MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta Prognostické a prediktivní faktory u glioblastoma multiforme Disertační práce Brno 2011 MUDr. Radek Lakomý
Disertační práce byla vypracována na Lékařské fakultě Masarykovy univerzity v Brně, a to v rámci kombinované formy doktorského studia, v oboru Onkologie 5103V041. Prohlašuji, že jsem tuto práci pod vedením svého školitele vypracoval samostatně a nepoužil jsem jinou než citovanou literaturu. Se zapůjčováním disertační práce souhlasím. Uchazeč: MUDr. Radek Lakomý Klinika komplexní onkologické péče Masarykův onkologicky ústav, Brno Lékařská fakulta Masarykovy univerzity, Brno Školitel: prof. MUDr. Rostislav Vyzula, CSc. Klinika komplexní onkologické péče Masarykův onkologický ústav, Brno Lékařská fakulta Masarykovy univerzity, Brno 1
Poděkování Děkuji svému školiteli prof. MUDr. Rostislavu Vyzulovi, CSc. za odborné vedení, cenné rady a připomínky, které mi během studia věnoval. Dále děkuji svým kolegům za spolupráci při řešení jednotlivých úkolů předkládané práce (dle abecedního pořadí). MUDr. Renata Belanová MUDr. Leoš Křen, Ph.D MUDr. Eva Lžičařová RNDr. Ondřej Slabý, Ph.D Prof. MUDr. Martin Smrčka, Ph.D MUDr. Marek Svoboda, Ph.D Mgr. Jiří Šána MUDr. Ivana Šiková Prof. MUDr. Pavel Šlampa, CSc. Brno 2011 MUDr. Radek Lakomý 2
OBSAH 1. ÚVOD... 5 2. TEORETICKÁ ČÁST... 7 2.1. Epidemiologie... 7 2.2. Etiologie a patogeneze... 8 2.3. Klinické příznaky onemocnění a stanovení diagnózy... 11 2.4. Základní principy primární léčby... 12 2.4.1. Chirurgie... 12 2.4.2. Radioterapie... 13 2.4.3. Chemoterapie... 14 2.4.4. Cílená léčba... 17 2.5. Základní principy léčby recidivy/progrese onemocnění... 17 2.6. Současné prognostické faktory... 19 2.6.1. Prognostické faktory ve vztahu k pacientovi... 19 2.6.2. Prognostické faktory ve vztahu k nádoru... 20 2.6.3. Prognostické faktory ve vztahu k léčbě... 25 2.7. Laboratorní metody ke stanovení metylace MGMT genu a mirna... 27 2.7.1. Bisulfitová konverze DNA a HRM analýza... 27 2.7.2. Reverzní transkripce a kvantitativní PCR v reálném čase... 28 3. CÍLE PRÁCE... 30 3.1. Studie A klinická část... 30 3.2. Studie B laboratorní část... 30 4. MATERIÁL A METODY... 31 4.1. Studie A klinická část... 31 4.1.1. Soubor pacientů... 31 4.1.2. Léčebný režim a sledování pacientů... 31 4.1.3. Statistická analýza... 32 4.2. Studie B laboratorní část... 33 4.2.1. Soubor pacientů... 33 4.2.2. Metodika bisulfitové konverze DNA a HRM analýzy... 33 4.2.3. Metodika reverzní transkripce a kvantitativní real-time PCR... 37 4.2.4. Statistická analýza... 40 3
5. VÝSLEDKY... 41 5.1. Studie A klinická část... 41 5.1.1. Výsledky primární léčby... 41 5.1.2. Výsledky léčby recidivy/progrese... 46 5.1.3. Toxicita léčby... 49 5.2. Studie B laboratorní část... 50 5.2.1. Stanovení míry metylace promotoru genu pro MGMT a korelace s klinickými parametry a léčebnými výsledky u pacientů s glioblastomy... 51 5.2.2. Stanovení expresních hladin vybraných mirna a jejich vztah k prognóze pacientů s glioblastomy... 52 6. DISKUZE... 54 6.1. Studie A klinická část... 54 6.2. Studie B laboratorní část... 56 7. ZÁVĚR... 59 8. SOUHRN... 61 9. SUMMARY... 63 10. SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY... 65 11. SEZNAM ZKRATEK... 74 12. SEZNAM OBRÁZKŮ... 76 13. SEZNAM TABULEK... 77 14. SEZNAM PUBLIKACÍ DOKTORANDA... 78 15. SEZNAM PŘÍLOH... 81 4
1. ÚVOD Primární nádory centrálního nervového systému (CNS) představují velmi heterogenní skupinu onemocnění, s rozdílným biologickým chováním. Patří sem nádory potenciálně kurabilní (např. meduloblastom, nádory z germinálních buněk), ale také nádory s nepříznivou prognózou (gliomy), u kterých má dnešní léčba převážně paliativní charakter. Současné terapeutické metody mají u většiny zhoubných nádorů CNS limitovanou účinnost a signifikantní toxicitu. I v případě vyléčení mají pacienti často reziduální neurologický a kognitivní deficit, který do určité míry ovlivňuje jejich další život. V běžné klinické praxi se nejčastěji setkáváme s nádory, které mají původ v neuroektodermu (neuroglie) a jsou obecně označovány jako gliomy. Tyto nádory představují více jak 50 % všech primárních nádorů CNS a z nich se ve více jak v 50 % případů jedná o glioblastom. Prognóza pacientů s glioblastomy je i přes velký pokrok v radiodiagnostice, neurochirurgii, radioterapii a chemoterapii stále špatná a za posledních 20 let se zlepšila relativně málo. Je to dáno především biologickým chováním tohoto typu nádoru, jeho lokalizací a stále omezenou účinností jednotlivých léčebných modalit. Klinický výzkum se dnes zaměřuje na cílenou léčbu. Výsledky u některých preparátů jsou povzbudivé, nicméně u většiny zatím nenaplnily naše očekávání. Během posledních desetiletí se všechny zúčastněné medicínské obory také aktivně zapojily do hledání a popisu prognostických a prediktivních faktorů. Snad nejlépe a v relativně vysoké shodě mezi jednotlivými týmy a pracovišti na světě jsou zdokumentovány klinické prognostické faktory jako věk v době diagnózy, stav fyzické zdatnosti, rozsah resekce a další. Podobně jako u jiných diagnóz, je dnes velké úsilí věnováno výzkumu na buněčné a molekulární úrovni. Obory jako patologie či molekulární biologie jsou schopny dobře popsat změny na úrovni genů, chromozomů či produkovaných proteinů a objasnit možnou patogenezi nádoru. Zatím se ale nedaří dostatečně identifikovat ty molekulární faktory, které mají jasný vztah k prognóze onemocnění a predikci léčebné odpovědi. Studií u glioblastomů a z nich publikovaných závěrů je obrovské množství a další informace exponenciálně přibývají. Bohužel výsledky jsou často nejednoznačné, někdy protichůdné, jindy podmíněné dalšími faktory. Určitou limitací bývá také malá velikost a heterogenita souborů. Většina těchto prací je ukončena dodatkem, že dané závěry je třeba ověřit na větším souboru pacientů, nejlépe v rámci velké randomizované klinické studie. Dnes je proto velmi těžké se v dané problematice dobře a rychle orientovat. 5
Pro klinika má zatím většina informací o potenciálních molekulárních prognostických a prediktivních faktorech jen okrajový význam. Poznatky nejsou natolik přesvědčivé, aby měly vliv na rozhodování při volbě léčebného postupu. Další výzkum je ale nutné podporovat, protože jinak se naše možnosti a prognózy našich pacientů nemohou zlepšit. Problematikou primárních nádorů mozku se zabývám již mnoho let, v podstatě od svého příchodu na Masarykův onkologický ústav v roce 2002. Od roku 2004 jsem členem komise pro nádory CNS. Aktivně se podílím na rozhodovacím procesu, léčbě, výzkumu, publikační a přednáškové aktivitě týkající se této problematiky. 6
