NÁVOD K POUŽITÍ REF 1116 ANCA Kit (ethanol) 24 stanovení (4 x 6) REF 1140 ANCA Kit (ethanol) 48 stanovení (8 x 6) REF 1140-2 ANCA Kit (ethanol) 96 stanovení (16 x 6) REF 1140-250 ANCA Kit (ethanol) 250 stanovení (25 x 10) REF 1141 ANCA Kit (formalin ) 48 stanovení (8 x 6) REF 1141-250 ANCA Kit (formalin) 250 stanovení (25 x 10) REF 1142 ANCA Kit (ethanol+formalin) 48 stanovení (8 x 6eth + 6form) POUŽITÍ Nepřímý imunofluorescenční test pro detekci a semi-kvantifikaci anti-neutrofilních cytoplazmatických protilátek (ANCA) z lidského séra. ANCA se vyskytují u pacientů s nekrotizující vaskulitidou, a proto slouží jako pomůcka ke klinickým a dalším laboratorním nálezům v diagnostice těchto onemocnění. ÚVOD ANCA se vyskytují u pacientů s Wegenerovou granulomatózou, mikroskopickou polyarteritidou, nekrotizující nebo krescentickou glomerulonefritidou, u dalších vaskulitid a zánětlivých onemocněními střev (primární ulcerativní kolitida). Zbarvení nepřímé imunofluorescence na ethanolem fixovaných neutrofilech může vykazovat různé typy fluorescenčního zbarvení. To zahrnuje: 1. Autoprotilátky proti cytoplasmatickým antigenům neutrofilů dávající difúzní cytoplazmatické zabarvení (canca). 2. Autoprotilátky proti neutrofilním antigenům dávající perinukleární reakci (panca). 3. Běžné protilátky proti nukleárním antigenům (ANA). Význam těchto 2 typů ANCA se liší. canca jsou primárně přítomny u pacientů s Wegenerovou granulomatózou a mikroskopickou polyarteritidou, zatímco panca se vyskytují u různých vaskulárních onemocnění, ulcerativní kolitidy (UC) a primární sklerotizující cholangitidy (PSC). 18% pacientů, u nichž byly panca nalezeny, mají histologický důkaz vaskulitidy, UC nebo PSC. ANCA se vyskytuje u více než 90% pacientů s aktivně generalizovanou Wegenerovou granulomatózou a u 67% pacientů s aktivně omezujícím onemocněním. Incidence ANCA se liší u pacientů s klinickou remisí. Pacienti s aktivní Wegenerovou granulomatózou mohou být občas ANCA negativní. Nicméně v takových případech by mělo opakované testování dát pozitivní ANCA výsledek. Nepřímá imunofluorescenční mikroskopická metoda je považována za zlatý standard pro detekci ANCA. Antigen na PMN je obvykle fixovaný ethanolem. Když je fixovaný ethanolem, mohou být identifikovány 2 typy ANCA barevné reakce: cytoplazmatická (canca) a perinukleární (panca). panca reakce může být potvrzena opětovným testováním na formalinem fixovaných sklíčkách, kde se panca reakce přemění na canca zatímco ANA reakce buď zůstane nukleární nebo se stane negativní při fixaci formalinem. PRINCIP TESTU V nepřímé imunofluorescenční metodě použité v tomto testu jsou pacientská séra inkubována na stěrech z lidských neutrofilů tak, aby se protilátky navázaly k substrátu. Nenavázané protilátky jsou odstraněny promytím. Navázané IgG protilátky jsou detekovány pomocí inkubace substrátu s fluoresceinem značeným, anti-lidským IgG konjugátem. Reakce jsou pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem, vybaveným příslušnými filtry. Přítomnost ANCA se objevuje jako jasně zelená fluorescence některých z cytoplasem s difúzně zrnitým cytoplazmatickým zabarvením (canca) nebo perinukleárním zabarvením (panca). Titr (převrácená hodnota nejvyššího ředění