivita - a w (voda využitelná mikroorganismy): růst většinou ustává při a w pod 0,65, ale tento pokles pod optimální hodnotu neznamená usmrcení kultury, přežívají spory a při návratu k optimálním podmínkám, tj. hodnotě a w minimálně 0,75, mohou znovu vyklíčit a růst kultury pokračuje e) Struktura substrátu: ovlivňuje prorůstání do média a tím dostupnost chemických látek a kyslíku f) Čas: např. mikromycety druhu Aspergillus flavus produkují aflatoxiny obvykle až po vysporulování kultury g) Ionizující záření: 2,5 kgy padesátkrát zvýší syntézu aflatoxinů B 1 a G 1, dávka 1 kgy vyvolá tvorbu aflatoxinů také v konidiích kmenů hub druhu Aspergillus flavus, které nejsou přirozeně toxigenní (Malíř a kol., 2003) h) Stresové faktory působící na rostlinu během sklizně (Gorman a Kang, 1991) vodní stres: extrémní sucha roku 1977 v jihovýchodní USA měla za následek neobvykle vysoký výskyt aflatoxinů zejména u kukuřice dusíkový stres: rostliny bez přísunu dusíku vykazovaly v průměru o 28% vyšší hodnoty výskytu aflatoxinů než rostliny s optimálním přísunem dusíku 3.2 Druhy potravin a typy krmiv jež mohou aflatoxiny obsahovat Vzhledem k přirozenému výskytu vláknitých hub v prostředí lze předpokládat také možnost kontaminace mnoha druhů potravin a krmiv. K takzvané primární kontaminaci může docházet již před sklizní a skladováním. Průnik mikromycet do pletiv jejich rostlinných hostitelů probíhá přes kořen, stonek a listy rostlin nebo mohou průniku napomáhat různé druhy vektorů, jako jsou například nematoda. Zejména při velkovýrobě potravin a krmiv 14

tvoříme vhodnou ekologickou niku pro dobré množení a adaptaci těchto hub. K další kontaminaci vláknitými houbami rodu Aspergillus dochází zejména u potravin rostlinného původu, v největší míře hlavně během skladování těchto potravin. V našich klimatických podmínkách jsou vláknité houby jako kontaminanty potravin a krmiv méně rozšířené, ale jsou k nám importovány především s obilninami a dalšími produkty ze zemí tropického a subtropického pásma, kde jsou podmínky pro jejich výskyt mnohem příznivější. Kvůli častému překračování povolených limitů obsahu aflatoxinů v potravinách dovážených z takzvaných třetích zemí byly Rozhodnutím Komise ze dne 12. července 2006, kterým se stanoví zvláštní podmínky pro dovoz některých potravin z vybraných třetích zemí vzhledem k riziku jejich kontaminace aflatoxiny, určeny zvláštní podmínky, týkající se především vyšší frekvence odběru vzorků z těchto potravin, častější a důkladnější kontroly obsahu aflatoxinů v návaznosti na časné odhalení a zadržení nevyhovujících zásilek u následujících produktů: podzemnice olejné a výrobků z ní z Číny; fíků, lískových ořechů, pistácií a výrobků z nich z Turecka; para ořechů z Brazílie; pistácií a výrobků z nich z Íránu; další řady podezřelých produktů a výrobků z těchto produktů z Brazílie, Číny, Egypta, Íránu, Turecka. V České republice byla kvůli opakovanému výskytu kontaminovaných potravin a většinou nekompletním datům, která se týkají stupně kontaminace potravin, počínaje rokem 1999 zahájena rozsáhlá studie MYKOMON, která v rámci projektu Monitoringu zdravotního stavu obyvatelstva ČR ve vztahu k životnímu prostředí měla chybějící informace doplnit (Ostrý a Škarková, 2003). Malíř a kol. (2003) uvádějí, že mikromycety druhu Aspergillus flavus se vyskytují v zahraničí především v těchto potravinách: kukuřice a produkty z kukuřice, čirok, rýže, oves, obiloviny a potraviny vyrobené z obilovin (pšenice, pšeničná zrna, mouka, chléb, těstoviny, otruby, ječmen, millet,...), proso, sójové boby, sója mungo, hrách, čerstvé ovoce (citrusy, liči, granátová jablka, ananas), sušené ovoce, ořechy (arašídy, kemiri, kola, pekanové ořechy, pistácie, lískové ořechy, vlašské ořechy, betelové ořechy, kokosové ořechy atd.), koření (pepř, koriandr, paprika, muškátový oříšek, zázvor atd.), zpracovaná masa, slanina, šunky, šunky ze Španělska, africké rybí výrobky, sušené, solené, uzené ryby z jihovýchodní Asie, mléko, sušené mléko, sýr. U mikromycet druhu Aspergillus parasiticus je nejčastější výskyt v amarantu, prosu, milletu, sójových bobech, arašídech, lískových ořeších, vlašských ořeších, pekanových ořeších, pistáciích, zpracovaných masech. 15