2. TEORETICKÁ ČÁST Glioblastoma multiforme patří k primárním mozkovým nádorům, které mají původ v neuroglii a jsou obecně nazývány gliomy. Jedná se o prognosticky nejhorší formu gliomu a svojí incidencí bohužel patří k nejčastějším primárním nádorům mozku vůbec. Název tohoto zákeřného onemocnění pochází již z 20. let minulého století, kdy ho poprvé použili lékaři Percival Bailey a Harvey Cushing v klasifikaci gliálních nádorů mozku [1]. Vážná prognóza pacientů s glioblastomy je dána biologickým chováním onemocnění rychlý a invazivní charakter růstu a absencí kurativní metody. Medián přežití pacientů s glioblastomy se za posledních 20 let prodloužil řádově o měsíce a to i přes pokrok, kterého bylo v onkologii dosaženo. Jde o další diagnózu, která vyžaduje intenzivní výzkum jak na poli diagnostiky, tak i léčby. 2.1. Epidemiologie Primární mozkové nádory představují pouze 2 % všech malignit u dospělých. Cca 50 % z nich jsou gliomy a ve více jak v 50 % případů se jedná o glioblastom. Zjednodušeně řečeno, dnes každý 4. pacient s diagnózou primárního nádoru mozku onemocněl glioblastomem. Incidence primárních mozkových nádorů se za posledních 30 let zdvojnásobila, dnes se pohybuje mezi 2-3 případy na 100 000 obyvatel za rok. Celosvětově má 2 vrcholy, první do 10 let věku a druhý podstatně výraznější mezi 55-70 lety (až 4 případy/100 000 obyvatel/rok). Více než 80 % pacientů je v době stanovení diagnózy starší jak 50 let. V roce 2008 byla incidence primárních nádorů mozku v ČR u dospělé populace (nad 20 let) 7,09/100 000 obyvatel; mortalita 5,66/100 000 obyvatel; mírně převažovali muži (7,75 vs 6,55/100 000), viz Obrázek 1 [2]. 7
Obrázek 1: Incidence a mortalita primárních mozkových nádorů u dospělých v ČR [2]. 2.2. Etiologie a patogeneze Etiologie primárních mozkových nádorů je pravděpodobně multifaktoriální a u většiny případů je neznámá. Za jasně prokázaný vyvolávající faktor je považováno ionizující záření (až 22x zvýšené riziko vzniku gliomu po profylaktické radioterapii kránia u dětí s akutní lymfoblastickou leukémií) a dlouhodobá imunosuprese (infekce HIV, imunosupresivní léčba po transplantacích) [3]. Ostatní potenciální etiologické faktory nebyly studiemi jasně potvrzeny (úrazy hlavy, kouření, elektromagnetické pole, aromatické uhlovodíky a další). Velký zájem vyvolaly klinické studie zaměřené na riziko dlouhodobého používání mobilních telefonů. Jejich možný podíl na zvýšené incidenci gliomů nebyl dosud vyloučen a rozhodně bude toto téma předmětem dalšímu výzkumu [4]. U cca 5 % pacientů můžeme pozorovat familiární výskyt maligních gliomů. V cca 1 % případů vznikají gliomy v rámci známých genetických syndromů (např. Li-Fraumeni syndrom, Turcotův syndrom, neurofibromatóza, tuberozní sklerosa) [5]. V případě familiárního výskytu je známo, že příbuzní 1. stupně mají 2-3x vyšší riziko, že onemocní stejným mozkovým nádorem. V patogenezi gliomů se uplatňují somatické mutace v genech důležitých pro kontrolu buněčného růstu a proliferace [6,7]. V případě glioblastomu bylo zjištěno, že toto onemocnění může vznikat dvěmi cestami. Buďto glioblastom vzniká de novo, pak je označován jako primární (90 % glioblastomů), nebo vzniká postupnou maligní transformací z astrocytomu grade (G) 2 nebo G3 (nejčastěji během 4-5 let) a pak se jedná o glioblastom sekundární. Primární glioblastom se vyskytuje častěji u pacientů starších jak 50 let, typická je krátká anamnéza potíží (často méně jak 3 měsíce) a horší prognóza. 8
Primární a sekundární glioblastomy se liší profilem genetických změn. Pro primární glioblastom je charakteristická amplifikace genu pro EGFR (40 % případů) a/nebo jeho overexprese (60 %), PTEN mutace (30 %), p16ink4a delece (30-40 %), MDM2 amplifikace (< 10 %) a/nebo overexprese (50 %), a v 50-80 % případech ztráta heterozygozity (LOH) chromosomu 10. Naopak u sekundárních glioblastomů, které se vyskytují u mladších pacientů (kolem 40 let) a vznikají transformací z astrocytomu G2 nebo G3 nacházíme často mutaci genu p53 (60 % případů) a RB genu, častá je i LOH chromosomů 19q a 10q, ale gen pro EGFR nebývá alterován [8-11]. Z klinického pohledu je dělení glioblastomů na primární a sekundární zatím spíše akademickou otázkou. Léčebný postup se u obou forem nijak neliší. Klasická TNM klasifikace se dnes pro mozkové nádory nepoužívá. Nevypovídala dostatečně o prognóze onemocnění, protože v případě nádorů CNS má větší prognostickou sílu histologický typ než velikost nádoru. V současnosti se všeobecně akceptuje WHO klasifikace z roku 2007 [12]. Ta dostatečně rozděluje nádory dle histologického typu a diferenciace, což lépe charakterizuje onemocnění z hlediska prognózy. V případě astrogliomů se používá čtyřstupňový systém, kde multiformní glioblastom (neboli astrocytom G4) představuje jejich nejagresivnější formu. Dle definice WHO je glioblastom anaplastický gliom, s typickou nukleární variabilitou a vysokou mitotickou aktivitou. Proliferační aktivita bývá úsekově variabilní, v průměru obvykle 15-20 % jader. Výrazně vyšší bývá u malobuněčného glioblastomu. Dalšími určujícími znaky jsou početné mikrovaskulární proliferace s vrstvením endotelií, případně přítomnost ložisek nekrózy. U glioblastomů je možná regionální heterogenita. Ta může být příčinou diagnostických rozpaků při hodnocení limitovaného množství nádorové tkáně ze stereotaktických biopsií, kdy v některých úsecích jsou ložiska vzhledu diferencovaného astrogliomu (G2), nebo oligodendrogliální komponenta. K základnímu barvení tkáně glioblastomu se dnes používá barvení hematoxylin-eosin, které je znázorněno na Obrázku 2. 9
Obrázek 2: Barvení hematoxylin-eosin, zvětšení 200x. Imunohistochemické barvení s protilátkou proti GFAP (glial fibrillary acidic protein), což je strukturální a funkční bílkovina z kategorie intermediárních filament, se používá ke znázornění gliálních elementů CNS, včetně buněk gliálních tumorů (Obrázek 3). Pro srovnání negativní okrsek cévních struktur v pravém horním rohu. Obrázek 3: GFAP (klon 6F2), zvětšení 200x. Imunohistochemické barvení Ki67 (nukleární protein asociovaný s aktivní fází buňky) slouží jako ukazatel proliferující frakce nádorových buněk. Hodnota se udává v procentech a ukazuje počet buněk v aktivní růstové fázi z celkového počtu buněk. Stanovuje se za pomocí morfometrické analýzy z počtu 300-700 jader (Obrázek 4). 10
