Název disertační práce

Mendelova univerzita v Brně Agronomická fakulta Ústav agrochemie, půdoznalství, mikrobiologie a výživy rostlin Název disertační práce Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou z mléka a mléčných výrobků Vedoucí práce: Ing. Libor Kalhotka, Ph.D. Vypracovala: Ing. Michaela Hůlová Brno 03

PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem disertační práci na téma Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou z mléka a mléčných výrobků vypracovala samostatně a použila jen pramenů, které cituji uvádím v přiloženém seznamu literatury. Disertační práce je školním dílem a může být použita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího diplomové práce a děkana Agronomické fakulty Mendelovy univerzity v Brně. dne. Podpis doktoranda

PODĚKOVÁNÍ Ráda bych touto cestou poděkovala Ing. Liboru Kalhotkovi, Ph.D. za odborné vedení, konzultace, cenné rady a ochotu při zpracování této disertační práce. Dále bych chtěla poděkovat také své rodině za veškerou podporu a trpělivost v průběhu celého studia. Disertační práce vznikla s podporou projektu MŠMT B08069 Národní program výzkumu - NPV II, program B - Výzkum vztahů mezi vlastnostmi kontaminující mikroflóry a tvorbou biogenních aminů jako rizikových toxikantů v systému hodnocení zdravotní nezávadnosti sýrů na spotřebitelském trhu a projektu IGA AF MENDELU IP 003/00 Metabolická aktivita kontaminujících mikroorganismů v mléce a mléčných výrobcích.

ABSTRAKT Disertační práce se zabývá bakteriemi, které jsou schopné dekarboxylovat jednu nebo více aminokyselin a tím se podílet na tvorbě biogenních aminů. Cílem disertační práce bylo charakterizovat dekarboxylázovou aktivitu bakterií Escherichia coli, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus izolovaných z mléka a mléčných výrobků. Mikroorganismy byly inokulovány do zkumavek s diagnostickým médiem. Pro testování bylo použito 7 aminokyselin. Inkubace zkumavek probíhala při teplotě 6, 5, 30 a 37 C po dobu 0 dnů v jejichž průběhu byla kontrolována barevná změna. U testovaných izolátů Escherichia coli byla zjištěna dekarboxylázová aktivita a to především pro tyrozin a ornitin. U bakterie Bacillus licheniformis byla zjištěna dekarboxylázová aktivita a to především pro tyrozin. U testovaných izolátů bakterie Lactobacillus byla prokázána nejsilnější dekarboxylázová aktivita především pro arginin. U bakterie Enterococcus byla prokázána nejsilnější dekarboxylázová aktivita především pro arginin. Dále byla sledována produkce oxidu uhličitého a tvorba biogenních aminů kontaminujícími mikroorganismy v kravském a kozím tvarohu. Klíčová slova : Dekarboxylázová aktivita, biogenní aminy, aminokyselina ABSTRACT This thesis deals with bacteria that are capable decarboxylase one or more amino acids and thus contribute to the formation of biogenic amines. The aim of this work was to characterize the bacteria with decarboxylase activitthe Escherichia coli, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus isolated from milk and dairy products. Microorganisms were inoculated into tubes with diagnostic medium. To test was used seven amino acids. Incubation tubes conducted at 6, 5, 30 and 37 C for 0 days during which the color change was monitored. The tested isolates of Escherichia coli were detected decarboxylase activity, especially for tyrosine and ornithine. The bacterium Bacillus licheniformis was found decarboxylase activity, especially on tyrosine. The bacteria Lactobacillus isolates tested were shown the strongest decarboxylase activity especially for arginine. The bacteria Enterococcus was demonstrated the strongest decarboxylase activity especially for arginine. Furthermore, the observed production of carbon dioxide and formation of biogenic amines contaminating microorganisms in cow s and goat s curd. Keywords: Decarboxylase activity, biogenic amines, amino acid