Mikromycety druhu Aspergillus tamarii může obsahovat: pšenice, ječmen, kukuřice, čirok, rýže, sójové boby, zelené kávové boby, černé fazole, sója mungo, kopra, prách, arašídy, pistácie, pekanové ořechy, lískové ořechy, vlašské ořechy, ořechy kola, betelové ořechy, ořechy kemiri, kešu, kakao, palmové jádro, koření (pepř), masné výrobky, solené sušené ryby, uzené sušené ryby. Výskyt aflatoxinů byl zjištěn v následujících druzích potravin: aflatoxin B 1 : arašídová omáčka, pasta, směs; arašídy kandované; broskvová jádra; bataty; cereální snídaně; česnek nakládaný; česnekový prášek; čili koření, papričky; čirok; čokoláda; fíky; fíková pasta; hrášek; jádra melounu; kakaová drť, keksy; kari pasta, kari; kávová zrna; kokosová zmrzlina, ořechy, olej; kayenský pepř, pepř; kmín; kukuřice sušená, vařená, otruby, slupky, výrobky, slad, stonek, škrob; maniok (cassava); mandle; marcipán; maso; müsli; nudle; muškátový oříšek; olej; ořechy brazilské, pistáciové, pekanové, vlašské; paprika; pekařské výrobky; pistácie kandované; pivo; proso (millet); rozinky; ryby; sezamové semeno; sójová mouka; špagety; tykvová jádra; vaječné výrobky; víno; zázvor; zrno ječmene aflatoxin G 1 : stejný jako u B 1 + semena celeru aflatoxin G 2 :stejný jako u B 1 + citrony; indická kassia (skořice); mango; olivový olej; pomeranče; slunečnicová semínka; sezamová semínka; kurkuma; římský kmín aflatoxin M 1 : jogurt; kukuřice bílá a žlutá; máslo; mléko pasterizované a sterilizované, sušené; mléko velbloudí; zaplísněné pistáciové ořechy; syrovátka sušená; sýry (blue, Blue Haverti, Brie, Camembert, Cheddar, Cheshire, Chester, Cottage, Compte, Cream, Double Gloucester, Eidam, Emmental, Fresh, Gouda, Grana Padano, Lancashire, Leicester, Maribo, Mozarella, Parmesan, Romadur, Samsoe, Stilton, Wensleydale) Vzhledem ke svým významným toxickým účinkům nejen pro člověka, ale i hospodářská zvířata, je důležité sledovat též možnost výskytu v krmivech (Suchý a Herzig, 2004). U krmiv dochází v prvé řadě ke zhoršení nutriční hodnoty (pokles obsahu bílkovin, esenciálních aminokyselin atd.) Ztráty způsobené znehodnocením krmiv mykotoxiny v zemích Evropské unie jsou odhadovány až na 25% celkové produkce krmiv. 16

Dále mohou některé druhy aflatoxinů po metabolické přeměně přecházet do mléka zvířat a tím ohrozit opět i lidský organismus, a proto je sledování výskytu těchto toxinů v krmivech také významnou součástí mnoha studií. Jelikož nejcitlivější k aflatoxinům jsou především mláďata drůbeže, prasata a dobytek chovaný pro mléko, jsou také nejsledovanějšími komoditami právě krmiva pro tyto druhy zvířat. Za další riziková krmiva lze však pokládat veškeré obiloviny, luskoviny, olejniny a produkty z nich vyrobené (např. krmiva z kukuřice a podzemnice olejné, bavlníkový šrot,...), které i u méně citlivých zvířat způsobují především snížení přírůstků, pokles mléčné a masné užitkovosti, snůšky atd. Z takzvaných konzervovaných krmiv mohou být kontaminovány především sušená nebo fermentovaná píce, což jsou zelené rostliny včetně klasů a semen, které mohou být zvířaty konzumovány v surovém stavu, jako pastva, ošetřené = seno, nebo fermentované = siláž. K nejčastěji zasaženým krmivům patří především kukuřičná píce. Výskyt toxigenních plísní může být zaznamenán také v mnoha dalších doplňkových krmivech, krmných moučkách a různých komponentech krmiv. 3.3 Prevence vzniku aflatoxinů v krmivech a potravinách Z řady různých jmenovaných faktorů ať již fyzikálních, chemických či biologických, působících při produkci aflatoxinů je zřejmé, že preventivní opatření prováděná v tomto směru jsou velmi obtížná. Odstranit vláknité houby, respektive především jejich spory z prostředí je prakticky nemožné. Podle Suchého a Herziga (2004) by u preventivních opatření kontaminace potravin a krmiv měla být dodržována zejména tato opatření: a) při pěstování a sklizni střídání plodin v osevních postupech výběr vhodného hybridu, odrůdy ošetření osiv vhodnými fungicidy boj proti plevelům, škůdcům a chorobám (rezervoáry) šlechtění geneticky upravených odrůd odolných vůči houbovým chorobám zabránění mechanickému poškození zrna, udržování dobrého zdravotního stavu porostu s využitím atoxigenních kmenů konkurenční vyloučení toxigenních kmenů z prostředí kvalitní ošetření krmiva po sklizni b) při skladování a konzervaci uskladnění v suchu (relativní vlhkost vzduchu do 65%) 17