Obrázek 4: Ki 67 (klon SP6), zvětšení 400x. 2.3. Klinické příznaky onemocnění a stanovení diagnózy Klinické příznaky mozkových nádorů obecně závisí na jejich lokalizaci a rychlosti růstu. V případě glioblastomu bývá často vyjádřen syndrom nitrolební hypertenze, dále mohou být přítomny mentální změny, fokální neurologický deficit, méně často epileptické záchvaty. Příznaky onemocnění jsou odrazem infiltrace a útlaku mozkové tkáně při růstu nádoru s perifokálním edémem. Pro glioblastom je typická krátká anamnéza potíží, řádově několik týdnů. Na základě klinických potíží je nejčastěji neurologem indikováno CT nebo MR vyšetření. V případě glioblastomu nacházíme po intravenózní aplikaci kontrastní látky heterogenní, expanzivně se chovající útvar, obvykle utlačující komory a přetlačující středočárové struktury. Často se setkáváme s prstenčitým zvýšením denzity na okraji centrálně uložených nekrotických oblastí přecházející do okolního edému, viz Obrázek 5 a Obrázek 6. Asi 50 % glioblastomů postihuje více jak jeden lalok hemisféry nebo jsou bilaterální. Nejčastější lokalizací je temporální lalok (31 %), dále parietální (24 %), frontální (23 %) a okcipitální (16 %) [13]. Podezřelý nález na CT nebo MR vyšetření je indikací k neurochirurgickému výkonu s cílem histologické verifikace procesu. Důležité je vyloučení neonkologické příčiny (např. absces, ischémie, toxoplazmóza), v případě potvrzení malignity pak odstranění nádorové tkáně. Další pomocné zobrazovací metody nejsou předmětem této práce, proto je zde podrobněji nerozvádím. 11
Obrázek 5: MR vyšetření T1 zobrazení. Obrázek 6: MR vyšetření T2 zobrazení. 2.4. Základní principy primární léčby Standardním léčebným postupem u glioblastomu je dnes maximální resekční výkon se zachováním kvality života následovaný kombinací radioterapie a chemoterapie s temozolomidem (konkomitantně a v adjuvantním podání po ukončení radioterapie). U pacientů nad 70 let nebo u pacientů v horším klinickém stavu bývá častěji indikována méně intenzivní léčba (samotná radioterapie nebo chemoterapie, nebo jejich sekvenční podání). Léčebná strategie, zvláště pooperační, by měla být určena multidisciplinárním týmem, optimálně ve složení: neurochirurg, radiační a klinický onkolog, radiodiagnostik, neurolog a patolog. 2.4.1. Chirurgie Cílem neurochirurgického výkonu je maximální odstranění nádorové masy bez poškození funkčně důležitých oblastí mozku. Tím dosáhneme zmírnění nebo odstranění příznaků onemocnění, histologické verifikace procesu, zlepšení podmínek pro následnou léčbu a zvýšení šancí na prodloužení života se zlepšením jeho kvality. Neurochirurgický výkon s odstraněním více jak 90 % nádoru má dle četných retrospektivních studií ve srovnání s méně rozsáhlou resekcí nebo biopsií pozitivní vliv na délku života pacientů a patří k všeobecně uznávaným pozitivním prognostickým faktorům [14,15]. Odstranění 100 % nádorové tkáně je pro infiltrativní charakter růstu bohužel nemožné. Dle sekčních nálezů jsou nádorové buňky často nalézány až 2-3 cm od viditelné hranice nádoru. Navíc 12
peroperační odlišení nádorové a zdravé mozkové tkáně bývá často velmi problematické až nemožné. Ammirati a kol. již v roce 1987 publikovali, že makroskopická totální resekce signifikantně zvyšuje pravděpodobnost dvouletého přežití ve srovnání se subtotální resekcí (19 vs. 0 %) [16]. Dle další studie se 416 pacienty autoři také poukazují na superioritu totální resekce (zde definováno > 98 % resekce dle MR kontroly) nad subtotálním resekčním výkonem, medián celkové doby přežití (OS) takto léčených pacientů byl 13,0 vs 8,8 měsíců [17]. Podobné výsledky potvrdila i rozsáhlá metaanalýza 28 studií, kde medián OS u pacientů po totální resekci (součást multimodální léčby) byl 14,0 vs 11,0 měsíců po resekcích subtotálních [18]. Podobné závěry vycházejí i z dalších klinických studií [19-21]. Díky moderním zobrazovacím a funkčním metodách jako funkční MR, stereonavigace, peroperační neurofyziologický monitoring, awake surgery a peroperační fluorescence s 5- aminolevulovou kyselinou (5-ALA) jsme dnes schopni za příznivých okolností odstranit až 98 % nádoru nebo bezpečněji operovat v elokventních zónách bez vážného poškození pacienta [22]. Kde je chirurgický výkon rizikový z poškození důležitých struktur, tam je alespoň snaha indikovat stereotaktickou biopsii s cílem získat dostatečné množství tkáně k histologické diagnostice. U nádorů uložených hluboko v kmeni, kde je i stereotaktická biopsie zatížena vysokým rizikem morbidity a mortality je diagnóza výjimečně stanovena jen na základě zobrazovacích metod a klinického průběhu. Vzhledem k infiltrativnímu charakteru růstu glioblastomů, jejich nepřesnému ohraničení od zdravé mozkové tkáně a častému postižení elokventních zón nemůže být samotný chirurgický výkon dostačující a musí následovat radioterapie (3D konformní radioterapie nebo IMRT radioterapie s modulovanou intenzitou) a pokud možno i chemoterapie. Medián OS se u pacientů s glioblastomy po samotném resekčním výkonu, bez další léčby, pohybuje kolem 4-6 měsíců. Větší benefit operace lze očekávat u mladých pacientů, v dobrém celkovém stavu. U pacientů, kteří nepodstoupí ani chirurgický výkon je pravděpodobná délka života kolem 3 měsíců. 2.4.2. Radioterapie Radioterapie má nezastupitelné místo v komplexní léčbě glioblastomů. V léčebném algoritmu navazuje na neurochirurgický výkon. Její jednoznačný benefit pro pacienty s high-grade gliomy je podložen prospektivními klinickými studiemi již ze 70. let minulého století. Jednou z nich je studie Walkera a kol., ve které byl medián OS u pacientů v rameni 13
