Proč nemohou být imunoanalytické metody přísně specifické, proč je není možné standardizovat a co z toho vyplývá Lochman I. oddělení imunologie a alergologie ZÚ Ostrava XI. ČASOMIL, Znojmo, 13.-15.6.2012
Imunoanalytické metody = metody založené na reakci antigenů s protilátkami používané v medicíně k diagnostice jsou zatím nestandardizovatelné Cox L. et al.: Annals of Allergy, Asthma & Immunology 2008;101(6):580-92 Mattson PEJ et al.: I/LA20-A2 CLSI document, 2009, 156 pages Lochman I.: Sborník přednášek XXXI. IAD 2010, s. 26-29 Lochman I. et al.: Proč nemůžeme očekávat brzkou standardizaci imunoanalytických metod. Stanovování RF jako příklad. Sborník přednášek XXXIII. IAD, 2012, on flash Důvody: Rozpoznávání a reakce imunitního systému nejsou založeny na přísné specifičnosti. Různí výrobci používají různá, většinou patentem chráněná diagnostika, takže nelze objektivně posoudit, nakolik jsou jejich diagnostika totožná nebo se liší Musíme proto akceptovat fakt, že různé imunoanalytické metody a různé diagnostické soupravy budou u některých vzorků pro daný analyt dávat rozdílné výsledky. Je malá šance, že administrativně definované standardní metody budou mít lepší validitu, mají-li splňovat svůj účel podle normy ISO 15189, než většina v praxi osvědčených metod.
Reakce antigenu s protilátkou Vybráno a upraveno podle: Rozprimová L.: Imunoanalytické metody: historie a současnost. Prezentace na 26.IAD, Praha, 2005
Protilátky jsou také komunikační molekuly IS zajišťující specifičnost rozpoznávání v rámci imunitní odpovědi jsou vytvářeny proti všem strukturám, se kterými se organismus setkává, tedy i proti strukturám vlastním v tomto smyslu jsou např. autoprotilátky a autoimunita fysiologickou součástí imunitní odpovědi důležitá je nejen specifičnost protilátek, ale i jejich izotyp a detailní složení, avidita (afinita) protilátky: přirozené & obranné polyreaktivní & monoreaktivní autoprotilátky katalytické (protilátkové enzymy)
Úloha EHK (EQA) při kontrole imunoanalytických metod Klinická/lékařská laboratoř si by si měla vybírat a nabízet taková vyšetření, která splňují požadavky uživatelů a zároveň jejich praktická realizace je po všech stránkách přiměřená účelům, pro které jsou realizovány. Preferovány by měly být takové postupy, které byly zveřejněny vhodnověrných knihách, časopisech nebo mezinárodních, národních nebo oblastních doporučeních. (ISO 15189:2011, 3. vydání, odst. 5.5) Laboratoře by měl dbát také na to, aby tato vyšetření byla prováděna ve vyhovující kvalitě a tuto kvalitu validovat a průběžně verifikovat. Mezi postupy ověřující kvalitu poskytovaných služeb (nabízených a realizovaných metod) patří také mezilaboratorní srovnávání -ILC (ISO 15189:2011, 3. vydání, odst. 5.6.4), kde nejvýhodnější je zapojení se do vhodných programů EHK. Na základě výsledků mezilaboratorních porovnání může laboratoř své postupy potvrzovat event. je korigovat. EHK patří mezi ILC a akreditační orgány si mají při prověrkách všímat také výsledků laboratoří vilc a způsobu, jak na ně reagují. (ILAC P9-11, odst. 3.2) Při výběru ILC (EHK) si musí laboratoř zvážit, zda je vní je ověřováno skutečně to, co chce ověřovat a jak jsou jednotlivé cykly ILS vyhodnocovány. Zda zpohledu posuzování použití techniky jako takové, nebo vlastností metody ve vztahu kúčelům, ke kterým je používána nebo kjednotlivým subjektům, které jsou posuzovány. O výběru vhodného EHK a frekvenci účasti rozhoduje laboratoř. (EA 4/18, 2010)
Úloha EHK při kontrole imunoanalytických metod shrnutí Organizované cykly EHK jsou jednou zmožností mezilaboratorní kontroly, která pomáhá laboratořím ověřovat a prokazovat, že jí používané laboratorní postupy (metody) mají potřebnou kvalitu a splňují účel, pro nějž jsou používány. O tom, jakých EHK a sjakou frekvencí by se jich měla laboratoř účastnit, by měla rozhodovat laboratoř sama. Norma ale nevylučuje, že to může být vrámci států nebo regionů jinak.
