HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20 Ref. 3007 2015/06
POUŽITÍ KITU HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20 kit je určen ke stanovení profilů lipoproteinů a ke skríningu Lp(a) v lidském séru. Analýza je provedena elektroforézou na agarózových gelech o ph 7.5. Separované lipoproteiny jsou obarveny roztokem Sudanové černi. Přebytek barvičky je odstraněn roztokem alkoholu. Vyhodnocení je buď vizuální nebo denzitometrické (relativní kvantifikace jednotlivých zón). Každý agarózový gel HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20 je určen k analýze 7 mi vzorků. Určeno pro diagnostické použití in vitro. PRINCIP TESTU Lipoproteiny jsou cirkulující komplexy sestávající z lipidů a proteinů. Jejich klasifikace je založena na vlastnostech, jež umožňují stanovení následujícími separačními technikami : utracentrifugace (využívá rozdílných hustot), zónová elektroforéza (el. náboj), polyakrylamidová elektroforéza (velikost molekuly). Klasifikace hyperlipemie je založena na hodnocení zónové elektroforézy. Na agarózových gelech se lipoproteiny dělí na následující frakce : chylomikrony : velké molekuly s vysokým obsahem triglyceridů, přítomny v plazmě jako malé částice způsobují opalescenci séra a zůstávají v místě aplikace, beta-lipoproteiny (LDL-Low Density Lipoproteins) migrují v pozici beta globulinů, pre-beta lipoproteiny (VLDL-Very Low Density Lipoproteins) - mají vyšší mol. hmotnost, nižší denzitu a jsou rychlejší než LDL - migrují v pozici beta globulinů, rychlé pre-beta lipoproteiny (pokud jsou přítomny) jsou tvořeny Lp(a), které jsou velikostí a složením LDL. Pokud jsou přítomny v dostatečně vysoké koncentraci, migrují mezi VLDL a HDL, alfa lipoproteiny - HDL (High Density Lipoproteins) - nejrychlejší frakce. Migrují v pozici alfa-2 globulinů. Elektroforéza lipoproteinů je běžnou technikou rutinně používanou klinickými laboratořemi ke stanovení abnormalit lipoproteinů a rizikových faktorů ICHS v séru. Rozlišení lipoproteinů dle jejich elektroforetické pohyblivosti je základem Fredricksonovy klasifikace, dle níž lze léčit poruchy metabolizmu lipoproteinů dietou a medikamentózně. Lp(a) je dnes považován za další nezávislý rizikový faktor vzniku aterosklerózy. Ukazuje se i přesun signifikantních rizik na přítomnost dalších rizikových faktorů, zejména zvýšeného LDL. Obě vlastnosti, aterogení i anti-fibrinolytická, jsou atributem Lp(a). Studie ukazují, že populace s aterosklerotickými kardiovaskulárními onemocněními má obvykle jednu nebo více z následujících lipoproteinových abnormalit : (1) zvýšený LDL cholesterol, (2) snížený HDL cholesterol, (3) zvýšený IDL a přítomnost chylomikronů, (4) vysokou hladinu Lp(a). Proto scrínink Lp(a) a stanovení hladiny lipoproteinů jsou základem pro stanovení rizika aterosklerózy. Elekroforéza metodou HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20 má své výhody : umožňuje současné stanovení lipoproteinového profilu a detekci rychlé prebeta nebo Lp(a) frakce. ČINIDLA A MATERIÁLY DODÁVANÉ V SADĚ HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20 VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKA KAT. Č. 3007 Agarózové gely (připraveno k použití) 10 gelů LIPO + Lp(a) pufr (zásobní roztok) 3 lahv. po 75 ml Sudanová čerň (zásobní roztok) 1 lahv. 20 ml Promývací roztok (zásobní roztok) 1 lahv. 80 ml Aplikátory (7 zubů) (připraveno k použití) 1 bal. 10 ks Tenké filtrační papíry 1 bal. 10 ks PRO OPTIMÁLNÍ VÝSLEDKY : Všechny reagenty ze stejné sady musí být vždy používány společně a podle pokynů v příbalovém letáku. PROSÍME, ČTĚTE PEČLIVĚ PŘÍBALOVÝ LETÁK. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 7.5 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu lipoproteinů. - 93 - SEBIA NÁVOD - Czech