s pooperační radioterapií (60 Gy, WBRT radioterapie celého mozku) 35 týdnů, kdežto v rameni jen s podpůrnou léčbou po neurochirurgickém výkonu 14 týdnů [23]. Podobné výsledky publikoval také Kristiansen a kol., pacienti v rameni s pooperační radioterapií žili podstatně déle než v rameni s nejlepší podpůrnou léčbou (10,8 vs 5,2 měsíce) [24]. Dle výsledků výše uvedených i současných studií lze uvést, že pooperační radioterapie může prodloužit OS na 8-12 měsíců. Následně proběhla řada prospektivních klinických studií, jejichž cílem bylo upřesnit základní parametry pro léčbu zářením (cílový objem, celková dávka, počet frakcí, dávka na frakci a další) [25-27]. Zkoušena byla také role radiochirurgického boostu (15-24 Gy) aplikovaného po konvenční radioterapii (60 Gy). Navýšení dávky se ale jasně nepromítlo do prodloužení OS, navíc bylo zatíženo vyšší lokální toxicitou [28]. Podobně dopadly i studie s brachyradioterapií s využitím radioizotopu I-125 [29]. Standardním postupem je dnes frakcionovaná zevní radioterapie (3D konformní radioterapie nebo IMRT) v celkové dávce 54-60 Gy (1,8-2,0 Gy na frakci) na cílový objem (nádorový objem + 2-3 cm lem) [30]. U pacientů ve vyšším věku nebo v horším klinickém stavu je možné použít šetrnější hypofrakcionační režimy (30-35 Gy/10 frakcí, 40 Gy/15 frakcí). Dle prospektivních klinických studií bylo prokázáno, že OS u takto léčených pacientů je stejné jako při konvenčním režimu 60 Gy/30 frakcí [31,32]. 2.4.3. Chemoterapie Postavení chemoterapie v rámci pooperační léčby u high-grade astrocytomů a tedy i glioblastomu bylo dlouho kontroverzní. Klinické studie zkoušející potenciál chemoterapie v této indikaci probíhají již od 70. let minulého století, bohužel často s protichůdnými závěry. Některé neprokázaly statisticky signifikantní vliv přidané chemoterapie na prodloužení života [33,34], jiné naopak zaznamenaly mírné zlepšení OS u pacientů léčených kombinací chirurgie, radioterapie a chemoterapie [35,36]. Zejména metaanalýza 12 studií (GMT Group, 2002) zahrnující přes 3000 pacientů léčených pooperačně samotnou radioterapií nebo současným podáním radioterapie a chemoterapie zjistila absolutní zvýšení jednoletého přežití ze 40 na 46 % a prodloužení mediánu OS o 2 měsíce v případě, že k léčbě byla přidána chemoterapie. Při cytostatické léčbě, založené nejčastěji na derivátech nitrosourey však docházelo k významnému navýšení toxicity. V roce 2002 byla v USA schválena indikace lokální chemoterapie, aplikované do lůžka nádoru po resekci (BCNU polymer wafers - Gliadel). Prodloužení OS však nebylo nijak přesvědčivé 14
(13,8 vs. 11,6 měsíce u placeba), pooperační komplikace nebyly zcela zanedbatelné, což pravděpodobně zabránilo masovějšímu používání [37]. Role pooperační chemoterapie v léčbě glioblastomu byla zásadně přehodnocena na základě výsledků randomizované multicentrické klinické studie fáze III - EORTC 22981/26981, které byly publikovány Stuppem a kol. v roce 2005 [38]. Pooperační chemoradioterapie s temozolomidem statisticky signifikantně prodloužila OS i přežití bez progrese onemocnění (PFS). Medián OS u pacientů v rameni s konkomitantní chemoradioterapií byl 14,6 vs. 12,1 měsíců bez chemoterapie, dvouleté přežití bylo 26 vs. 10 % bez chemoterapie. Výsledky OS ve vztahu k radikalitě operačního výkonu a charakteru následné léčby zobrazuje Tabulka 1. Tabulka 1: Celkové přežití podle rozsahu operace a následné léčby [39]. Použitá léčba a celkové přežití (%) Čas Totální resekce Parciální resekce Biopsie CHT/RT RT CHT/RT RT CHT/RT RT 2 roky 38,4 15 23,7 9,4 10,4 4,6 3 roky 21,4 5,3 14,3 3,7 7,8 4,6 4 roky 15,9 4,4 11,3 2,5 5,2 0 5 roků 9,9 2,9 11,3 1,2 5,2 0 Medián OS (měsíce) 18,8 14,2 13,5 11,7 9,4 7,8 Zkratky: RT radioterapie, CHT/RT chemoradioterapie, OS celkové přežití Nejlepší léčebné výsledky byly popsány ve věkové skupině pacientů mladších 50 let. Zde se pěti let dožívalo po kombinované terapii 17 % pacientů, v případě samostatné radioterapie jen 4,9 %. U pacientů nad 50 let byly výsledky znatelně horší, pět let po léčbě chemoterapií a radioterapií žilo 6,4 %, po samotné radioterapii pouze 0,7 % [39]. Součástí Stuppovy analýzy bylo také vyhodnocení léčebných výsledků u pacientů, kteří podstoupili jen biopsii. U pacientů, kteří absolvovali kombinovanou chemoradioterapii (48 pacientů), bylo pozorováno pětileté přežití u 5,2 %. Bohužel ve skupině s následnou samotnou radioterapií (45 pacientů) již ve čtvrtém roce sledování nežil žádný pacient (Tabulka 1) [39]. 15
Díky studii byla na základě retrospektivního hodnocení také potvrzena role nového molekulárního prognostického faktoru metylace promotoru genu pro O 6 -metylguanin- DNA-metyltransferázu (MGMT). Aktivita tohoto DNA reparačního enzymu je spojena s rezistencí nádoru k léčbě, protože enzym odstraňuje alkylační skupiny z O 6 pozice guaninu. Inaktivace enzymu nebo pokles produkce při metylaci promotoru jeho genu vede k vyšší účinnosti léčby a v konečném důsledku k prodloužení celkového přežití. Dle této studie měli pacienti s prokázanou metylací promotoru genu pro MGMT delší OS, bez ohledu na podanou léčbu. Jednoznačně nejlepších výsledků ale dosáhli pacienti s metylací MGMT a s podanou konkomitantní chemoradioterapií a adjuvantní chemoterapií, což svědčí i o prediktivním potenciálu tohoto markeru ve vztahu k efektivitě přidané chemoterapie s alkylačním účinkem (temozolomid), podrobně viz Tabulka 2. Tabulka 2: Celkové přežití ve vztahu k použité léčbě a stavu metylace MGMT genu [39]. Celkové přežití (%) Čas Metylovaný MGMT gen Nemetylovaný MGMT gen CHT/RT RT CHT/RT RT 2 roky 48,9 23,9 14,8 1,8 3 roky 27,6 7,8 11,1 0 4 roky 22,1 7,8 11,1 0 5 roků 13,8 5,2 8,3 0 Medián OS (měsíce) 23,4 15,3 12,6 11,8 Zkratky: RT radioterapie, CHT/RT chemoradioterapie, MGMT O 6 -metylguanin-dna metyltransferáza, OS celkové přežití Stuppův režim se tak díky jasně potvrzenému benefitu adjuvantní chemoterapie stal novým léčebným standardem, který je platný dodnes. Obdobné výsledky publikovali i Mirimanoff a kol. [40], Athanassiou a kol. [41] a řada dalších. Problémy se standardizací metody k vyšetřování stavu metylace promotoru genu pro MGMT jsou zatím jedním z hlavních důvodů, které brání plnému využití tohoto dominantního prognostického a do jisté míry i prediktivního molekulárního markeru v běžné praxi. 16