s pozitivní reakcí) je stanoven na základě analýzy sériového ředění. SKLADOVÁNÍ A PŘÍPRAVA Všechny reagencie skladujte při 2-8 C. Všechny reagencie jsou připraveny k použití po vytemperování na laboratorní teplotu. SOUČÁSTI SOUPRAVY REF 1116 ANCA Kit (ethanol) 24 stanovení (4 x 6) REF 1140 ANCA Kit (ethanol) 48 stanovení (8 x 6) REF 1140-2 ANCA Kit (ethanol) 96 stanovení (16 x 6) REF 1140-250 ANCA Kit (ethanol) 250 stanovení (25 x 10) REF 1141 ANCA Kit (formalin ) 48 stanovení (8 x 6) REF 1141-250 ANCA Kit (formalin) 250 stanovení (25 x 10) REF 1142 ANCA Kit (ethanol+formalin) 48 stanovení (8 x 6eth + 6form) Kit obsahuje dostatečné množství k provedení 24, 48, 96, příp. 250 stanovení. 4 x SORB/SLD/6 6-well Human Neutrophil Substrate slides(fixovaných ethanolem)-ref 1116, 8 slides(1140), 16 slides(1140-250) 25 x SORB/SLD/10 10-well Human Neutrophil Substrate slides (fixovaných ethanolem) REF 1140-250 8 x SORB/SLD/6 6-well Human Neutrophil Substrate slides (fixovaných formalinem) REF 1141 25 x SORB/SLD/10 10-well Human Neutrophil Substrate slides (fixovaných formalinem) REF 1141-250 8 x SORB/SLD/6+6 12-well Human Neutrophil Substrate slides (6 fix.ethanolem + 6 fix.formalinem) REF 1142 1 x 0,5 ml CONTROL/+/ canca* canca pozitivní kontrola, obsahuje lidské sérum s BSA (REF 1140, 1142, 1116, 1140-2, 1140-250, 1141) 1 x 0,5 ml CONTROL/+/ panca* panca pozitivní kontrola, obsahuje lidské sérum s BSA (REF 1141, 1142, 1141-250) 1 x 0,5 ml CONTROL/- * negativní kontrola, obsahuje lidské sérum s BSA (REF 1116,1140,1141,1142, 2 vialky (1140-2) 3 vialky (1140-250,1141-250) 1 x 5 ml IgG-CONJ / FITC* Anti-lidský IgG FITC konjugát s Evan s Blue, obsahující BSA. Chráněn přes světlem (REF 1116,1140,1141,1142,1116, 2 vialky (1140-2) 3 vialky (1140-250,1141-250) 1 x 60 ml BUF* Ředící pufr, obsahující BSA (1116, 1140-2, 1140, 1141, 1142), 2 vialky (1140-250, 1141-250) 2 x vialka BUF / WASH Fosfátový pufr (PBS). Rozpustit každou vialku v 1. litru. (REF 1116, 1140-2, 1140, 1141, 1142), 3 vialky (1140-250, 1141-250) 1 x 5 ml MOUNTING/MEDIUM* Montovací medium. Nezmrazujte. (REF 1116, 1140-2, 1140, 1141, 1142), 3 vialky (1140-250, 1141-250) 1 x 12 COVER/SLD Krycí sklíčka (REF 1116, 1140-2, 1140, 1141, 1142), 2x 12 (1140-2), 3x 12 (1140-250, 1141-250) * obsahuje < 0,1% NaN 3 1
Dodatečný materiál, který je možné objednat od firmy Immco REF 6-well Human Neutrophil Substrate slides (fixovaný ethanolem) 2162 16-well Human Neutrophil Substrate slides(fixovaný ethanolem) 2162-16 6-well Human Neutrophil Substrate slides (fixovaný formalinem) 2186 6 + 6-well ethanol+formalin Human Neutrophil Substrate Slide (fixovaný formalinem+ethanolem) 2189 10-well Human Neutrophil Substrate slides (fixovaný ethanolem) 2162-10 10-well Human Neutrophil Substrate slides (fixovaný formalinem) 2186-10 1 x 0.5 ml canca pozitivní kontrola*, obsahující lidské sérum s BSA 2252 1 x 0.5 ml panca pozitivní kontrola*, obsahující lidské sérum s BSA 2240 1 x 1 ml Evan s Blue 2510 POUŽITÉ SYMBOLY číslo šarže katalogové číslo datum expirace teplota skladování čtěte pozorně návod použití pouze in vitro výrobce testů v soupravě POŽADOVANÝ, ALE NEDODÁVANÝ MATERIÁL fluorescenční mikroskop mikropipeta nebo pasteurova pipeta