u cereálií do 48 hodin po sklizni snížení vlhkosti pod 14% odstranění zbytků starých krmiv, vyčištění zásobníků krmiv před plněním zajištění minimálního přístupu kyslíku případné ošetření vhodnými protiplísňovými přípravky, u siláží mohou být použita silážní prezervativa ke zlepšení fermentace Ve studii Gormana a Kanga (1991) je také kladen důraz na: ošetření vhodnými insekticidy (pomáhají redukovat množství rostlin napadených mikromycetami) vývin nových hybridů rezistentních k napadení určitými druhy hmyzu, které mohou na svém povrchu a/nebo ve svých útrobách přenášet též spory mikromycet vývin hybridů odolnějších ke stresovým faktorům, případně rezistentních k infekci mikromycetami V práci Malíře a Ostrého (2004) týkající se otázky skořápkových plodů je u této suroviny doporučeno k účinnému snížení aflatoxinů dodržovat zejména: minimalizace produkce aflatoxinů pomocí správné zemědělské praxe správné skladování a manipulace s těmito plody užití vhodných technologických postupů pro zpracování a dekontaminaci dodržování hygienických limitů a monitoring zavádění vzdělávacích programů pro zemědělce, výrobce potravin a krmiv, distributory, prodejce a spotřebitele 4. Klinický význam aflatoxinů Při stanovování klinického významu aflatoxinů vyjdeme z biochemických účinků těchto toxinů (Betina, 1990). Ty jsou určeny chemickou strukturou molekuly aflatoxinů. Všeobecně se mechanismy účinku mykotoxinů zkoumají na úrovni: 1) Interakce s biomolekulami na molekulární úrovni (vazby v DNA, ) 2) Interakce s purifikovanými enzymy v enzymových reakcích 3) Interakce s nebuněčnými systémy (účinky na syntézu RNA, proteosyntézu, ) 4) Interakce s buněčnými systémy (jádro, membrány, mitochondrie, ) 5) Interakce na úrovni buňky (účinky na metabolické procesy) 6) Interakce na úrovni tkání a orgánů po podání toxinů V případě aflatoxinů se projevují: 18

1) Interakce s molekulou DNA: aflatoxin B 1 se váže kovalentní vazbou na atom N7 guanidinových zbytků, právě tato vazba způsobuje inhibici replikace a transkripce a také mutagenitu tohoto toxinu 2) Inhibice replikace, transkripce, translace: aflatoxin B 1 inhibuje RNA, působí na templáty DNA, inhibuje iniciaci transkripce, biosyntézu DNA, proteinů 3) Účinky na buněčné membrány a energetický metabolismus buňky: aflatoxin B 1 inhibuje syntézu glykogenu snížením aktivity glykogensyntetázy a transglykosylázy (enzymy katalyzující elongaci a uspořádání molekul glykogenu) snižuje aktivitu fosfoglukomutázy (reverzibilně katalyzuje přeměnu glukóza-6- fosfátu na glukóza-1-fosfát) redukuje hladinu glykogenu v játrech urychlením oxidace glukóza-6-fosfátu zasahují do metabolismu lipidů, v cytosolu se zvyšuje hladina NADPH na syntézu mastných kyselin v játrech inhibuje transport triacylglycerolů ovlivňuje transport fosfolipidů a cholesterolu ovlivňuje některý z dějů mezi cytochromem b a c v mitochondriích (vliv na dýchací řetězec) 4.1 Humánní klinický význam Aflatoxiny patří mezi jedny z nejsilnějších přírodních toxinů, jimž může být člověk vystaven. Toxicita se projevuje zejména v závislosti na délce doby, po kterou jedinec přicházel do styku s aflatoxiny, a také na množství toxinu, které po tuto dobu přešlo do jeho organismu. Vstup aflatoxinů do organismu může probíhat intravenózně, intraperitoneálně, subkutánně, orálně či penetrací kůží. Podle množství přijatého aflatoxinu a doby jeho příjmu s potravou se intoxikace projevuje buď akutně (končí ve většině případů smrtí) nebo chronicky (vyvolává rakovinné bujení, oslabení imunity a další orgánová postižení) (Bennet a Klich, 2003). Toxikologická charakteristika je následující (Malíř a kol., 2003): aflatoxin B 1 : nejsilnější známý přírodní karcinogen a nejúčinnější hepatokarcinogen, primárně postihuje játra (jelikož játra jsou hlavním místem metabolismu aflatoxinů), způsobuje změny i na jiných orgánech aflatoxin B 2 : karcinogen (možný), genotoxický, nižší toxické účinky než B 1 aflatoxin G 1 : jaterní a ledvinový karcinogen, genotoxický aflatoxin G 2 : karcinogen (možný), genotoxický 19