2.4.4. Cílená léčba Podobně jako u jiných nádorových onemocnění i u glioblastomu proběhla a probíhá řada klinických studií zkoumající efekt cílené léčby. Metody založené nejčastěji na monoklonálních protilátkách a tyrosinkinázových inhibitorech v monoterapii nebo v kombinaci se standardním způsobem léčby se zkouší jak u nově diagnostikovaných glioblastomů, tak i v léčbě recidiv. Nejčastěji se jedná o léčiva zaměřená proti mechanismům angiogeneze, signálním drahám receptorů pro růstové faktory, m-tor, proteinkináze C a integrinům. V tomto směru dosud nejnadějnějších výsledků dosáhl bevacizumab, který je v USA a ve Švýcarsku již schválen k léčbě rekurentních high-grade gliomů, v monoterapii nebo v kombinaci s chemoterapií [42-44]. Začlenění bevacizumabu do první linie léčby ke konkomitantní chemoradioterapii s temozolomidem je nyní předmětem probíhajících klinických studií fáze III (AVAglio, RTOG 0825) [45]. Mezi další perspektivní látky se dnes řadí inhibitor integrinů αvβ3 a αvβ5 cilengitid. Výsledky z klinických studií fáze II u pacientů s přítomnou metylací MGMT jsou velmi povzbudivé, nyní očekáváme výsledky ze studie fáze III (CENTRIC) [46]. Výsledky klinických studií s dalšími preparáty cílenými na VEGFR (cediranib), EGFR (cetuximab, gefitinib, erlotinib), PDGFR (imatinib), m-tor (everolimus, temsirolimus), proteinkinázu Cβ2 (enzastaurin) jsou dosud málo uspokojivé [47-52]. Samotná problematika vzniku a dalšího vývoje glioblastomu je natolik složitá, že nemůže být vyřešena jednou léčebnou metodou. V budoucnu budeme pravděpodobně kombinovat moderní cílenou léčbu se standardní cytostatickou léčbou, což se již odráží v designu aktuálně probíhajících a připravovaných klinických studiích. Nové možnosti pravděpodobně nabídne i imunoterapie a genová léčba. 2.5. Základní principy léčby recidivy/progrese onemocnění Ve více jak 80 % případů dochází k recidivě glioblastomu do 2-3 cm od okrajů primárního nádoru, multifokální rekurence se objevuje u cca 5-6 % pacientů. Léčba rekurentních glioblastomů je podmíněna více faktory a musí být individuálně zvážena, ideálně cestou multidisciplinární komise pro mozkové nádory. Rozhodování je závislé na věku pacienta, přidružených onemocněních, celkové fyzické zdatnosti, odpovědi na primární léčbu, délce období bez relapsu od primární léčby a také na velikosti a lokalizaci recidivy. 17
V první řadě má být posouzena možnost reoperace. Ve správně indikovaných případech může operační výkon významně prodloužit délku života a zlepšit jeho kvalitu. Pokud operační výkon není možný nebo je příliš rizikový, pak lze zvážit reiradiaci. Limitací je ale často velikost recidivy, již aplikovaná dávka ozařování a časový interval od předchozí radioterapie. Ve vybraných případech můžeme s výhodou využít možnosti stereotaktické radioterapie nebo radiochirurgie [53,54]. Pokud není operace ani reiradiace vhodná, pak lze pacientovi nabídnout paliativní chemoterapii. Většina režimů pro léčbu rekurentních glioblastomů je založena na derivátech nitrosourey (karmustin, lomustin, kombinovaný režim PCV), derivátech platiny, vepesidu nebo cyklofosfamidu. Problémem je ale nízký počet léčebných odpovědí (RR) kolem 10 % a jejich krátké trvání. Medián PFS se pohybuje mezi 3-6 měsíci a pravděpodobnost šestiměsíčního přežití bez progrese (PFS-6) mezi 15-29 % [55-57]. Zatím nebylo studiemi prokázáno, že by kombinovaná chemoterapie byla v případě rekurentních glioblastomů účinnější než monoterapie nitrosoureou [55]. V posledních létech bylo publikováno velké množství prací s dose-dense a metronomickými režimy s temozolomidem. Medián PFS se dle studií pohyboval mezi 3-4 měsíci a medián délky života od recidivy/progrese mezi 5-9 měsíci, viz Tabulka 3 [58-60]. Nevýhodou dose-dense režimů může být častější selektivní CD4+ lymfopenie, která je rizikovým faktorem pro rozvoj oportunních infekcí (např. Pneumocystová pneumonie) [61,62]. Tabulka 3: Dose-dense a metronomické režimy s temozolomidem [58-60]. Režim Dávka Dny podávané Dávkový interval PFS-6 temozolomidu chemoterapie 7/14 150 mg/m 2 D 1-7 14 dní 48 % 21/28 75-100 mg/m 2 D 1-21 28 dní 17-30 % 28/28 50 mg/m 2 D 1-28 (kontinuální) 28 dní 27-35 % Zkratky: PFS-6 šestiměsíční přežití bez progrese onemocnění, D den Výsledky s metronomickými režimy jsou velmi zajímavé. Problém zatím je, že nejsou podloženy daty z větších klinických studií fáze III. Dle studie fáze II RESCUE mohou z návratu k temozolomidu v metronomickém režimu profitovat především pacienti, kteří na tomto léku v minulosti nezprogredovali [58]. 18
Podobně je na tom i bevacizumab, který má zatím nejlepší výsledky v léčbě rekurentních glioblastomů. Ve studiích byl zkoušen jak v monoterapii, tak v kombinaci s chemoterapií, nejčastěji s irinotecanem. V monoterapii se PFS-6 pohyboval mezi 29-42 % a medián přežití od recidivy byl kolem 7-9 měsíců. V kombinaci s chemoterapií byly výsledky podobné (PFS-6: 30-50 %, medián přežití od recidivy: 8,7-9,8 měsíců) [42-44]. Tolerance léčby byla velmi dobrá. Četnost a závažnost nežádoucích účinků jako krvácení do CNS, trombózy, embolizace, hypertenze nebo proteinurie nebyly odlišné od léčby s bevacizumabem u jiných diagnóz. Problémem je zatím schválení jeho indikace pro léčbu rekurentních glioblastomů v Evropské unii, podmínkou je ověření účinnosti léku v rámci klinické studie fáze III. Jiné preparáty z oblasti cílené léčby se u rekurentních glioblastomů zatím neprosadily a stále jsou předmětem klinického zkoušení. Nejdále je pravděpodobně inhibitor integrinů cilengitid, který má zajímavé výsledky především u podskupiny pacientů s přítomnou metylací MGMT genu. Svoji účinnost musí ale také potvrdit v klinické studii fáze III [46]. 2.6. Současné prognostické faktory Prognóza pacientů s glioblastomy je i při použití všech dostupných léčebných metod nepříznivá. Medián celkového přežití se dnes pohybuje kolem 12 měsíců a jen cca 5 % pacientů žije déle než 3 roky. Prognostické faktory můžeme rozdělit do 3 základních skupin. 1. Prognostické faktory ve vztahu k pacientovi 2. Prognostické faktory ve vztahu k nádoru 3. Prognostické faktory ve vztahu k léčbě 2.6.1. Prognostické faktory ve vztahu k pacientovi K obecně uznávaným a klinicky podloženým prognostickým faktorům, které mají vliv na délku života pacientů s glioblastomy patří: Věk platí, že mladší věk je pozitivním prognostickým faktorem. Dle klinických studií není jasná shoda na věkové hranici, některé uvádí hranici 40 let, jiné 45 let, většina ale uznává hranici 50 let. U pacientů mladších 40 let lze očekávat, že pravděpodobnost 18měsíčního přežití je cca 50 %, ve věku mezi 40-60 lety kolem 20 % a u pacientů starších 60 let jen cca 10 %. Význam věku jako prognostického faktoru potvrdil i Stupp a kol. [38]. 19