sérologické pipety nádobka na barvení sklíček (např. Coplinova nádoba) malá testovací zkumavka (např. 13 x 75 mm) a stojánek na zkumavky destilovaná nebo deionizovaná voda 1 litrový kontejner promývací láhev absorpční papír inkubátor BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Pouze pro in vitro diagnostiku. Všechny použité lidské komponenty byly testovány na HbsAg, HCV, HIV-1, HIV-2, HTLV-I a byly zjištěny negativní výsledky dle FDA požadovaných testů. Se vzorky nakládejte jako s potenciálně biologicky nebezpečným materiálem. Postupujte dle správné laboratorní praxe při skladování, výdeji a likvidaci tohoto materiálu. UPOZORNĚNÍ - Azid sodný (NaN 3) může reagovat s olovem a mědí za vzniku vysoce výbušných azidů. Při odstraňování kapalin vypláchněte velkým množstvím vody tak, aby se zabránilo nahromadění velkého množství azidů. Azid sodný může být po požití toxický. V případě požití okamžitě kontaktujte vedení laboratoře. Provádějte přesně dle uvedených instrukcí k zajištění platných výsledků. Nepoužívejte nebo nemíchejte reagencie z různých souprav a šarží. Nepoužívejte po uplynutí doby expirace. ODBĚR VZORKU A JEHO SKLADOVÁNÍ Pouze vzorky séra by měly být použity pro tento postup. Silně hemolyzované, lipemické nebo mikrobiologicky kontaminované vzorky mohou ovlivnit výsledky tohoto testu, tudíž nemohou být použity. Vzorky mohou být skladovány při teplotě 2-8 C maximálně 1 týden. Pro delší dobu skladování, muže být sérum zamrazeno při -20 C. Rozmrazené vzorky znovu nezmrazujte. PRACOVNÍ POSTUP Testovací metoda A. Screening 1. Nařeďte každé pacientovo sérum 1:20 s přiloženým ředícím pufrem (50 µl séra + 1 ml pufru). Neřeďte pozitivní ani negativní kontroly. Uložte neředěné sérum pro případné stanovení titru protilátek, pokud bude skríningový test pozitivní. 2. Sáčky obsahující sklíčka nechte temperovat při laboratorní teplotě 10-15 minut.opatrně vyjměte sklíčka, nedotýkejte se přitom subtrátu. 3. Sklíčka označte a umístěte je do inkubátoru na papírový ručník navlhčený vodou, aby se zabránilo vysychání. 4. Kápněte 1 kapku (přibližně 50 µl) negativní kontroly do 1. jamky a 1 kapku pozitivní kontroly do 2. jamky. Vyvarujte se přeplnění jamek. 5. Mikropipetou nebo Pasteurovou pipetou aplikujte 1 kapku (přibližně 50 µl) naředěného pacientova séra do ostatních jamek. Vyvarujte se přeplnění jamek. 6. Sklíčko inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě v inkubační nádobě zakryté víkem. 7. Vyjměte sklíčko z inkubační nádoby, držte jej za okraj a jemně opláchněte asi 10 ml PBS za pomocí pipety nebo opláchněte sklíčko v kádince s PBS. Nepoužívejte promývací láhev. Poté ihned přeneste sklíčko do Coplinovy nádoby a promývejte 10 minut. Proces opakujte u všech zbývajících sklíček. 8. Vyjměte sklíčko z Coplinovy nádoby. Absorpčním papírem vysušte přebytečné PBS z okraje sklíčka. Umístěte sklíčko do inkubační nádoby a ihned aplikujte 1 kapku (přibližně 50 µl) konjugátu do každé jamky. 9. Opakujte postup 7 a 8 na každém sklíčku. 10. Vyměňte víčko na inkubační nádobě. Inkubujte 30 minut při laboratorní teplotě. 11. Vyjměte sklíčko z inkub. nádoby. Držte sklíčko za okraj a ponořte jej do kádinky s PBS pro odstranění přebytečného konjugátu. Umístěte sklíčko 2