aflatoxin M 1 : mutagenní, karcinogenní, genotoxický ostatní aflatoxiny: v různé míře toxické Aflatoxiny jsou považovány za možné agens několika závažných onemocnění. Absorpce aflatoxinu B 1 se uskutečňuje především v duodenu. Do jater přechází portální vénou a přechod z plazmy do hepatocytů probíhá pasivní difuzí přes membrány. Po biotransformaci dochází k eliminaci žlučí, při níž je vyloučeno asi 50% z celkového množství aflatoxinů nahromaděných v organizmu. Dalších asi 15-25% je vyloučeno močí. Tento proces je však u různých biologických druhů zcela individuální. U mnoha chorob, spojovaných s těmito toxiny, jsou aflatoxiny považovány pouze za jeden z faktorů způsobujících onemocnění, přesto jsou jejich účinky velmi závažné. Za původce onemocnění nebo jeden z vyvolávajících faktorů jsou považovány v následujících případech: Akutní aflatoxikóza: Vyskytuje se poměrně zřídka. Nejčastěji postihuje játra, v nichž v důsledku postižení vznikají nekrózy. Dále způsobuje jaterní dystrofii. V játrech zemřelých je následně možno histopatologicky ověřit přítomnost toxinu (nejčastější jsou případy s nálezem aflatoxinu B 1 ). Jedna z nejhorších akutních aflatoxikóz byla zaznamenána v roce 2004 v Keni. Při této epidemii zemřelo více než 125 lidí s příznaky odpovídajícími právě intoxikaci aflatoxiny (Probst a kol., 2007). Klinické příznaky tohoto onemocnění jsou podle Suchého a Herziga (2004) hlavně nažloutlé oční bělmo, zvracení, křeče v žaludku, vysílení, hubnutí a bezvědomí končící až smrtí postiženého. Primární jaterní karcinom: Karcinogenita aflatoxinu B 1 je zapříčiněna jeho metabolizovanou formou, která způsobuje bodovou mutaci na kodonu 249 (ser) dochází ke změně pořadí bází z AGT na AGG u tumor supresorového genu p53 (Malíř a kol., 2004). Mutace vede ke vzniku primárního karcinomu. Nádory jater tvoří v ČR asi 3% případů pacientů se zhoubnými nádory (Šimůnek, 2004). Také byl studován vztah mezi virem hepatitidy typu B a zvýšením rizika jaterního karcinomu a bylo zjištěno, že prodělání hepatitidy B zvyšuje přibližně dvacetinásobně riziko vzniku tohoto typu nádoru. Virus hepatitidy B je řazen mezi lidské onkoviry. Potřebuje ovšem, aby působil některý z faktorů vyvolávající onkogenezi a právě v této funkci se často uplatňují aflatoxiny. Kvašiorkor (kwashiorkor): Toto onemocnění, nejčastěji se vyskytující v zemích potýkajících se s hladomorem, je charakterizováno jako výživová dysbalance. Při 20

potenciálním energetickém dostatku se projevuje nedostatek kvalitních bílkovin v potravě. To způsobuje edémy vyvolané právě nedostatkem bílkovin v krvi. U nejtěžších případů tohoto onemocnění byly současně potvrzeny nálezy aflatoxinů jak v potravinách, tak v tělních tekutinách (krev, moč) postižených jedinců. Existuje tedy zřejmě úzký vztah mezi nemocí kvašiorkor a konzumací potravin kontaminovaných aflatoxiny, který byl zjištěn zejména při výzkumech v Etiopii a dalších afrických zemích. Reyův syndrom: Tato choroba postihuje celosvětově zejména děti (Malíř a kol., 2004). Je považována za polyetiologickou a jako jedno z hlavních agens jsou označovány aflatoxiny (Šimůnek, 2004). Především u kojenců do 1 roku (respektive do 6 měsíců) života krmených umělou výživou. Projevuje se horečnatým onemocněním, u něhož jsou příznaky nespecifické. Připomínají však virózu, která záhy přechází do těžkého bezvědomí. Dle Malíře a kol. (2003) má toto onemocnění 2 stádia, přičemž první se projevuje jako zcela běžné respirační onemocnění. Druhá fáze, která nastává většinou již během několika hodin, se vyznačuje zvracením, průjmy a progradující encefalopatií. V této fázi je možno prokázat též patologické laboratorní hodnoty a neurologické příznaky končící křečemi a smrtí postiženého. Morfologicky se prokazuje difúzní malokapénková steatóza jater, steatóza proximálních tubulů ledvin, myokardu a hrudkovitý rozpad kosterních vláken. V 60% dětí zemřelých v bývalém Československu právě na následky tohoto onemocnění byly prokázán aflatoxin B 1 ve vzorcích z jater, žluči a krve. Respirační nádorová onemocnění: U buněk respiračního traktu byla též prokázána schopnost metabolizovat aflatoxin B 1. Zejména při profesním vystavení aflatoxinům se objevily pozitivní nálezy tohoto toxinu ve spojení s respiračními onemocněními a také bylo diagnostikováno několik případů plicního aspergilomu. Encefalopatie Udorn: Výskyt byl pozorován u několika dětí v Thajsku v roce 1971. Příznaky se vyznačují encefalopatií, morfologickým průkazem je tuková degenerace orgánů a edém mozku. Následně byl diagnostikován aflatoxin B 1 v orgánech zemřelých. Cirhóza dětí v Indii: Projevy tohoto onemocnění jsou nejasné gastrointestinální postižení spolu s anorexií, následná hepatomegálie, která postupuje obvykle ke žloutence a jaternímu kómatu (Amla a kol., 1971). Asi v 7% vzorků moči dětí 21