Stav celkové fyzické zdatnosti podobně jako věk, má významný vliv na délku života pacientů. Velkou mírou ovlivňuje léčebnou strategii jak u nově diagnostikovaných pacientů, tak i v případě rekurence. Dnes používáme 2 hodnotící škály dle Karnofského (KPS) 100-0 a dle ECOG nebo WHO (PS) 0-5. Hodnocení fyzické zdatnosti je důležitou součástí uznávaných prognostických klasifikací, viz níže [94-96]. Stav mentálních funkcí pacienta kritérium hodnotící stav kognitivních funkcí, orientaci místem, časem, paměťové funkce, afázii, apraxii a další. Maximální hodnota bodů dle hodnotící škály Mini-Mental Status Examination (MMSE), kterou pacient může dosáhnout je 30. Hodnota 26 bodů a méně je spojena se signifikantně horší prognózou [63,64]. Přítomnost neurologického deficitu a délka příznaků úzce souvisí se stavem fyzické zdatnosti a mají vliv na intenzitu léčby. Krátké trvání příznaků (< 3 měsíce) svědčí o rychlém růstu a agresivitě nádoru a znamená horší prognózu [94-96]. 2.6.2. Prognostické faktory ve vztahu k nádoru Histologický typ a grade glioblastom (astrocytom G4) představuje nejagresivnější formu gliomu, sama histologická jednotka je negativní prognostický faktor. I přesto v rámci glioblastomu rozlišujeme prognosticky horší histologické podjednotky (např. sarkomatoidní varianta) [12]. Velikost nádoru a lokalizace jsou klasické klinické prognostické faktory ovlivňující možnosti multimodální léčby glioblastomu (radikalita resekce, možnosti aplikace cílené radioterapie). Molekulárně-genetické faktory molekulární a genetické abnormality u gliomů jsou zkoumány již řadu let [6-11,65-69]. Podařilo se popsat patogenezi primárního a sekundárního glioblastomu a základní rozdíly mezi těmito podjednotkami. Dobře byly prozkoumány aberantně aktivované signální cesty (kaskáda RAS a PI3K cesta) jejichž důsledkem je nekontrolovaná buněčná proliferace a růst nádoru, potlačení apoptózy a vystimulovaná angiogeneze. Tyto poznatky jsou základem pro další klinický výzkum s cílenou léčbou. 20
Ztráta heterozygozity (LOH) 10q: je velmi častá genetická porucha u primárních i sekundárních glioblastomů, objevuje se v 60-90 % případů. Mutace genu p53: gen p53 je tumor supresorový gen a jeho mutace patří k prvním genetickým alteracím u astrocytárních nádorů. Mutace nebo delece se vyskytuje u 25-60 % glioblastomů. Hraje důležitou roli především v patogenezi sekundárního glioblastomu, je proto častější u mladších pacientů. Mutace a amplifikace genu pro EGFR: gen pro EGFR (receptor pro epidermální růstový faktor) se podílí na kontrole buněčné proliferace. Overexprese a aktivační mutace jsou časté u primárních glioblastomů, kde se objevují až ve 40-50 %. Důsledkem je nekontrolovaný buněčný růst. Mutační varianta trvale aktivovaného EGFR (EGFRvIII) je dnes považována za slibný cíl pro peptidové vakcíny [66,67]. Amplifikace a overexprese genu pro MDM2: MDM2 je inhibitor p53. Důsledkem je únik před kontrolními mechanismy proteinu P53. Overexprese MDM2 se vyskytuje v cca 10-15 %. Amplifikace a overexprese genu pro PDGFR: stimulace PDGFR (receptor pro destičkový růstový faktor) má mitogenní efekt na gliální buňky. Hraje důležitou roli v patogenezi sekundárních glioblastomů (vyskytuje se až v 60 % případů). Mutace genu pro PTEN: gen se nachází na chromozomu 10q23.3 a má funkci nádorového supresoru. Jeho vyřazení vede k nadměrné aktivitě AKT signální dráhy jejíž důsledkem je nadměrná buněčná proliferace. PTEN mutace se vyskytuje cca u 20-30 % glioblastomů, častěji u primárních. Výše uvedené genetické změny jsou nedílnou součástí složité patogeneze glioblastomu. Klinické studie zaměřené na prognostický význam těchto faktorů ve vztahu k přežití však dosud nepřinesly jednoznačné výsledky. Mutace genu pro IDH1: gen pro IDH1 (isocitrát-dehydrogenáza 1) je lokalizovaný na chromosomu 2q33. IDH1 je nezbytná pro tvorbu NADPH (redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát) v cytoplazmě, který je důležitý pro regeneraci glutathionu, důležitého buněčného antioxidantu. Mutace genu pro IDH1 se častěji vyskytuje u mladších pacientů s glioblastomy, se současnou mutací genu p53, u low-grade gliomů a u sekundárních glioblastomů. Dle práce Sansona a kol. byla potvrzena silná korelace mezi přítomností mutací genu IDH1 a diferenciací gliomu (77 % u gliomů G2, 55 % u gliomů G3, ale jen 6 % mutací u gliomů G4 glioblastomů). Dle statistické analýzy 21
na podskupině 183 pacientů s glioblastomy autoři prokázali signifikantní rozdíl v OS (27,4 měsíce s mutací IDH1 vs. 14,0 měsíce bez mutace, P < 0,01) a svoje zjištění uzavírají tím, že mutace genu pro IDH1 je silný nezávislý příznivý prognostický faktor u léčených gliomů [70]. Závěry však budou předmětem dalších klinických studií. Nevýhodou se zdá být nízká četnost mutací u glioblastomů (kolem 10 %). Metylace promotoru genu pro MGMT: metylace promotoru genu tohoto reparačního enzymu je dnes považována za nejvýznamnější molekulární prognostický marker u glioblastomů. Tumor supresorový gen pro MGMT se nachází na chromozomu 10q26. Úkolem tohoto DNA reparačního enzymu je odstraňovat alkylační skupiny z O 6 guaninu, významného místa působení alkylačních látek včetně cytostatik jako deriváty nitrosourey nebo temozolomid. V normálních tkáních MGMT působí jako supresor mutací a karcinogeneze. Pokud má buňka nedostatek MGMT, poškozená DNA s navázanými alkylačními skupinami se nemůže opravit a buňka následně podléhá apoptóze. Nádory s vysokou aktivitou MGMT jsou proto nádory chemorezistentní, především vůči cytostatikům s alkylačním účinkem, protože navázané alkylační skupiny jsou záhy pomocí MGMT odstraňovány. Výsledný efekt léčby s temozolomidem tak může záviset na množství aktivní MGMT a na míře inaktivace (metylace) promotorových sekvencí genu pro MGMT. Ke stanovení metylace MGMT genu se nejčastěji používá metoda polymerázové řetězové reakce (PCR). Bohužel, rozdílné výsledky mezi pracovišti při použití této metody zatím brání v rutinním vyšetřování tohoto markeru v klinické praxi a jsou i podnětem pro vývoj nových citlivějších metod, jako např. bisulfitová konverze DNA a HRM (high resolution melting) analýza [71]. Pozitivní vliv metylace MGMT genu na délku PFS i OS u pacientů s glioblastomy, kteří podstoupili léčbu radioterapií a chemoterapií s alkylačními cytostatiky potvrdilo mnoho klinických studií fáze II. Na jejich výsledky pak navázala dosud nejvýznamnější Stuppova studie s adjuvantní konkomitantní chemoradioterapií s temozolomidem z roku 2005. Na podskupině 206 pacientů byla retrospektivně pomocí PCR stanovena hladina metylované MGMT a analyzovány léčebné výsledky. Přítomnost metylace MGMT genu byla zjištěna u cca 45 % pacientů. Ve skupině pacientů s metylací MGMT byl medián OS 18,2 vs 12,2 měsíce bez metylace a to bez ohledu na podanou léčbu (P < 0,001) [72]. Ještě výraznější rozdíl byl zaznamenám v rameni s konkomitantní chemoradioterapií s temozolomidem, medián OS u pacientů s metylací byl 23,4 vs. 12,6 měsíce bez metylace. Naopak se samotnou pooperační radioterapií nebyly rozdíly tak evidentní, medián OS u pacientů s metylací 22