Skladování, stabilita a známky poškození Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech - šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C) nebo v chladničce (2-8 C). Zamezit prudkým změnám teploty - neskladovat v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby expirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. HYDRAGEL LIPO + Lp(a) PUFR Každá lahvička zásobního tlumivého roztoku se může zředit destilovanou nebo deionizovanou vodou až na 1 litr. Pracovní roztok po naředění obsahuje : tlumicí roztok s ph 8.2 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Elektroforetický pufr. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Pufr lze skladovat při pokojové teplotě nebo v ledničce. Je stabilní několik let, při nejmenším do data expirace vyznačeného na balení či lahvičkách. Zředěný pufr je stabilní po dobu 1 roku při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Při zjištění zákalu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace, je nutno pufr vylít. 3. SUDANOVÁ ČERŇ Připravte pracovní roztok barviva Sudan Black alespoň 30 minut před použitím. Za jemného míchání přidejte přesný objem jednotlivých složek v následujícím pořadí : Čistý ethanol (96 %), 80 ml ; barvivo Sudan Black, zásobní roztok, 1 ml. Počkejte, dokud se Sudan Black úplně nerozpustí, a pak přidejte 70 ml destilované nebo deionizované vody. nebo Čistý isopropanol (100 %), 57 ml ; barvivo Sudan Black, zásobní roztok, 1 ml. Počkejte, dokud se Sudan Black úplně nerozpustí, a pak přidejte 93 ml destilované nebo deionizované vody. Míchejte alespoň 30 minut. Nenechávejte v blízkosti tepelného zdroje. Na každé barvení připravujte nový roztok. DŮLEŽITÉ : jiného alkoholu nebo alkoholu denaturovaného může vést k atypickým výsledkům. Při použití čistého alkoholu jiné koncentrace je nutno upravit objemy alkoholu i vody. K barvení gelů s rozdělenými lipoproteiny po elektroforéze. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Zásobní odbarvovací roztok skladujte při pokojové teplotě. Je stabilní do data expirace vyznačeného na obalu sady nebo na štítku lahvičky barvicího roztoku. Pracovní roztok vydrží 12 hodin v uzavřeném zásobníku. POZNÁMKA : Zásobní roztok barvicího roztoku může gelovatět. Snadno se znovu rozpustí při pokojové teplotě vyšší než 15 C bez negativního vlivu na jeho funkci. Zamíchejte před použitím. 4. PROMÝVACÍ ROZTOK Lahvička zásobního promývacího roztoku může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 5 litrů. Praktické je zředit pouze 16 ml zásobního roztoku do 1 litru. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok ph 8.7 ± 0.5. Roztok slouží k oplachu gelů po odbarvení. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Skladování obou roztoků při pokojové teplotě nebo v chladničce v dobře uzavřených nádobách. Stabilita - do doby expirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku, který je obvykle známkou mikrobiální kontaminace. 5. APLIKÁTORY Jednorázové aplikátory k nanesení vzorků - připraveny k použití. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. 6. TENKÉ FILTRAČNÍ PAPÍRY Proužky tenkého filtračního papíru, na jedno použití. Jsou určeny k odsání přebytečné tekutiny z povrchu gelu před aplikací vzorků. Skladování Skladujte na suchém místě při pokojové teplotě nebo v chladničce. - 94 -
POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. ODBARVOVACÍ ROZTOK Nejméně 15 minut před použitím připravte 150 ml roztoku obsahujícího (obj. / obj.) 45 % čistého etanol a 55 % destilované nebo deionizované vody nebo, 30 % čistého isopropanolu a 70 % destilované a deionizované vody. DŮLEŽITÉ : jiného alkoholu nebo etanolu denaturovaného může vést k atypickým výsledkům. Při použití čistého alkoholu jiné koncentrace je nutno upravit objemy alkoholu i vody. Roztok použijte k odstranění přebytku barvy z pozadí gelů. Skladování, stabilita, známky znehodnocení roztoku Skladovat v dobře utěsněných láhvích při pokojové teplotě, vydrží jeden měsíc. 2. FLUIDIL Fluidil (SEBIA, kat. č. 4587,1 lahv. 5 ml) připraveno k použití. Používá se k ředění velmi viskózních nebo zakalených vzorků sér, t.j. obsahujících kryoglobulin nebo kryogel. Skladování, stabilita a známky zhoršení kvality Při teplotě místnosti. Stabilní do doby expirace vyznačené na štítku. Nesmí obsahovat sraženiny. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. ZAŘÍZENÍ NEZBYTNÁ K PROVEDENÍ TESTU 1. Zdroj proudu : MG 300 SEBIA, PN 1302 or MG 500 SEBIA, kat. č. 1303. 2. HYDRAGEL K20 APPLICATOR SEBIA, kat. č. 1409, včetně nosiče aplikátorů HYDRAGEL K20. 3. Vlhká komůrka kat. č. 1270. 4. Elektroforetická komora, K20 SEBIA, kat. č. 1400. 5. Nádobky a držáky gelů pro manipulaci s nimi HYDRAGEL Accessory Kit SEBIA, kat. č. 1420. 6. Pipety 10 µl, 200 µl a 1000 µl. 7. Sušička inkubátor, IS 80 SEBIA, kat. č. 1430. 8. Denzitometr / skener pro skenování gelových ploten 82 x 51 mm : software pro plochý skener HYRYS SEBIA, DVSE SEBIA nebo PHORESIS. Pro postupy činnosti a kalibrace viz pokyny výrobce. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Pro analýzu se doporučuje používat čerstvé vzorky séra. Doporučuje se odebírat vzorky od pacientů, kteří jsou nejméně 12 hodin nalačno. Odběr musí být v souladu se zavedenými postupy používanými pro testování v klinických laboratořích. Vzorky uložte do chladničky (2 až 8 C) co nejdříve po odběru maximálně na 3 dny. Vzorky nelze mrazit. Nelze použít vzorky odebrané do heparinu. Skladování je příčinou snížení mobility pre-beta lipoproteinové frakce a tím podhodnocení odpovídající frakce. Rychlé pre-beta (nebo Lp(a)) lipoproteiny nejsou skladováním postiženy. vzorků Používejte neředěná séra. Při skladování v ledničce nebo po zmrazení, se některá séra mohou stát viskózními nebo se vyvine zákal (zvláště séra obsahující kryoglobulin nebo kryogel) - taková séra mohou špatně difundovat zuby aplikátoru. V tomto případě přidejte 25 µl Fluidilu k 75 µl séra a 15 sekund promíchejte na Vortexu. Potom pokračujte standardním postupem. POZNÁMKA : Odběrové zkumavky pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. - 95 -
PRACOVNÍ POSTUP I. MIGRACE 1. Umístěte HYDRAGEL K20 aplikátorový nosič na rovnou plochu (viz Obr. 1) a zvedněte část s očíslovanými zuby. 2. Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody na dolní třetinu rámečku vyznačené na nosiči aplikátoru. 3. Z obalu opatrně vyjměte agarózovou plotnu. 4. Gelovou plotnu rychle osušte tenkým filtračním papírem tak, že jej z jedné strany narolujete, aby přilnul k celé ploše a rychle odstraňte. UPOZORNĚNÍ : Neponechávejte tento filtrační papír delší dobu na povrchu hrozí dehydratace gelu! 5. Opřete plotnu okrajem o zarážku v dolní části vyznačeného rámečku - gelem k sobě (viz Obr. 2). 6. Nyní gel ohněte a pokládejte tak, aby se voda rovnoměrně rozprostřela pod celým gelem bez tvorby vzduchových bublin. Gel musí být v rámečku zarovnán (viz Obr. 2). 7. Snižte nosič aplikátoru očíslovanými zoubky dolů do střední polohy se západkou v horní poloze. 8. Umístěte jeden aplikátor na rovnou plochu s čísly jamek v pravé horní pozici (Obr. 3). 