OBSAH ÚVOD 8 LITERÁRNÍ PŘEHLED....9. Dekaboxylázová aktivita mikroorganismů...9. Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou...9.. Nežádoucí bakteriální kontaminanty 0... Čeleď Enterobacteriaceae...0... Čeleď Bacillaceae...4...3 Čeleď Pseudomonadaceae...6...4 Čeleď Staphylococcaceae..6...5 Čeleď Micrococcaceae...7.. Bakterie mléčného kvašení...7... Čeleď Lactobacillaceae...8... Čeleď Streptococcaceae......3 Čeleď Enterococcaceae...4...4 Čeleď Propionibacteriaceae...5.3 Biogenní aminy...5.3. Faktory ovlivňující růst mikroorganismů a dekarboxylázovou aktivitou a tvorbu biogenních aminů...6.3.. Dostupnost substrátu.7.3.. Aktivita vody 7.3..3 Teplota..9.3..4 ph..30.3..5 Koncentrace soli...3.3..6 Redox potenciál přístupu kyslíku.3.3..7 Doba zrání a skladování 33.3..8 Startovací kultury..34.3..9 Přísná aplikace hygienických zásad získávání surovin i při jejich následném zpracování 35.3..0 Tepelné ošetření mléka...35.3.. Homogenizace.35.3. Fyziologické účinky biogenních aminů.36.3.3 Toxikologické účinky biogenních aminů...37 5

.3.4 Reakce biogenních aminů 39.3.5 Odbourávání biogenních aminů v organismu..39.3.6 Hygienické limity obsahu biogenní aminů v potravinách 40.3.7 Snížení hladiny biogenních aminů v potravině.4.3.8 Výskyt biogenních aminů v mléce a mléčných produktech... 4.3.8. Biogenní aminy v mléce. 4.3.8. Biogenní aminy v sýrech.4.3.8.3 Biogenní aminy v ostatních mléčných produktech. 48 3 CÍL PRÁCE 49 4 MATERIÁLY A METODY... 50 4. Metoda průkazu dekarboxylázové aktivity mikroorganismů.. 50 4.. Mikroorganismy testované na dekarboxylázovou aktivitu.. 5 4... Testované izoláty Escherichia coli. 5 4... Testované izoláty Bacillus licheniformis..53 4...3 Testované izoláty rodu Bacillus 54 4...4 Testované izoláty rodu Lactobacillus 54 4...5 Testované izoláty rodu Enterococcus 55 4. Kontaminující mikroorganismy v mléce a mléčných výrobcích a tvorba biogenních aminů.56 4.. Inokulace a kultivace mikroorganismů.56 4.. Stanovení produkce oxidu uhličitého...58 4..3 Stanovení biogenních aminů.59 5 VÝSLEDKY.60 5. Dekarboxylázová aktivita mikroorganismů..60 5.. Dekarboxylázová aktivita Escherichia coli..60 5.. Dekarboxylázová aktivita Bacillus licheniformis...69 5..3 Dekarboxylázová aktivita rodu Bacillus...76 5..4 Dekarboxylázová aktivita rodu Lactobacillus..80 5..5 Dekarboxylázová aktivita rodu Enterococcus..83 6

5. Kontaminující mikroorganismy v mléce a v tvarohu a jejich tvorba biogenních aminů a produkce oxidu uhličitého..88 5.. Produkce biogenních aminů bakterií Enterococcus faecium 93 5.. Produkce biogenních aminů bakterií Enterobacter aerogenes.96 5..3 Produkce biogenních aminů bakterií Escherichia coli..99 5..4 Produkce biogenních aminů bakterií Pseudomonas fluorescens 0 5..5 Produkce biogenních aminů bakterií Proteus vulgaris...04 5..6 Produkce biogenních aminů mikromycetou Geotrichum candidum...07 6 ZÁVĚR 0 7 SUMMARY 8 SEZNAM POUŽITÉ LITERATURY..3 7