byl 15,3 vs. 11,8 měsíce bez metylace, viz Tabulka 2. Metylace MGMT je proto většinou odborné veřejnosti považována i za pozitivní prediktivní faktor účinnosti systémové terapie s temozolomidem. Rovněž další práce potvrzují, že inaktivace MGMT genu díky metylaci jeho promotoru vede k prodloužení přežití a zvýšení účinku léčby s temozolomidem a BCNU u pacientů s maligními gliomy [73,74]. O významu metylace MGMT, jako faktoru, který přispívá k vyšší chemosenzitivitě glioblastomu svědčí i vyšší četnost metylací MGMT u pacientů s pseudoprogresí, která je projevem vyšší účinnosti léčby (66 vs 34 % bez metylace) [75]. Vyšší procento metylací MGMT je popisováno i u dlouhodobě žijících pacientů po prodělané léčbě s radioterapií a chemoterapií (70-80 vs 40-50 % u nově diagnostikovaných glioblastomů) [76,77]. Stav metylace promotoru genu pro MGMT je dnes považován za tak zásadní prognostický faktor, že je automaticky vyšetřován v rámci všech významných klinických studií u glioblastomů, včetně studií s cílenou léčbou. Byla publikována řada prací s inhibitory MGMT jako O 6 - benzylguanin nebo O 6 - (4-bromothenyl)guanin, jejichž úkolem bylo eliminovat aktivní MGMT a tím zvýšit účinnost použité chemoterapie. Přípravky se však v praxi zatím neuplatnily, protože významně zvyšují toxicitu chemoterapie také u zdravých buněk [78]. MikroRNA: tvoří velkou skupinu krátkých nekódujících RNA (18-25 nukleotidů), které posttranskripčně regulují genovou expresi. Mají schopnost inhibovat translaci onkogenů a nádorových supresorů a tím se podílet na regulaci buněčné proliferace, diferenciace, apoptózy a dalších pochodů [79-81]. Pro glioblastomy bylo zatím identifikováno několik významných mikrorna (mirna), ale výzkum v této oblasti je natolik intenzivní, že další rychle přibývají. MiRNA nepodléhají degradaci ve formalinem fixovaném materiálu a proto umožňují rozsáhlý retrospektivní výzkum na tkáních z parafinových bloků. mir-21 se podílí na negativní regulaci apoptózy. Při její zvýšené expresi dochází k inhibici genů zodpovědných za apoptózu (aktivovaných cestou proteinu P53 při poškození DNA např. cytostatickou léčbou) a tím dochází k inhibici apoptózy [82]. MiR-21 může také přispívat k vyšší invazivitě gliomů tím, že potlačuje produkci inhibitorů matrix metalloproteináz, což jsou důležité enzymy k degradaci extracelulární matrix [83]. mir-221/222 mají také funkci onkogenů. Potlačují produkci proteinu P27, který inhibuje cyklin dependentní kinázy (CDK) [84]. 23
mir-181a/181b mají funkci nádorových supresorů. Inhibují růst a invazi nádorových buněk, podporují apoptózu [85]. mir-128a má funkci nádorového supresoru. Potlačuje proliferaci nádorových buněk cestou inhibice transkripčního faktoru E2F3a [86]. mir-195/196a/b mají pravděpodobně funkci onkogenů. Vyšší hladiny bývají spojeny s rezistencí k temozolomidu a kratším přežitím [87,88]. Výše uvedené poznatky jsou základem pro klinický výzkum. Proběhla řada klinických studií jejichž cílem bylo zjistit, jak tyto genetické odchylky a molekulární markery korelují s klinickými parametry, použitou léčbou, její účinností a křivkami přežití. Zásadním problémem je skutečnost, že i přes obrovské množství informací, které dnes máme, jsou výsledky těchto studií zatím nejednoznačné a slibně se jeví jen několik z nich. Příkladem může být velká prospektivní klinická studie Wellera a kol. na souboru 301 pacientů s glioblastomy z roku 2009. Jednalo se o pacienty, kteří po operaci podstoupili standardní radioterapii, eventuelně i v konkomitanci s chemoterapií (temozolomid). Na tomto souboru byla studována mutace genu p53, amplifikace genu pro EGFR, CDK4, MDM2, delece genu pro CDKN2A, delece 1p, 9p, 10q a 19q a kodelece 1p/19q, stav metylace promotoru genu pro MGMT a mutace genu pro IDH1. Dle multivariační analýzy jen mladší věk (< 60 let), KPS 70, metylace MGMT genu a podání konkomitantní chemoradioterapie s temozolomidem byly nezávislými příznivými prognostickými faktory pro OS. Mutace genu pro IDH1 měla signifikantní vliv jen na delší PFS a pouze trend k prodloužení OS. U ostatních 10 genetických a molekulárních faktorů nebyl prokázán vliv ani na PFS, ani na OS [89]. Podobné výsledky, kdy se nepodařilo objevit silné prognostické faktory pro přežití a prediktory léčebné odpovědi ve vztahu k molekulárním a genovým markerům můžeme nalézt i v dalších studiích [90-92]. 24
2.6.3. Prognostické faktory ve vztahu k léčbě K příznivým prognostickým faktorům související s léčbou patří: Chirurgický výkon s maximální radikalitou bez poškození funkčně důležitých částí mozku [39]. Aplikace konkomitantní radioterapie a chemoterapie s temozolomidem, který dále pokračuje v adjuvantní léčbě [38-41,89]. Léčba recidivy/progrese onemocnění (vybrané případy) [53-60]. Komentáře k jednotlivým léčebným metodám jsou uvedeny výše viz kapitola 2.4. a 2.5. Mezinárodní pracovní skupina zabývající se léčbou high-grade gliomů pod záštitou RTOG (Radiation Therapy Oncology Group) vytvořila na základě klinických, histologických a terapeutických prognostických faktorů (věk, KPS, neurologický deficit, histologická diagnóza, délka trvání příznaků, rozsah resekce a aplikovaná dávka radioterapie) tzv. RPA klasifikaci (recursive partitioning analysis), dle které je pacient zařazen do jedné ze 6 prognostických tříd [93,94]. Pacienti ve RPA třídě I mají nejlepší prognózu, pacienti v RPA VI nejhorší. Pro glioblastomy je vyčleněna RPA třída III-VI. Čím je pacient v prognosticky horší skupině, tím má i menší benefit z konkomitantní chemoradioterapie vs samotné radioterapie a také pravděpodobnost kratšího OS (RPA III 17,9 měsíců, RPA IV 11,1 měsíců, RPA V 8,9 měsíců, RPA VI 4,6 měsíců), viz Tabulka 4. Signifikantní benefit z konkomitantní léčby u glioblastomu lze očekávat u pacientů v RPA třídě III a IV, u RPA V je vliv přidané chemoterapie na prodloužení délky života již hraniční. Ve Stuppově studii (EORTC 26981/22981) byla pro glioblastomy provedena modifikace RPA klasifikace. Karnofského performance status byl nahrazen PS dle WHO (PS 0-2) a neurologický deficit byl podrobněji hodnocen pomocí škály MMSE, viz Tabulka 5 [95]. 25