Incidence Frekvence výskytu onemocnění v časovém úseku Prevalence Podíl populace trpící onemocněním v daném časovém období definice Positivní předpovědní hodnota Podíl skutečně pozitivních výsledků testů mezi všemi pozitivními výsledky testů Sensitivita Podíl pozitivních výsledků mezi nemocnými pacienty Negativní předpovědní hodnota Podíl skutečně negativních výsledků testů mezi všemi negativními výsledky testů Specificita Podíl negativních výsledků testů mezi zdravými Efektivita Relativní počet správně klasifikovaných pacientů A výsledky testu + - onemocnění + A B bez onemocnění - C D A + C A A + B D B + D D C + D A + D A + B + C + D
Přehled účastníků, metod a výrobců v EHK RF 1/11 analyt metoda počet účastníků počet výrobců RF screening nephel/turbid 134 (96) 20 (7) EIA 9 6 titrace 12 7 RF IgG EIA 36 (24) 7 (4) RF IgA EIA 36 (24) 7 (4) RF IgM EIA 36 (22) 7 (4) anti-ccp EIA 62 (29) 15 (3) Počet účastníků a výrobců, kteří byli zavzati do konečné analýzy je uveden v závorkách.
Přehled výsledků stanovení RF nefelometricky a turbidimetricky v EHK RF1/11 analyte producer 12 49 RF 58 screening 60 neph/turb 115 149 179 # Sample A Sample B Ratio A/B labs mean CV(%) Bonf mean CV(%) Bonf mean CV(%) Bonf 23 0.470 97 30.05 30 0.016 90 9 0.530 82 21.48 35 0.026 99 15 1.057 17 34.07 12 0.031 17 27 1.152 15 33.31 14 0.035 10 6 8 8 0.573 0.783 0.820 33 13 36 23.32 30.83 32.81 40 18 32 0.028 0.026 0.025 48 14 12 ANOVA (p- value) <0.001 <0.001 <0.001 IP Ratio of sample A / sa 0.02.04.06.08 ample B 12 49 58 60 115 149 179 Producer
Přehled výsledků stanovení RF a anti-ccp pomocí EIA vcyklu EHKRF1/11 analyte producer IgG RF ELISA IgA RF ELISA 135 140 147 # Sample A Sample B Ratio A/B labs mean CV(%) Bonf mean CV(%) Bonf mean CV(%) Bonf 6 0.676 51 16.02 25 0.047 62 10 0.761 21 7.91 46 0.110 37 4 0.453 64 7.20 43 0.072 95 148 4 0.483 32 10.73 30 0.053 73 ANOVA (p- value) 0.112 0.001 0.042 135 6 0.279 81 8.18 49 0.047 94 140 10 0.542 18 7.08 64 0.097 44 147 4 0.203 40 18.00 157 0.042 91 148 4 0.118 70 5.51 43 0.027 73 ANOVA (p- value) <0.001 0.403 0.018 135 4 0.220 25 24.24 5 0.009 22 IgM RF ELISA 140 147 10 4 0.540 0.393 32 45 17.78 18.15 59 56 0.038 0.040 51 125 148 4 0.463 19 21.38 49 0.026 49 ANOVA (p- value) 0.015 0.680 0.255 1 12 0.288 84 155.44 16 0.002 68 anti-ccp 87 4 0.188 47 24.75 112 0.015 74 ELISA 140 13 0.385 77 43.18 90 0.016 76 ANOVA (p - value) 0.370 <0.001 0.002
Výsledky stanovení anti-ccp vzorku B v cyklu EQA RF1/11 anti-ccp 0 Sample B - Index of Positivity 50 100 150 200 1 87 140 Producer Výrobce 1 používá pro koutování jiný antigen než výrobci 2 a 3