9. Do jamek aplikátoru pipetujte 10 µl vzorku. Vzorky je nutno napipetovat do aplikátoru v průběhu 2 minut. - aplikátor použijte okamžitě, - pro delší uchování (až 8 hodin) umístěte aplikátor do vlhké komory zoubky nahoru, uchopte za plastikovou část chránící zoubky a celou komoru umístěte do chladničky. Podrobnosti najdete v návodu pro vlhkou komoru. 10. Odlomte ochranný rámeček zoubků aplikátoru. 11. Umístěte aplikátor do pozice č. 4 na nosiči. DŮLEŽITÉ : Čísla natištěná na aplikátoru musí směřovat k obsluze (viz Obr. 4). 12. Nyní snižte nosič tak, aby se aplikátor dostal do kontaktu s povrchem gelu. NESNIŽOVAT PRUDCE! 13. Po 7-mi minutách a 30 sekundách aplikátor uvolněte, vyjměte a vyhoďte. 14. Gelovou plotnu vložte do migrační elektroforetické komory dle polarity vyznačené na gelu - dolní částí gelu na katodickou stranu. Při použití komory SEBIA K20 vložte HYDRAGEL ovou plotnu do zubů můstku gelem dolů a ten pak ponořte do pufru. Okraje plotny budou ponořeny asi 1 cm. Podrobnosti najdete v návodu pro migrační komoru K20. 15. Připojte dělící komoru ke zdroji proudu. PODMÍNKY DĚLENÍ Objem pufru ke každé elektrodě Celkový objem pufru Čas dělení Konstantní napětí Počáteční proud (na gel) SEBIA K20 150 ml 300 ml 90 minut 50 V 11 ± 2 ma 16. Po migraci odpojte komoru a vyjměte gelovou plotnu. POZNÁMKA : Během elektroforézy lze pozorovat na anodě lehké usazeniny solí. Po každé elektroforéze je nutné elektrody očistit. 17. Osušte gel horkým vzduchem o teplotě 80 C, v IS 80 po dobu nejméně 45 min. DŮLEŽITÉ : Gel musí být úplně suchý. II. BARVENÍ A ODBARVOVÁNÍ 1. Umístěte plotnu do držáku gelů (součást SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kitu). 2. Po usušení a ochlazení ponořte usušený gel do barvícího roztoku přesně na 15 minut. 3. Odbarvěte přesně po dobu 5 minut v odbarvovacím roztoku. III. PROMYTÍ A SUŠENÍ 1. Umístěte plotnu do držáku gelů (součást SEBIA HYDRAGEL K20 Accessory Kitu). 2. Ponořte gel do promývacího roztoku na 1 minutu. 3. Rychle opláchněte gel destilovanou nebo deionizovanou vodou. 4. Odsajte přebytečnou tekutinu z povrchu gelu tenkým papírem a osušte gel při 80 C teplého vzduchu. V případě potřeby očistěte zadní stranu gelu buničinou nasáklou roztokem 70 % alkoholu. IV. SKENOVÁNÍ Nasnímejte denzitometrem / skenerem výběrem vhodného programu snímání. KONTROLA KVALITY Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolní sérum (Control Serum SEBIA, kat. č. 4785). VÝSLEDKY Hodnoty Denzitometrické skenování nabarvených polí elektroforegramů (procentuálních hodnot) relativních koncentrací každé frakce. Rozsahy Referenční hodnoty (průměr ± 2 SD) hlavních elektroforetických zón, byly stanoveny pro 200 zdravých mužů a žen metodou HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20 : - 96 -
Beta lipoproteiny (LDL) : 38.6-69.4 % Pre-beta lipoproteiny (VLDL) : 4.4-23.1 % Alfa lipoproteiny (HDL) : 22.3-53.3 % Rychlé pre-beta lipoproteiny Lp(a) lze vidět i na lipidogramech zdravých osob. Je doporučeno, aby si každá laboratoř stanovila své vlastní referenční hodnoty. Pořadí migrace Dle složení vzorku lze pozorovat jeden ze dvou základních typů rozdělení : HDL VLDL LDL Aplikační bod HDL Lp(a) VLDL LDL Aplikační bod Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Vizuální hodnocení srovnáním vyšetřovaného vzorku s normální kontrolou. Denzitometrie - relativní procenta jednotlivých lipoproteinových frakcí. Kvalitativní (přítomnost abnormálních frakcí nebo nepřítomnost normálních frakcí) i semikvantitatívní (relativní zvýšení či snížení frakcí) abnormality vyžadují další analýzu. Další pomocí při interpretaci lipidogramů je Fredricksonova klasifikace. Fredricksonova klasifikace HYPERLIPEMIA TİPİ TYP I TYP II a TYP