Tabulka 4: RPA klasifikace maligních gliomů dle RTOG [94]. RTOG Charakteristika pacientů s glioblastomem Medián přežití třída (v měsících) III věk < 50 let, KPS 90-100 17,9 IV věk < 50 let, KPS < 90 11,1 věk 50 let, resekce, bez neurologického deficitu V věk 50 let, KPS 70-100, resekce s neurologickým deficitem nebo jen biopsie následovaná RT minimálně 54,4 Gy věk 50 let, KPS < 70, bez neurologického deficitu 8,9 VI věk 50 let, KPS 70-100, jen biopsie, RT < 54,4 Gy 4,6 věk 50 let, KPS < 70, neurologický deficit Zkratky: RT radioterapie, KPS Karnofského performance status, Gy Gray, RTOG Radiation Therapy Oncology Group Tabulka 5: Modifikace RPA klasifikace pro pacienty s glioblastomy podstupující chemoradioterapii s temozolomidem dle EORTC/NCIC [95]. EORTC Charakteristika pacientů s glioblastomem Medián přežití třída (v měsících) III věk < 50let, WHO PS 0 17 IV věk < 50let, WHO PS 1-2 15 věk 50let, totální/velká resekce, MMSE 27 V věk 50let, jen biopsie, MMSE < 27 10 Zkratky: PS - performance status, MMSE - Mini-Mental Status Examination, EORTC - European Organisation for Research and Treatment of Cancer Na základě hlavních prognostických faktorů, které vyplynuly z četných subanalýz Stuppovy studie jako typ podané léčby, věk, rozsah resekce, PS, MMSE a stav metylace MGMT genu byly sestrojeny nomogramy, které nám mohou pomoci odhadnout prognózu pacienta s nově léčeným glioblastomem (pravděpodobnost dvouletého a celkového přežití) [96]. Nomogramy jsou volně přístupné: http://www.eortc.be/tools/gbmcalculator. 26
2.7. Laboratorní metody ke stanovení metylace MGMT genu a mirna 2.7.1. Bisulfitová konverze DNA a HRM analýza Ke stanovení metylace promotoru genu pro MGMT se nejčastěji užívá metoda PCR. Problémy se standardizací postupu a rozdílnost výsledků mezi pracovišti vedou k vývoji nových metod. Jednou z nich je i bisulfitová konverze DNA s následnou analýzou křivek tání s vysokým rozlišením (HRM high-resolution melting). Bisulfitová konverze DNA Metoda je založena na rozdílné reakci mezi bisulfitem sodným s nemetylovaným a metylovaným cytosinem. Zjednodušeně řečeno, v případě nemetylovaného cytosinu dochází po přidání bisulfitu a následné desulfonaci ke konverzi cytosinu na uracil. Metylovaný cytosin na rozdíl od nemetylovaného této přeměně nepodléhá, tedy zůstává dále cytosinem, viz Obrázek 7 [97]. Reakce probíhá na jednovláknové DNA (po předchozí denaturaci dvouvláknové DNA). Poznámka nukleotidy v modré barvě jsou původně nemetylované cytosiny, které podlehly bisulfitové konverzi na uracily; nukleotidy v červené barvě jsou metylované cytosiny, které konverzi nepodléhají Obrázek 7: Bisulfitová konverze nemetylovaného cytosinu na uracil, princip metody [97]. HRM analýza křivek tání DNA Po bisulfitové konverzi je DNA amplifikována pomocí PCR s interkalací fluorescenčního barviva. Tím je připravena k následné HRM analýze. Při postupném zahřívání dochází k denaturaci DNA (rozvolnění dvoušroubovice) a tím uvolnění fluorescenčního barviva, což vede k poklesu intenzity fluorescence, která je snímána přístrojem pro HRM [97]. Výsledkem je křivka tání. Křivky tání jednotlivých vzorků 27
DNA se liší podle míry metylace. DNA s původně nemetylovaným cytosinem, který podlehl bisulfitové konverzi na uracil, má nižší bod tání než DNA s metylovaným cytosinem. Při postupném zahřívání tak dochází k dřívější denaturaci DNA s uracilem s uvolněním zářiče a následně k rychlejšímu poklesu intenzity fluorescence, viz křivky tání (Obrázek 8). Na základě porovnání křivek zkoumaných DNA s křivkou referenční DNA pak můžeme stanovit míru jejich metylace. Obrázek 8: Normalizované křivky tání promotoru genu pro MGMT. 2.7.2. Reverzní transkripce a kvantitativní PCR v reálném čase Ke stanovení mirna je dnes využívána TaqMan technologie. U této metody dochází k propojení reverzní transkripce (RT) a kvantitativní PCR v reálném čase (real-time PCR). MiRNA-specifická reverzní transkripce Reverzní transkripce každé mirna probíhá za použití specifického stem-loop RT primeru s vlásenkovou strukturou, jehož úkolem je zajistit, aby produkt reverzní transkripce (cdna) byl dostatečně dlouhý a mohl sloužit jako templát pro kvantitativní PCR (Obrázek 9) [98]. 28
Obrázek 9: Reverzní transkripce a polymerázová řetězová reakce v reálném čase (Applied Biosystems) [98]. Stanovení exprese vybraných mirna pomocí kvantitativní PCR v reálném čase Metoda real-time PCR je založena na principu klasické PCR, ale amplifikovaná DNA je měřena po každém cyklu. Metoda využívá speciálně připravených TaqMan-MGB (minor groove binder) sond. Na 5 konci každé sondy je navázán zářič (reporter R), na 3 konci jeho zhášeč (quencher Q). U sondy v klidovém stavu je záření pohlcováno zhášečem. Na konci každé syntetické fáze PCR dochází k exonukleázovému rozštěpení TaqMan-MBG sondy TaqMan polymerázou, čímž je narušeno pohlcování záření zhášečem a fluorescenční záření je pak možné zaznamenat analyzátorem (Obrázek 10). S každým cyklem tak narůstá intenzita záření. Z kalibrační křivky paralelně amplifikovaného vnitřního standardu, pak můžeme stanovit koncentraci mirna studovaného genu [98]. Obrázek 10: Polymerázová řetězová reakce, rozštěpení TaqMan-MBG sondy TaqMan polymerázou s následným uvolněním fluorescenčního záření [98]. 29
3. CÍLE PRÁCE Prvním cílem mé disertační práce bylo ověřit známé prognostické a potenciální prediktivní klinické faktory a molekulární markery. Druhým cílem bylo pokusit se pomocí analýzy vybraných mirna definovat nové biomarkery ve vztahu k prognóze pacientů a predikci léčebné odpovědi. 3.1. Studie A klinická část Charakteristika a vliv potenciálních klinických prognostických faktorů a použité léčby na základní parametry přežití u pacientů s glioblastomy. Zhodnocení vlivu klinických faktorů a použité léčby na základní parametry přežití. Zhodnocení toxicity léčby. 3.2. Studie B laboratorní část Stanovení míry metylace promotoru genu pro reparační enzym MGMT a analýza exprese vybraných mirna a jejich korelace s klinickými parametry a léčebnými výsledky u pacientů s glioblastomy. Stanovení míry metylace promotoru genu pro MGMT a analýza exprese vybraných mirna v nádorové tkáni. Posouzení vzájemných vztahů mezi metylací promotoru genu pro MGMT, vybranými mirna v nádorové tkáni a přežitím pacientů s glioblastomy. Pomocí biostatistických metod pak stanovení prognostického a prediktivního potenciálu zkoumaných biomarkerů. 30