postižených tímto onemocněním byly prokázány aflatoxiny. Z biopsie byly již v prvním až druhém měsíci po konzumaci kontaminovaných potravin odhaleny mírné až vážné tukové infiltrace, ascites (vodnatelnost), architektura jaterních laloků byla zatím nezměněna a dále zde byl nález zánětlivé tekutiny pronikající až do jaterního parenchymu. Další biopsie dětí ve stáří 10 měsíců až jednoho roku vykazovaly již kompletní destrukci architektury jaterních laloků s oddělováním do sept o různé tloušťce, přítomny byly nekrózy různého stupně a proliferace žlučovodů. Další onemocnění: chronická gastritida (Malíř a kol., 2003) mentální retardace dětí (USA) Další nežádoucí účinky aflatoxinů se projevují například ve snížení obranyschopnosti jedince. Zejména aflatoxin B 1 způsobuje poškození chromozomů a inhibici proteosyntézy v lymfocytech (Wada a kol., 2008). Obrázek č. 5: Vážné tukové infiltrace jater po intoxikaci aflatoxiny, zv. 200x, Amla a kol., 1971 4.2 Veterinární klinický význam Aflatoxiny se běžně vyskytují v krmivech, ohrožují tedy nejen člověka, ale také mnoho druhů zvířat, a proto je třeba jim věnovat pozornost i ve veterinární sféře. Zejména kvůli ohrožení hospodářských zvířat, prostřednictvím nichž se aflatoxiny dostávají s jatečními produkty nebo ve své metabolizované podobě obsažené v mléce a mléčných výrobcích také do potravního řetězce lidí. 22

Ze studií propracovaných nejvíce především na zvířatech pochází mnoho výsledků, které byly později též aplikovány na člověka a byla takto potvrzena například i karcinogenita aflatoxinu B 1, jenž byl Mezinárodní agenturou pro výzkum rakoviny při Světové zdravotní organizaci (IARC/WHO) zařazen do karcinogenů skupiny 1, takzvaných prokázaných karcinogenů pro člověka (Malíř a kol., 2003). Tento aflatoxin způsobuje zejména nádory jater a dalších orgánů (žaludek, tračník, příp. ledviny) u následujících zvířat: myši, potkani, pstruzi, lososi, rovníkové ryby, další exotické ryby, kachny, opice, dle Betiny (1994) zejména kosmani. Tvorbu tumorů vyvolává již dávka od 1ppm (=mg/kg) (Rada, 2004). Nejcitlivější k intoxikaci aflatoxiny bývají dle Suchého a Herziga (2004) především drůbeží mláďata (nejvíce kuřata a kachňata). Vnímavá jsou též prasata a koně. Skupinu tolerantní k aflatoxinům zastupují především přežvýkavci a relativně dosti odolné se jeví zejména ovce. Záleží ovšem též na pohlaví, stáří zvířete, jeho fyziologickém stavu a dalších faktorech. Následky intoxikace aflatoxiny jsou následující: akutní intoxikace (vyvolány jednorázovým příjmem vysokých dávek aflatoxinů): úhyn bez příznaků nebo s příznaky anorexie, deprese, dyspnoe, krvácení a anemie subchronická a chronická intoxikace (vyvolaná dlouhodobým příjmem nižších dávek aflatoxinů v potravě): ikterus, hypoprotrombinémie, hematomy, gastroenteritida Jedním z cílových orgánů citlivým k působení aflatoxinů je rovněž thymus (Pier, 1992). Z toho vyplývá, že též u zvířat se objevují imunosupresivní účinky těchto toxinů. Aflatoxiny redukují množství imunoglobulinů G a A a snižují aktivitu komplementu C 4 potřebného pro normální hemolytickou aktivitu v organismu. U mláďat může být již při narození patrné snížení obranyschopnosti způsobené přenosem toxinů přes placentu v děloze březí samice. Taková mláďata postrádají rezistenci k některým infekcím a též nevykazují adekvátní odpověď na očkování. Aflatoxiny mají rovněž prokázaný teratogenní účinek (Malíř a kol., 2003). V dávce 4 mg/kg aflatoxinu B 1 podané intraperitoneálně samicím křečka 8.den březosti vyvolala tato aplikace rozsáhlé anomálie a malformace plodu. K hlavním příznakům intoxikace předcházejícím ve většině případů úhynu zvířete patří nevolnost, neklid, ztráta chuti k jídlu a hmotnostních přírůstků. U slepic snížení produkce vajec, jaterní nekróza, hemoragie. Dalšími příznaky jsou ikterus a vodnatelnost, překrvení plic, glomerulonefritida ledvin, poškození imunitního systému. Nejcharakterističtější známky blížícího se úhynu jsou melancholie, vrávoravá chůze, nervozita a svalové spasmy. U samic také dochází k pozorovatelným změnám na vaječnících 23

a u samců můžeme sledovat menší objem ejakulátu a snížení hmotnosti gonád (Suchý a Herzig, 2004). Požití krmiva zasaženého aflatoxiny způsobuje: u skotu: omezený příjem krmiva, nízké přírůstky, vyšší procento potratů a embryové mortality, nepravidelný pohlavní cyklus, nižší procento zabřeznutí, tiché říje, záněty dělohy, nízké přírůstky, nižší produkce mléka, pokles obranyschopnosti, dysfunkce slezu, ketózy a ztučnění jater, rezidua v mléce u drůbeže: zhoršený růst, snížený přísun krmiva a jeho špatná konverze v organismu, atrofie vaječníků, nižší líhnivost, deformovaná vejce, ztučnění jater, hemoragie, pokles hladiny protilátek v krvi, menší počet leukocytů a T-lymfocytů, pokles koncentrace fagocytů, orální léze Obrázek č.6: Účinky aflatoxinu B 1 na drůbež, vpravo kuře, vystavené aflatoxinu B 1, vlevo zdravý jedinec (převzato z http://www.aflatoxin.info/mycotoxins.asp): u prasat: nechutenství, poruchy reprodukce, průjmy a zvracení, extrémní rozklad zažitiny, změněné biochemické ukazatele v krvi Tabulka č. 1: Letální dávka u aflatoxinů (po perorálním podání), Suchý a Herzig, 2004: Aflatoxin AFB1 18,2 µg/ 50 g (1 denní káče) AFG1 39,2 µg/ 50 g (1 denní káče) AFB2 84,8 µg/ 50 g (1 denní káče) AFG2 172,5µg/ 50 g (1 denní káče) Aflatoxiny (celkem) 370,0 µg/kg (1denní kuře) 500,0 µg/kg (pstruh) 620,0 µg/kg (sele) 7400,0 µg/kg (potkan) 24