II b TYP III TYP IV TYP V CELKOVÝ CHOLESTEROL g/l mm/l TRIGLYCERIDY g/l mm/l 2-4 5.2-10.4 30-70 34-79 3-10 7.8-26 < 1.6 < 2 2.8-3.5 7.3-9.1 2-5 2.3-5.6 3-5 7.8-13 2-9 2.3-10.2 < 2.7 < 7 2-10 2.3-11.3 VZHLED SÉRA mléčné čiré opal. opal. zákal mléčné CHYLOMIKRA ++++ 0 0 0 0 ++++ LDL - - - +++ ++ ++ çiftli - - - VLDL normal až - - - normal ++ ++ +++ ++ HDL - - - normal až - normal až - - - - 5 13 30 34 Lp(a) skríning Frakce mezi alfa a pre-beta zónami odpovídá Lp(a). Pohyblivost se může lišit v závislosti na fenotypu. Minimální hladina detekce je 0.3 g/l. Pokud se frakce Lp(a) na lipidogramu vyskytne, je vhodná její kvantifikace nefelometricky nebo imunodifuzí na HYDRAGELu Lp(a) SEBIA, kat. č. 4057. Zvláštní případy U typů IV a V dle Fredricksona, kde pre-beta frakce (VLDL) je vysoká a posunutá anodicky, může skrývat Lp(a). Doporučuje se nechat sérum odstát 24-48 hod. při pokojové teplotě (což sníží mobilitu VLDL) a opakovat elektroforézu, příp. vyšetřit Lp(a) kvantitativně. LP X - zůstává na katodické straně, chylomikra nejsou přítomna - nachází se v ikterických sérech v případě cholestázy nebo biliárního onemocnění. Interference a omezení Nepoužívat vzorky odebrané do heparinu a mražené vzorky. Skladování snižuje mobilitu VLDL, může dojít k podhodnocení. Lp(a) není skladováním ovlivněno. 4 mm před zónou alfa migruje albumin, který se barví Sudanovou černí - nesmí být zahrnut do vyhodnocení. Difúzní stopa před alfa-liproteinovou frakcí, vyskytující se u některých sér, se do vyhodnocení musí zahrnout. Metoda je semikvantitativní, zjištěné změny vyžadují další analýzu. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy sady reagentů a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA a obaly pro přepravu biologických vzorků a čištění přístrojů jsou k dispozici na DVD s "NÁVODY A BEZPEČNOSTNÍMI DATOVÝMI LISTY". - 97 -
HODNOTY Denzitometr HYRYS fy SEBIA byl použit pro denzitometrická hodnocení. Všechny elektroforeograby byly interpretovány taktéž vituálně. Reprodukovatelnost Ve všech studiích reprodukovatelnosti, byly nejdříve naskenované elektroforeogramy a poté zapsána procentuální hodnota relativní koncentrace každé lipoproteinové frakce. Průměry, SD a CV byly kalkulovány s ohledem na analyzované parametery. Po vizuální analýze elektroforeogramů nebyly pozorované žádné rozdíly mezi opakováními. Výsledky testů indikují velice dobrou reprodukovatelnost. V tabulkách níže jsou uvedeny reprezentativní příklady. Reprodukovatelnost na gelu Každý ze tři patologických vzorků s Lp(a) frakcí byl podroben analýze metodou HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20. Každý vzorek byl testován na všech 7-mi drahách gelu dvou různých šarží. Tabulka ukazuje výsledky na gelu (jeden gel / šarže) pro všechny tři vzorky. FRAKCE HDL (%) Lp(a) (%) VLDL (%) LDL (%) PRŮMĚR 22.6-24.2-28.3 2.2-4.7-8.6 17.8-22.1-6.5 57.4-49.0-56.6 SD 0.5-0.8-0.4 0.1-0.2-0.2 0.6-0.5-0.1 1.0-1.1-0.6 CV % 2.4-3.5-1.3 6.1-4.1-2.2 3.3-2.5-2.0 1.8-2.3-1.0 Reprodukovatelnost mezi gely Sedm (7) různých vzorků bylo podrobeno testům na gelech soupravy HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20 dvou šarží. Každý vzorek byl testován na jedné dráze každého z 10-ti gelů pro obě šarže. Tabulka ukazuje výsledky reprezentativních vzorků. FRAKCE HDL (%) Lp(a) (%) VLDL (%) LDL (%) PRŮMĚR 32.1 4.1 11.8 52.0 SD 0.6 0.2 0.4 0.4 CV % 1.8 4.0 3.7 0.9 Linearita a citlivost Relativní koncentrace lipoproteinových frakcí byly stanoveny následnými ředěními sérového vzorku. Denzitometricky stanovené koncentrace nebyly závislé na ředícím faktoru. Nejvyšší ředění (1 : 4) za předpokladu, že elektroforeogram bylo