do nádobky naplněné PBS na 10 minut. Je-li třeba, přidejte 2-3 kapky Evan s Blue barviva do konečného promývání. Opakujte postup u všech sklíček. POZNÁMKA: Nesprávné promytí může vézt ke zvýšení fluorescence na pozadí. 12. Vyjměte sklíčko z promývačky. Absorpčním papírem vysušte přebytečné PBS z okraje sklíčka. Kvůli zabránění vysušení sklíčka, pokračujte ihned dalším krokem, dokud je sklíčko mokré. 13. Pomocí 3 kapek "Mounting Medium" umístěte krycí sklíčko na podložní sklíčko. Vyvarujte se použití nepřiměřeného tlaku a zabraňte bočnímu pohybu krycího sklíčka. 14. Opakujte postup 12 a 13 na každém sklíčku. 15. Zkoumejte specifickou fluorescenci pod fluorescenčním mikroskopem při zvětšení 200x nebo větším. Sklíčka by měla být odečtena co nejdříve po testu. Nicméně, vzhledem k přítomnosti krycí tekutiny v montovacím mediu, nedochází k žádné významné ztrátě intenzity barvení, jestliže dojde k odečtení do 48 hodin. Sklíčka musí být skladována při teplotě 2-8 C ve tmě. B. Endpoint stanovení (titrace) Pozitivní sérum ve skríningové zkoušce může být dále testováno kroky 5 až 13 k určení titru. Každý proces testování by měl zahrnovat pozitivní a negativní kontroly. Sériové dvojí ředění začíná při 1:20. Převrácená hodnota nejvyššího ředění, vytvářející pozitivní reakci, je titr. Příprava sériového ředění Zkumavky jsou označeny čísly 1-4. Přidejte 1 ml Sample Diluentu do zkumavky č.1 a 0.2 ml do zkumavky č.2-4. Pipetujte 0.05 ml neředěného séra do zkumavky č.1 a důkladně promýchejte. Přeneste 0.2 ml ze zkumavky č.1 do zkumavky č. 2 a důkladně promýchejte. Pokračujte přenesením 0.2 ml z jedné zkumavky do další (vedlejší) po promýchání, tak aby vzniklo ředění, které je znázorněno v následující tabulce. KONTROLA KVALITY V každém testu by měla být zahrnuta pozitivní i negativní kontrola. Negativní kontrola by neměla ukázat žádnou specifickou fluorescenci neutrofilů, zatímco pozitivní kontrola by měla mít 2+ nebo vyšší barevnou intenzitu cytoplasmy neutrofilů s canca pozitivní kontrolou a perinukleární s panca pozitivní kontrolou na ethanolem fixovaných sklíčkách. Na formalinem fixovaných sklíčkách, canca pozitivní kontrola zůstává cytoplazmatická, zatímco reakce panca se stane cytoplasmatickou. Jestliže nejsou získány očekávané výsledky, měl by být proces zopakován. Pokud nadále dochází k selhání kontrol, může to být způsobeno: Zákal - vyřaďte a použijte novou kontrolu Problémy s optickým systémem fluorescenčního mikroskopu - nesprávné nastavení, žárovka za hranicí životnosti atd. Možnost vysušení sklíčka během pracovního postupu INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Výsledky testů na ANCA mohou být interpretovány jako negativní (<20) nebo pozitivní ( 160) nebo pozitivní se specifickým endpoint titrem. Pozorujte specifické difůzní, granulární, cytoplazmatické barvení (canca) nebo perinukleární barvení (panca). Další zjistitelné protilátky jsou ANA protilátky, které mohou někdy napodobovat panca reakce. ANCA nálezy na ethanolem a formalinem fixovaných sklíčkách jsou uvedeny na konci tohoto dokumentu. OMEZENÍ TESTU V některých případech, séra pozitivní na ANCA mohou být buď velmi slabá nebo negativní při úvodním screeningovém ředění díky prozónovému efektu. V