ÚVOD Mléko a mléčné výrobky představují vhodné prostředí pro růst mikroorganismů, které svou metabolickou činností mohou ovlivnit příznivě nebo nepříznivě kvalitu a biologickou hodnotu výrobku (GRIGER, HOLEC, 990). Mikroorganismy v mléce mohou vyvolat různé změny, které jsou závislé především na druhu mikroorganismu a na složce mléka, kterou tyto mikroorganismy rozkládají. Mezi hlavní změny, které vyvolávají mikroorganismy v mléce a mléčných výrobcích, patří změny vyvolané fermentační činností mikroorganismů, dále změny způsobené proteolýzou, lipolýzou, tvorbou alkalické reakce mléka, případně slizovatění mléka, změny barvy, tvorba biogenních aminů aj. (CEMPÍRKOVÁ et al., 997). Při hodnocení zdravotní nezávadnosti potravin se hlavní pozornost věnuje cizorodým látkám kontaminujícím. Naproti tomu přirozené škodlivé složky, ať již obsažené v potravních surovinách nebo vznikající během skladování a zpracování, jsou až na výjimky (mykotoxiny, glykoalkaloidy) sledovány podstatně v menší míře. Do této skupiny patří rovněž biogenní aminy a zčásti i polyaminy (KALAČ, KŘÍŽEK, 005). Některé biogenní aminy jsou pro organismus nepostradatelné, neboť mají významné biologické funkce. Jsou zdrojem dusíku, prekurzory pro syntézu hormonů nebo samy působí jako hormony, podílejí se na syntéze nukleových kyselin, proteinů, alkaloidů atd. (SILLA SANTOS, 996). Spotřeba potravin obsahující vysoké koncentrace některých aminů může vyvolat nežádoucí účinky. Symptomy konzumace vysokých dávek biogenní aminy jsou především nucení ke zvracení, dýchací potíže, bušení srdce, bolesti hlavy, zrudnutí v obličeji, pálení v ústech, červená vyrážka na kůži, hypotenze a hypertenze (VELÍŠEK, 00; KALAČ, KŘÍŽEK, 00). Koncentrace biogenních aminů v čerstvém mléce je nepatrná, výskyt je většinou pod mg/l. Podmínkou vzniku toxického množství aminů v mléčných výrobcích je proteolýza, která je při zrání sýrů považována za jeden z nejdůležitějších pochodů ovlivňující kvalitu sýra. Na proteolýze mléčných bílkovin se podílejí nativní proteázy z mléka, proteázy zákysových kultur, syřidlové enzymy, proteázy kontaminující mikroflóry, ale hlavně bakterie startovacích kultur (Lactococcus lactis, Lactobacillus delbrueckii subs. bulgaricus, Enterococcus faecalis a Enterococcus faecium) (GREIF, GREIFOVÁ, 006). Pozitivně dekarboxylující mikroorganismy mohou být tedy součástí mikroflóry potravin, ale mohou být i jako důsledek kontaminace během výroby a skladování potravin. Proto je potřeba věnovat 8

náležitou pozornost výběru surovin, jejich mikrobiologické kvalitě, ale i technologickým operacím a skladovacím podmínkám (GREIF, GREIFOVÁ, 004). LITERÁRNÍ PŘEHLED. Dekarboxylázová aktivita mikroorganismů Biogenní aminy (BA) vznikají v potravinách především působením bakterií, jejichž enzymy dekarboxylázy odštěpují karboxylové skupiny z dané aminokyseliny za vzniku aminu a oxidu uhličitého (KALAČ, KŘÍŽEK 00). Dekarboxylázy jsou enzymy řazené do třídy lyáz, které jsou většinou orientované na určitou aminokyselinu především její L- formy. Rozhodující složkou dekarboxyláz je pyridoxal-5-fosfát, což je forma vitamínu B6, která se může jako kofaktor účastnit metabolických pochodů spojených s přeměnami aminokyselin zahrnujících např. transaminaci a dekarboxylaci (GREIF, GREIFOVÁ, 998). Zjistilo se, že může dekarboxylace proběhnout i bez pyridoxal-5-fosfátu. Tato dekarboxylace požaduje pyruvoylový zbytek, který je vázán kovalentní vazbou k amino skupině fenylalaninového zbytku enzymu. Tento aktivní proenzym pyruvyolového zbytku se chová v dekarboxylační rekaci podobně jako pyridoxal-5-fosfát (SHALABY, 996, cit. podle KRAJNACOVÁ, 0). Dekarboxylázy mohou navenek měnit oblasti účinku a intenzitu aktivity a některé mikrobiální dekarboxylázy přežívají i podmínky pasterace, takže enzymy mohou působit i přes nepřítomnost inhibovaných mikroorganismů (GREIF, GREIFOVÁ, 998). Tyto enzymy jsou rozdílné pro různé druhy mikroorganismů.. Mikroorganismy s dekarboxylázovou aktivitou Mezi bakterie, které mohou produkovat dekarboxylázy a podílet se tak na vzniku biogenních aminů, patří v mléce a mléčných výrobcích např. druhy rodu Bacillus, Clostridium, Pseudomonas, Staphylococcus, Micrococcus dále bakterie čeledi Enterobacteriaceae (např. Citrobacter, Escherichia, Klebsiella, Proteus, Enterobacter, Salmonella, Shigella, Hafnia) a některé bakterie mléčného kvašení Lactobacillus, Pediococcus a Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus a Leuconostoc nebo i probiotické a startovací kultury (SILLA SANTOS, 996; KALHOTKA et al., 00; ČERNÝ et al., 009). Produkce biogenních aminů je vlastnost specifická spíše pro určité kmeny bakterií než vlastnost pro daný druh, takže různé kmeny téhož druhu se mohou lišit v produkci biogenních aminů (ARENA, MANCA DE NADRA, 00). 9