HLA DQ J.G., muž, nar.1958 dg: torpidní refrakterní celiakie zjištěna před 15 lety (potvrzena histologicky 2x, ale podle tehdy uznávaných kriterií) nereaguje na dietu ani na léčbu systémovými kortikoidy alela 2005 EMA IgA negativní anti-ttg IgA silně pozitivní Rizikové alely u celiakie 2005 cis-haplotyp haplotyp izoforma subtyp DQA1 DQB1 HLA-DQ2 DQ α 5 β 2 DQ2.5 *0501 *0201 HLA-DQ8 DQ α 3 β 8 DQ8.1 *0301 *0302 V Evropě jen 6% celiaků nemá rizikové alely DQ2.5 nebo DQ8. Z nich 4% mají DQ2.2 izoformu a jen 2% nemají DQ2 nebo DQ8. Jen u 5% jedinců s rizikovou alelou HLA-DQ2 dojde k propuknutí celiakie, ale riziko je 250x vyšší než u jedinců, kteří ji nemají. (Wikipedia) průkaz v krvi sensitivita specifičnost HLA-DQ2 94% 73% HLA-DQ8 12% 81% Hadithi M. et l.: Ann.Intern.Med. 2007; 147(5): 294-302 2011 EMA IgA negativní, IgG negativní anti-ttg IgA pozitivní, IgG negativní anti-dgp IgA negativní, IgG negativní anti-gl IgA silně poz, IgG poz, IgE neg rizikové alely: DQ2 neg, DQ8 pozitivní IgG 6,0 g/l, IgA 21,6 g/l, IgM 0,25 g/l, IgD <22 U/L, IgE <2 kiu/l, monoklon.ig neprokázán,podtřídy IgA1,2 zvýšeny symetricky Jak lze vysvětlit jasnou pozitivitu anti-ttg a negativitu negativní jsou EMA ukazatele ve třídě zánětlivé IgA aktivity, u pozitivní ASCA NIF v IBD screenu tohoto muže? Jde o vůbec o celiakii? (negativní anti-dgp)
K.K., dívka nar. 2002 Asi od 9.7.09 teplota do 37,5 o C, bolesti břicha a krku. Bolesti krku odezněly, ale bolesti celého břicha a subfebrilie přetrvávají. 18.7. jednodenní vzestup teplot na 39,5 o C. Poté již bez teplot, bolesti břicha nebyly. V pátek 25.7. odjezd k moři, v sobotu ráno se dívenka vzbudila již žlutá, žluté bělmo, bolesti břicha, bez teplot, zvracela, stolice řídká, mastná, světlá, moč tmavá. Odjíždí zpět do ČR. 27.7. hospitalizace se susp. inf. hepatitidou na infekčním odd. nemocnice v Opavě. Infekční etiolologie t.č. a pak i dále vyloučena (VHA, VHB, VHC, HCV i VHE kompletně sérologie, VHB a VHC i PCR provedeno v Opavě a na ZÚ Ostrava, opakovaně pak i v Olomouci). UZ břicha bez patol. nálezu. Výrazná elevace jat. enzymů, amoniaku a bilirubinu, terapie hepatoprotektivy a domluven překlad na JIP DK v Olomouci 31.7. v rámci komplexní diferenciální dg vyšetřeny k vyloučení AIH a PSC také autoprotilátky. Výrazná pozitivita anti-lkm v blotové technice soupravou A. Na základě tohoto vyšetření pacientka připravována na biopsii jater. Zároveň však hematologická vyšetření ukázala na aplastickou anemii a předána z DK na HK. Během toho požádala laboratoř ÚI FN Olomouc o konfirmaci anti-lkm pozitivity laboratoř ve FN Motol, laboratoř výrobce soupravy A a laboratoř OIA ZÚ Ostrava. Laboratoř výrobce i laboratoř FN Motol pozitivitu anti-lkm potvrdily, laboratoř FN Motol i ZÚ Ostrava nenalezly pozitivitu anti-lkm v IFA a laboratoř ZÚ Ostrava ani v immunoblotu soupravou výrobce B. Dívka zůstala v péči hematologů, byla připravena pro transplantaci kostní dřeně, biopsie jater nebyla provedena a výsledek anti-lkm blotovou technikou soupravou A byl uzavřen jako falešně pozitivní