5. Metody stanovení a identifikace 5.1 Stanovení obsahu aflatoxinů v potravinách a krmivech V České republice ještě v současnosti neplatí ucelené evropské normy pro stanovování obsahu aflatoxinů v potravinách a krmivech, a proto je jednotlivými směrnicemi dovoleno použít jakoukoliv z metod (Mrkvicová, 2007). Musí pouze splňovat předpoklady týkající se její reprodukovatelnosti, opakovatelnosti a výtěžnosti (Nařízení ES č. 401/2006). Při stanovování obsahu aflatoxinů v potravinách se využívá především jejich fyzikálních, chemických a také biologických charakteristik. Pro každou z analýz jsou velmi důležité, i když často podceňované, první kroky předcházející samotné detekci toxinu v potravinách, a to zejména (Šimůnek, 2004; Malíř a kol., 2003): Zisk vzorku a příprava ke stanovení: Pro některé potraviny je postup upraven speciální normou. Kvalitní odběr vzorku má vliv na přesnost stanovení a je také vhodné používat při kontrole vždy stejnou metodu odběru vzorků pro stejný výrobek. Množství odebraného vzorku se provádí s ohledem na množství produktu, z něhož odebíráme. Měl by být odebrán také takzvaný duplikátní vzorek za účelem potvrzení budoucího výsledku stanovení. Pro daný produkt je třeba vystavit protokol o odběru. Důraz bývá kladen i na transport vzorku, jenž by měl probíhat po uložení daného vzorku do čisté nádoby z inertního materiálu, která jej v případě potřeby ochrání před poškozením či případnou kontaminací při přepravě. Důležitým krokem je také homogenizace vzorku, jelikož aflatoxiny jsou v potravinách často nerovnoměrně rozloženy (zejména v případě sušených fíků nebo arašídů). Extrakce: Cílem je především přenesení co největšího množství testované látky do co nejmenšího objemu vhodného rozpouštědla a zajištění co nenižšího podílu rušících látek. Používá se extrakce vhodným rozpouštědlem na laboratorní třepačce v Erlenmayerově baňce se zábrusem při neutrálním až kyselém ph (Mrkvicová, 2007). Jako jedna z metod se používá takzvaná superkritická fluidní extrakce, kdy dochází k převedení rozpouštědla do superkritického stavu (za teploty od 25 C do 200 C a tlaku 7-60 MPa) Výhodou jsou malé spotřeby rozpouštědla a vysoká účinnost, nevýhodou je zejména značná instrumentální náročnost metody. Čištění: V tomto kroku se potřebujeme zbavit nežádoucích příměsí, které by mohly následně ovlivňovat výsledky detekce. Provádí se ve fázi kapalina-kapalina (dnes již málo používané), kapalina-pevná látka nebo imunoafinní. V současnosti se nejčastěji používají imunoafinní kolonky (prostupné gely, na které jsou specificky ukotveny 25

protilátky proti aflatoxinu). Principem je imunologická reakce antigen + protilátka (Mrkvicová, 2007). Extrakt proteče přes kolonku a nežádoucí látky jsou vymyty (Šimůnek, 2004). Následně je kolonka promyta rozpouštědlem, které zruší vazbu mykotoxin-protilátka. Nevýhodou této metody je poměrně vysoká cena kolonek, většinou pouze na jedno použití. Jako velká výhoda se jeví především rychlost reakce a malá spotřeba rozpouštědel. Detekce: Dělí se na kvalitativní, semikvantitativní a kvantitativní. Používané metody jsou fyzikálně-chemické a biologické. 5.1.1 Fyzikálně-chemické metody: chromatografie 1) Sloupcová chromatografie Látka, která zde působí jako sorbent, je obsažena ve sloupci obklopeném trubicí z vyhovujícího materiálu. Tato metoda je dnes již používaná spíše k přečišťování vzorků než k celkovému stanovení. 2) Tenkovrstvá chromatografie (TLC) Na povrchu odpovídajícího nosiče dochází ke vzlínání směsi rozpustidel v tenké vrstvě použitého sorbentu. Po nanesení vzorku postupně dochází k přechodu rozpouštědla přes vzorek a jednotlivé složky jsou takto unášeny po vrstvě sorbentu různou rychlostí. Další analýzu látek je možno provést buď přímo, pod UV nebo postřikem vhodného chemického činidla, jež vzorek vizualizuje. Výhodou TLC je její odolnost vůči balastním látkám, vzorek nemusí být tak důkladně přečištěn. Z toho vyplývají rovněž menší ztráty při čištění i možnost důkladnějšího studia vlastní látky. Nevýhodou se jeví především horší a méně přesná kvantifikace metody (chyba 5 10%). 3) Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC) Používají se malé speciální desky s velmi jemným sorbentem. 4) Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) Při této metodě se využívají drobné kolonky ve spojení s pumpou, kterou přes ně dochází k protlačování unášecí soustavy. Po průchodu látky přes kolonku se její detekce provádí většinou na základě fyzikálních vlastností roztoku (absorpce viditelného, infračerveného nebo ultrafialového světla). Speciálně pro aflatoxiny se používá takzvaná packed flow cell, což je kyveta z křemenného skla naplněná silikagelem. Ten zesiluje fluorescenci a tím také vzrůstá citlivost dané metody detekce. 26