takovýchto pochybných případech by měla být séra vyšetřena při vyšších ředěních, v případě pozitivity je stanoven titr protilátek. V některých případech přítomnost 2 a více protilátek v séru, která jsou reaktivní se stejným substrátem, mohou způsobovat interference v jejich detekci pomocí imunofluorescence. Tato interference může způsobovat selhání detekce ANCA nebo potlačení jeho titru pokud má interferující protilátka titr vyšší než ANCA. Nejčastější příčinou interference u testování ANCA je koexistence ANA. U některých pacientů s Wegenerovou granulomatózou, bývá testována ANCA jako negativní. V takových případech opakované testování může přinést pozitivní výsledky. Pacienti léčeni na Wegenerovu granulomatózu jsou stále negativní na ANCA. Reakce ANA mohou někdy být špatně rozeznatelné nebo napodobující ANCA barvení. Ke konfirmaci panca reakce, mohou být tato séra retestována buď na formalinem fixovaných sklíčkách nebo ANA na HEp-2 sklíčkách. panca vzorky na formalinem fixovaných ANCA substrátech by měly být canca reaktivní, zatímco reakce na ANA by měla být negativní nebo zůstat nukleární. Anti-cytokeratinové protilátky mohou způsobovat falešně pozitivní výsledky canca. V takových případech nepřímý IF test na HEp-2 buňkách může pomoci rozlišit pseudo-anca od opravdové canca. Titr protilátek nemusí být nutně spojován s aktivitou onemocnění. Výsledky ANCA testování by měly být vyhodnoceny s ohledem na klinický nález, stejně tak, jako přítomnost nebo nepřítomnost ANCA nemusí být přímo spojována s vaskulitidou. Pozitivní výsledky na ANCA získané imunofluorescencí mohou být konfirmovány ELISA testem. ANCA některých specifických antigenů více svědčí o určité vaskulární poruše. ANCA byla spojována také s jinými imunologickými poruchami než je vaskulitida, jako např. ulcerózní kolitida. 3
OČEKÁVANÉ HODNOTY Na přítomnost ANCA bylo testováno 64 normálních vzorků. Všechny vzorky byly negativní na ANCA při ředění 1:20. Pozitivní ANCA v příslušném klinickém prostředí je užitečná v diagnostice systémových vaskulitid a zánětlivých střevních onemocnění. K canca barvení dochází nejčastěji při Wegenerově granulomatóze a k panca barvení u mikroskopické polyangitidy, pauci-imunitní krescentické glomerulonefritidy a ulcerativní kolitidy. U dalších vaskulitid (polyarteritis nodosa, takayasu disease, giant cell arteritis, Behcet s disease) jsou ANCA vzácné nebo chybějící. Incidence ANCA u Wegenerovy granulomatózy a dalších vaskulitid uvedených v literatuře jsou v tabulce 1 na konci dokumentu. V "European ANCA collaborative assay standardization project" Hagan a jeho spolupracovníci posoudili užitečnost nepřímého IF testu v diagnóze idiopatické systémové vaskulitidy. Ve studii bylo zjištěno, že je ANCA přítomna u 85% pacientů s Wegenerovou granulomatózou, z těchto 64% bylo pozitivních na canca a 21% na panca. panca byla převládající nad canca u mikroskopické polyangitidy (58% vs 23%) s citlivostí 81% u mikroskopické polyangitidy a 82% u idiopatické rychle progredující granulonefritidy. U kontrolních vzorků nemocných a zdravých jedinců byla ANCA přítomna v 19%, respektive 6%, čímž byla zjištěna specificita 76% u kontrolních vzorků nemocných jedinců a 94% u kontrolních vzorků zdravých