Závěr Je vždy dobré ověřit a mít možnost potvrdit si pozitivní a eventuelně i negativní nálezy zvláště při nesouhlasu s anamnézou, zvláště při podezření na tak závažné diagnózy, jako je AIH2, jinou, než rutinně používanou technikou. LKM krysí ledvina LKM krysí játra
HEp-2 1:40, AM AIH2/11 vzorek A PL 1:40, AM RL 1:40, AM RK 1:40, AM RS 1:40, AM MI 1:40, AM Imunoblot (IP): anti-bpo - 1.0 anti-lkm1-3.38 anti-ro52-7.38 Euroimmun Liver Mosaic 3, lot F101104CA AIH2/11 vzorek A pozitivní ELISA/blot negativní Euroimmun 32 1 Pharmacia 2 0 Aesku-lab Dg 0 1 D-Tek 1 6 Biovendor 0 1 DRG 1 0 AIDA 1 0
Rods and rings (RR) autoantigeny Rozpoznávány autoprotilátkami u pacientů s infekcí VHC léčených ribavirinem nebo pegylovaným interferonem alfa. (Většinou u těch, kteří špatně odpovídají na uvedenou terapii?) Na HEp-2 buňkách (některých výrobců) se prezentují v cytoplazmě buď jako tyčinky (dlouhé 3-10 µm) a/nebo jako kolečka ( 2-5 µm v průměru) RR nemají vztah k žádným zatím známým cytoplasmatickým strukturám. Bylo prokázáno, že jejich složkami jsou řídce se vyskytující enzymy zapojené do syntézy nukleotidů syntetáza 1 cytidin trifosfátu (CTPS1) a dehydrogenáza 2 inosin monofosfátu (IMPDH2) Carcamo W.C. et al.: Autoantigens, Autoantibodies, Autoimmunity, Vol. 7, PABST, 2011, pp.107-108 Carcamo W.C. et al.: Plos ONE, 2011; 6(12): e29690 R.L. Humbel ve svém atlasu označuje jako antigen těchto struktur nematin Humbel R.L.: From the most commpn to the rarest in HEp-2 slides. Bio-Rad, 2011, pp 90-91
SEKK AIM1/12, sada vorků 2, vzorek B Euroimmun etoh-gr Euroimmun form-gr Inova etoh-gr Euroimmun HEp-2 1:40 Euroimmun PL 1:40 1:80 1:160 1:320 metoda/ip MPO PR3 Euroimmun (hr-hn) 1,37 5,03 Euroimmun Profile 0,94 7,36 Orgentec Alegrie 6,34 4,68 GA ANCA Dot neg pos Euroimmun Profile: Lf: 0,30; Ela: 0,16; Cath: 0,04; BPI: 0,06
SEKK AIM1/12, sada vzorků 2, vzorek B IFA všichni pozitivní (53 účastníků, 8 různých diagnostik) IFA typ: 38x C-ANCA, 12x P-ANCA + C-ANCA, 2x P-ANCA, 1x NSA (A-ANCA) Anti-PR3: 61 účastníků, 13-14 výrobců, 2 techniky, všichni pozitivní Anti-MPO: 61 účastníků: 43 pozitivní, 4 neprůkazný, 14 negativní B MPO 135 139 66 87 101 14 147 148 191 999 EIA blot EIA EIA EIA blot EIA? EIA EIA EIA blot blot poz 16 1 4 1 9 6 2 1 3 HP 1 1 1 1 neg 1 4 3 1 1 1 1 135 OrgenTec 139 BL Dg 66 DRG 87 Euroimmun 101 Hycor 14 Bio-Rad 137 AIDA 148 Aescu.lab 191 D-tek 999 jiný