možné skenovat (obecně stejné jako s nativním vzorkem séra). Koncentrace Lp(a) byla stanovena v sérových vzorcích elektroimunodifuzí. Detekční limit byl okolo 30 mg/dl. Přesnost Denzitometricky stanovené relativní koncentrace jednotlivých lipoproteinových frakcí byly měřeny pomocí normálních a patologických vzorků séra (n = 56) ; 16 vzorků bylo s Lp(a). Všechny vzorky byly podrobeny analýze metodou HYDRAGEL LIPO + Lp(a) K20 a ekvivalentnímu elektroforetickému testu. Po vizuální analýze elektroforeogramů nebyly pozorované žádné rozdíly. Denzitometrické hodnoty byly analyzovány za použití lineární regrese : FRAKCE KORELAČNÍ KOEF. Y - USEK SKLON HDL 0.982 0.255 0.979 Lp(a) 0.976-0.269 0.939 VLDL 0.994-0.477 0.997 LDL 0.984 2.804 0.966 Identifikace rychlé pre-beta frakce jako Lp(a) Imunofixační a imunosubstrakční techniky byly použité pro demonstraci toho, že Lp(a) migruje jako rychlá "pre-beta frakce" a jako jediná detekovatelná komponenta v tomto případě chybí v LDL, VLDL a HDL frakcích. - 98 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Berg K. A new serum type system in man : the Lp(a) system. Acta Pathol. Microbiol. Scand., 1963, 59, 369-382. 2. Buxtorf JC, Dachet C, Jacotot C. Dosage de la lipoprotéine Lp(a): une méthode immuno-turbidimétrique semi-automatique. Pathologie et Biologie, 1991, Vol 39, 4, 328-331. 3. Campos E., Fievet P., Caces E., Fruchart J-C and Fievet C.: A screening method for abnormally high lipoprotein (a) concentrations by agarose lipoprotein electrophoresis. Clin. Chim. Acta., 1994, 230, 43-50. 4. Carlson LA, Ericsson M. Quantitative and qualitative serum lipoprotein analysis. Part 1 : Studies in healthy men and women. Atherosclerosis, 1975, 21, 417-433. 5. Dahlen GH, Guyton JR, Arrar M, Farmer JA, Kautz JA, Gotto AM. Association of level of lipoprotein Lp(a), plasma lipids, and other lipoproteins with coronary artery disease documented by angiography. Circulation, 1986, 74, 758-65. 6. Fredrickson DS and Lees RS. A system for phenotyping hyperlipemias. Circulation, 1965, 31, 321-327. 7. Fruchart JC, Clavey V, Vanhoutte G. Méthodes d exploration biochimique des hyperlipoprotéinémies. Path. Biol., 1983, 31, 4, 235-245. 8. Fruchart JC, Puchois P. Méthodes d analyses des lipoprotéines. Ann. Biol. Clin., 1986, 44, 551-555. 9. Kostner GM, Avogaro P, Cazzolato G, Marth E, Bittolo-Bon G, Quinci GB. Lipoprotein Lp(a) and the risk for myocardial infarction. Atherosclerosis, 1981, 38, 51-61. 10. Morisett JD, Guyton JR, Gaubatz JW, Gotto AM Jr. Lipoprotein Lp(a) : Structure, metabolism and epidemiology. In: Gotto AM Jr, ed. Plasma lipoproteins. Amsterdam: Elsevier Science Publishers, 1987, 129-52. 11. Naito H. The association of serum lipids, lipoproteins, and apolipoproteins with coronary disease, assessed by coronary arteriography. Ann. Ny. Ac. Sc., 1984, 454, 230-238. 12. Papadopoulos NM. Detection of lipoprotein abnormalities by a sensitive electrophoretic test system for the prevention of cardiovascular disease. International Angiology, 1985, vol 4, 2, 249-253. 13. Schreiner PJ, Morrisett JD, Sharett AP, Patsh W, Tyroler HA, Wu K, Heiss G. Lipoprotein (a) as a risk factor for preclinical atherosclerosis. Arterioscler. Thromb., 1993, 13, 826-33. 14. Schreiver H, Assmann G, Sandkamp M, Schulte H. The relationship of lipoprotein (a) (Lp(a) ) to risk factors for coronary disease. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 1984, 22, 591-6. 15. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97. - 126 -
SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 Figure 3 Figure 4 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7-127 -