Nespornou výhodou metody je tedy zejména její kvantifikace s vysokou přesností. Nevýhodou je poměrná materiální náročnost, nákladnost a případné ztráty při čištění. V souvislosti se studií sledující obsah zearalenonu a aflatoxinů v pícninách (Ježková a kol., 2007) byla ke stanovení aflatoxinů metodou HPLC použita kolonka Hypersil ODS ve spojení s mobilní fází skládající se z vody:metanolu:acetonitrilu v poměru 63:26:11 s průtokem nastaveným na 0,3 ml/min. Experiment byl proveden při laboratorní teplotě a detekce byla dokončena pomocí hmotnostního detektoru (MS). 5.1.2 Biologické metody (Šimůnek, 2004) Z těchto metod jsou nejpoužívanější metody RIA a ELISA založené na principu imunitní reakce námi sledované látky s protilátkou. Mykotoxiny působí jako hapteny, to znamená, že vyvolají tvorbu protilátek po navázání na vhodný nosič, kterým může být například bílkovina. Protilátky vhodné pro tuto reakci získáváme buď přímo ze séra imunizovaného zvířete, nebo jako takzvané monoklonální protilátky (všechny jsou produkovány z jedné buňky a pro jejich výrobu se používá B lymfocytů z imunizovaného zvířete, které fúzují s vhodnou nádorovou nebo leukemickou buňkou, poté splynou a vzniká takzvaná nesmrtelná buňka, jež se neomezeně dělí a produkuje protilátky). Výhodou použití metody ELISA je snadné odečítání vzorku (měření intenzity zbarvení fotometricky). Problémem zůstávají hlavně falešně pozitivní výsledky (u aflatoxinu B 1 může dojít ke zkřížené reakci vanilinem nebo mezi aflatoxiny navzájem) Mikrobiologické metody (Ostrý a Škarková, 2003) Pro stanovení aflatoxigenních druhů mikromycet jsou uplatňovány především metody založené na: 1) Rozpoznání morfologických znaků hub potenciálně toxigenních druhů (makrohabitus a mikrohabitus hub druhu Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, případně dalších aflatoxigenních druhů) Aspergillus flavus tvoří rychle rostoucí, žlutozelené kolonie, často tvoří sklerocia zpočátku nahnědlá, později mohou být černá. Mikroskopicky lze rozpoznat jak biseriátní, tak i uniseriátní konidiofory s bradavčitou stopkou a kulovitým měchýřkem. Konidiální hlavice jsou typicky paprsčité, konidie kulovité, hrubě bradavčité, v průměru 3,6 µm. Jemu blízký Aspergillus parasiticus má výrazněji ostnité kolonie. 27

Obrázek č. 7: Aspergillus flavus kolonie (převzato z http://botany.natur.cuni.cz/pdf/kubatova/3.04%20eurotiales-asp%20sekce%20flavi.pdf): Obrázek č. 8: Aspergillus flavus, konidiofor, skanovací elektronový mikroskop (SEM), (převzato z http://www.denniskunkel.com/product_info.php?products_id=1199): Obrázek č. 9: Mikrohabitus rodu Aspergillus, Ostrý a Škarková, 2003: 28

2) Identifikaci pomocí fyziologických znaků (specifický růst na Czapkově agaru při 42 C dobrý především u hub druhů Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus, slabší u hub druhu Aspergillus nominus) 3) Využití biochemických znaků (pigmenty na diagnostických médiích pro aflatoxiny) Kultivační metoda průkazu mikromycet druhu Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus se provádí na médiu vyvinutém již roku 1974 Bothastem a Fennellem, jehož tehdejší složení bylo následující: 1% kvasničního extraktu, 1,5% tryptonu, 0,5% chloridu železitého. Doporučená inkubace 3 dny při 28 C. Dále do tohoto média přidali Hamsa a Ayes (1977) streptomycin a dichloran a doba inkubace se prodloužila na 5 dní při teplotě 28 C. Později bylo složení média upraveno Kingem a kol. a Pittem a kol. v letech 1979 a 1983, čímž se doba inkubace výrazně snížila na 42-48 hodin při 30 C. Dnešnímu složení odpovídají dvě obdobná média: Aspergillus Differentiation Medium Base (ADMB), jež se skládá z 20g kvasničného extraktu, 10g peptonu, 0,5g citranu železito-amonného, 0,002g dichloranu (2,6-dichloro-4- nitroanilin), 0,1g chloramfenikolu, 15g agaru a 1000ml destilované vody. Barva média je jantarová až čirá, ph 6,3±0,2 (4,55% vodný roztok živné půdy), skladovatelnost se doporučuje po dobu 4 týdnů při 2-8 C a vzorek se na toto médium může aplikovat: na Petriho misce s živnou půdou roztěrem 0,1 ml naředěného vzorku na Petriho misce s živnou půdou vzorek izolovaného kmene jehlou namočenou do suspenze z konidií izolátu a polotuhého agaru přímo část testovaného vzorku na Petriho misku s živnou půdou Inkubuje se po dobu 48-72 hodin při 30 C. Poté se provede odečtení výsledku, přičemž pozitivní reakce se projeví oranžovo-žlutým (chromově žlutým) pigmentem pozorovatelným na spodní straně kolonií (viz. Obrázek č. 10) (ten je způsoben reakcí kyseliny aspergilové produkované aflatoxigenními kmeny s železitými ionty, jenž jsou součástí daného média). 29