jedinců. (tabulka 2 na konci tohoto dokumentu). Nicméně, pozitivní prediktivní hodnota ANCA testů je mnohem lepší a výraznější, pokud je hodnocena ve spojení s klinickými příznaky a symptomy. V článku Jennette Wilmantové a Falkové je uváděna pozitivní prediktivní hodnotu 92% u pacientů se sérovým kreatininem >3 mg/dl. Podobně u pacientů, u kterých počáteční pozitivní prediktivní hodnota je nízká, pozitivní ANCA výsledek zvyšuje pravděpodobnost onemocnění v takové úrovni, která může být nezbytná pro další hodnocení. Autoři došli k závěru, že ANCA testování u pacientů se silnými klinickými projevy pauci-immunitní krescentické glomerulonefritidy je nejužitečnější pro doložení diagnózy, zatímco ANCA testování u pacientů se slabými klinickými projevy je nejužitečnější pro vyloučení diagnózy. CHARAKTERISTIKA TESTU Anti-Neutrophil Cytoplasmic Antibody (ANCA) test byl srovnáván s dalším nepřímým fluorescenčním ANCA testem. Srovnání zahrnuje 129 vzorků sér získaných z diagnostické referenční laboratoře specializované na detekci autoimunitních onemocnění. Séra byla testována v souladu s postupem doporučeným výrobcem. Výsledky jsou následující: Relativní specificita: 91% Relativní citlivost: 100% Relativní shoda: 95% Bylo pozorováno 7 diskrepačních vzorků nepřímou imunofluorenční metodou, výše uvedené byly testovány metodou ELISA na protilátky proti myeloperoxidázovým (MPO) nebo proteinázovým 3 (PR3) antigenům, což jsou 2 hlavní antigeny spojené s ANCA. 7 těchto vzorků bylo pozitivních ELISA testem a negativních jiným testem, což naznačuje pravou pozitivitu těchto vzorků. Zkřížená reaktivita Antinukleární protilátky (ANA) mohou vykazovat pozitivní reakce na neutrofilech. Určení reaktivity na ANA neutrofilech, může být nepřehledné pro reaktivitu ANCA, výrobce testoval 25 ANA pozitivních vzorků na různé specifické protilátky na ethanolu, formalinu a COMVI sklíčkách. Všechna ANA pozitivní séra zahrnující SS-A(Ro) a SS-B(La) specifické protilátky, ukázaly nukleární reakce. Tyto ANA reakce buď zůstávají nukleární nebo se stanou negativními na formalinem fixovaných sklíčkách Reprodukovatelnost Studie byly provedeny k prokázání vnitřní nebo vnější variability testu. 4 ANCA pozitivní (2 canca a 2 panca) a 1 ANCA negativní sérum, bylo testováno již při Endpoint ředění 1:20. Séra byla testována 3 různými šaržemi na ethanolu, formalinu a COMVI sklíčkách 4 dny pro stanovení vnitřní i vnější reprodukovatelnosti. Negativní vzorky zůstaly negativní a pozitivní vzorky poskytly očekávaný titr. ANCA reakce na ethanolem fixovaných sklíčkách ANCA reakce na formalinem fixovaných sklíčkách 4
Tabulka 1. Prevalence ANCA Klinický stav % pozitivních Wegenerova granulomatóza generalizovaná aktivní 96 částečná remise 71 úplná remise 41 lokálná recidiva 80 lokalizovaná aktivní 67 částečná remise 54 úplná remise 32 Zánětlivá střevní onemocnění Ulcerativní kolitida 70 Primární sklerotizující cholangitida 82 Cronova choroba* 27 Kontroly onemocnění dárci krve 0 pojivové tkáně autoimunitní onemocnění** 5 různé zdravotní podmínky 0 granulomatózní onemocnění 0 primární ledvinové onemocnění 1 *ANCA titry jsou obvykle nízké **ANCA reaktivita je panca Tabulka 2: Senzitivita a specificita IF testu u pacientů se