Obrázek č. 10: Specifický růst Aspergillus flavus na ADMB médiu (Ostrý a Škarková, 2003): Aspergillus flavus a Aspergillus parasiticus agar (AFPA) je médium, které obsahuje 20g kvasničného extraktu, 10g peptonu, 0,5g citranu železito-amonného, 0,002g dichloranu (2,6-dichloro-4-nitroanilin), 0,1g chloramfenikolu, 15g agaru a 1000ml destilované vody. Platí téměř stejné podmínky pro skladovatelnost a inokulaci, pouze inkubace může být kratší, a to 42-48 hodin při 30 C. Přítomnost aflatoxigenních kmenů se projevuje stejně jako v předcházejícím případě (viz. obrázek č. 11). Obrázek č. 11: Specifický růst Aspergillus flavus na AFPA médiu (Ostrý a Škarková, 2004): Molekulárně-biologické metody, např. polymerázová řetězová reakce (PCR) Při polymerázové řetězové reakci se využívá především detekce genů kódujících enzymy podílející se na biosyntéze aflatoxinů (například specifického genu apa-2) (Malíř a kol., 2003). 30

5.2 Stanovení toxigenity Pro stanovování toxigenity (schopnosti produkovat aflatoxiny) daného druhu mikromycety se využívá vhodných substrátů, na kterých je tento druh houby schopen toxin produkovat. Nejznámějšími metodami jsou: a) testování izolovaného kmene vláknitých hub na karlovarských sucharech postup: 10g sterilních sucharů se rozdrtí a na Petriho misce se zalije 5ml suspenze testovaného kmene; kultivace 14 dní, 26 C; k vyhodnocení se využívají metody chromatografické (např. HPLC) nebo imunochemické (ELISA) b) testování izolovaného kmene na syntetickém živném médiu (např. YES médium = Yeast Extract Agar, který je připraven smícháním 20g kvasničného extraktu, 150g sacharózy, 20g agaru, 1ml Cu-Zn koncentrátu a 1000ml destilované vody) postup: médium se očkuje suspenzí kmene určeného k testování; kultivace 14 dní, 30 C; zpracování a vyhodnocení pomocí chromatografických nebo imunochemických metod c) přímé testování potraviny postup: vzorek potraviny, ze které byl izolován potenciálně toxigenní kmen, se umístí na Petriho misku, upraví se jeho vodní aktivita zvlhčením na hodnotu a w zhruba 0,85 (příznivá pro produkci aflatoxinů); kultivace 14 dní, 26 C; vyhodnocení za pomoci chromatografických či imunochemických metod 5.3 Povolené limity aflatoxinů v České republice Jelikož je Česká republika od 1. května 2004 členem Evropské unie, platí u nás následující směrnice týkající se obsahu aflatoxinů v potravinách. Za nejnovější nařízení týkající se tohoto tématu, které uvádí Úřední věstník Evropské unie, je považováno Nařízení Komise (ES) č. 1881/2006 ze dne 19. prosince 2006, kterým se stanoví maximální limity některých kontaminujících látek v potravinách a také Nařízení Komise (ES) č. 2174/2003 ze dne 12. prosince 2003, kterým se mění nařízení (ES) č. 466/2001, pokud jde o aflatoxiny. Použití těchto dvou směrnic shrnuje následující tabulka pro maximální povolené limity těchto toxinů v potravinách. 31

Tabulka č. 2: Maximální limity pro aflatoxiny v potravinách Produkt Maximální limit pro aflatoxiny (μg/kg) Jádra podzemnice olejné, skořápkové plody, sušené ovoce a z nich zpracované výrobky určené k přímé lidské spotřebě nebo pro použití jako potravinová složka Jádra podzemnice olejné, které mají být před použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka vytříděny nebo jinak fyzikálně ošetřeny Skořápkové plody a sušené ovoce, které mají být před použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka vytříděny nebo jinak fyzikálně ošetřeny Obiloviny (včetně pohanky, Fagopyrum sp.) a z nich zpracované výrobky určené k přímé lidské spotřebě nebo pro použití jako potravinová složka Obiloviny (včetně pohanky, Fagopyrum sp.), kromě kukuřice, které mají být před použitím k lidské spotřebě nebo před použitím jako potravinová složka vytříděny nebo jinak B 1 Suma B 1, B 2, G 1 a G 2 M 1 2,0 4,0-8,0 15,0-5,0 10,0-2,0 4,0-2,0 4,0-32