systémovou vaskulitidou (upraveno z reference č. 16.) Senzitivita % N canca panca c/panca Pacienti Wegenerova granulomatóza 97 64 21 85 Mikroskopická polyangitida 44 23 58 81 Idiopatické RPGN 12 36 45 81 Klasická polyarteritidis nodosa 10 10 30 40 Churg-Straussův syndrom 6 33 33 66 Specificita % Kontroly Kontrolní vzorky nemocných 184 95 81 76 Kontrolní vzorky zdravých 740 98 96 94 LITERATURA 1. NölleB, SpecksU, Lüderman J, Rohrbach M, DeRemee RA and Gross WL. Anticytoplastic antibodies: Their immunodiagnostic value in Wegeners granulomatosis. Ann Int Med 111: 28-40, 1989 2. Venning MC, Quinn A, Broomhead V and Bird AG. Antibodies directed against neutrolils (canca and panca) are of distinct diagnostic value in systemic vasculitis. Quart J Med 77: 1287-1296, 1990. 3. Van der Woude FJ, Daha MR and Van EsLA. The current status of neutrophil cytoplasmic antibodies. Clin Exp Immunol 78: 143-148, 1989. 4. Specks U, Wheatley CL, McDonald TJ, Rohrbach MS and DeRemee RA. Anticytoplasmic autoantibodies in the diagnosis and follow up of Wegeners granulomatosis. Mayo Clin Proc 64: 28-36, 1989. 5. Terwert JVC, van der Woude FJ, Fauci AS and AmbrusJL. Association between active Wegeners granulomatosis and anticytoplasmic antibodies. Arch Int Med 149: 2461-2465, 1989. 6. Cross CE and Lillington GA. Serodiagnosis of Wegeners granulomatosis: Pathobiologic and clinical implications. Mayo Clin Proc 64: 119-122, 1989. 7. Seibold F, Slametschka D, Gregor X and Weber P. Neutrophil Autoantibodies: A genetic marker in primary sclerosing cholangitis and ulcerative collitis. Gastroenterol 107: 532-536, 1994. 5
8. Claise C, Johanet C, Bouhnik Y et al. Antineutrophil cytoplasmic autoantibodies in autoimmune liver and inflammatory bowel diseasses. Liver 16: 28-34, 1996. 9. Gigase P, DeClerck LS, Van Cotthem KA et al. Anti-Neutrophil cytoplasmic antibodies in inflammantory bowel disease with special attention for IgA-class antibodies. Dig Dis and Scl 42: 2171-21174, 1997. 10. Shanahan F. Neutrophil autoantibodies in inflammantory bowel disease: Are Theky important? Gastroenterol 107: 586-589, 1994. 11. Shanahan F and Bernstein CN. ANCAs aweigh in colitis. Gastroenterol 105: 946-947, 1993. 12. Lüdemann J, Utecht B and Gross WL. Laboratory methods for detection of antineutrophil cytoplasm antibodies. Clin Immunol Newsletter 10: 159-166, 1990. 13. Beutner EH, Kumar V, Krasny SAand Chorzelski TP. Defined imunofluorescence in immunodermatology. In Immunopathology of the Skin, Beutner EH, Chorzelski TP and Kumar V, Eds, John Wiley and Sons, New York, 3rd Ed, 3-40, 1987. 14. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Center for Disease Control, National Institute for Health, HHS Pub. No (CDC) 93-8359, 1999. 15. Streicher J, Fabian B, Herkner K et al. Anti-cytokeratins are a potential source of false pozitive indirect immunofluorescence assai for canca. J Clin Lab Analysis. 12: 54-59, 1998. 16. Hagen CF, Daha MR, Hermand Jet al. Diagnostic value of standardized assays for anti-neutrophil cytoplasmic antibodies in idiopathic systemic vasculitis. Kidney Int 53: 743-753, 1998. 17. Jennette JC, Wilkman AS, Falk RJ. Diagnostic predictive value of ANCA serology. Kidney Int 53: 796-798, 1998. 6
7