.. Nežádoucí bakteriální kontaminanty... Čeleď Enterobacteriaceae Čeleď Enterobacteriaceae zahrnuje gramnegativní, nesporulující tyčinky. Jsou to fakultativně anaerobní mikroby a pro většinu druhů je teplotní optimum 37 C, ale dobře snášejí i změny teplot a do jisté míry i vyschnutí. Enterobacteriaceae většinou fermentují glukózu, ale fermentují i jiné sacharidy za tvorby kyseliny mléčné, kyseliny octové a jiných kyselin ve stopovém množství a obyčejně za tvorby plynu (CO a H ). Jsou oxidáza negativní a redukují dusičnan na dusitan (GÖRNER, VALÍK, 004). Biochemické vlastnosti enterobakterií se liší i mezidruhově. Parazitické druhy (Salmonella sp., Shigella sp.) jsou zpravidla méně aktivní, saprofytické jsou aktivnější, protože by těžko mohly využívat nejrůznější organické zbytky. Pozoruhodnou vlastností některých bakterií čeledi Enterobacteriaceae (Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter) je schopnost vázat molekulární dusík. Využívají této schopnosti ovšem jen v nouzi (ZAHRADNÍČEK 003). Mezi bakterie, které jsou schopné dekarboxylovat jednu nebo více aminokyselin a tím se podílet na tvorbě BA patří: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Hafnia, Klebsiela, Leclercia, Pantoea, Plesiomonas, Proteus, Serratia, které se podílejí na kažení potravin (SIILA SANTOS, 995; SHALABY, 996). Tyto druhy jsou spojovány s tvorbou kadaverinu a putrescinu (BOVER-CID, HOLZAPFEL, 999). Putrescin by mohl sloužit jako indikátor kvality v sýrařství (MARINO et al., 008). Dále existuje pozitivní korelace mezi koncentrací kadaverinu a množstvím Enterobacteriaceae v sýrech (MARINO et al., 000). Mnoho bakterií čeledi Enterobacteriaceae může tvořit značné množství histaminu, zejména E. cloacae, E. aerogenes, Klebsiella oxytoca, E. coli, Proteus morganii (SUZI, GARDINI, 003). Vysoké hladiny putrescinu (PUT) jako důsledek kontaminace bakteriemi čeledi Enterobacteriaceae jsou časté u tradičních jihoevropských sýrů, které se obvykle vyrábějí z nepasterovaného mléka za nedostatečných hygienických podmínek (GALGANO et al. 00; MARTUSCELLI et al., 005). Enterobakterie jsou značně termolabilní, ale při nedostatečném tepelném ošetření mléka nebo masivní kontaminaci během výroby však může dojít k uvolnění dekarboxyláz již v počátečních fázích a následné tvorbě BA i v nepřítomnosti mikroorganismů (FONTECHA et al., 990; ROIG-SAGUÉS et al., 00). 0

Rod Citrobacter Jsou gramnegativní tyčinky, vyskytující se jednotlivě nebo v párech, jsou peritrichní, fakultativně anerobní. Optimální teplota růstu je 37 C. Je běžný obyvatel střevního traktu zvířat a člověka, ale ve vyšších koncentracích může způsobit onemocnění oslabených jedinců. Významným druhem vyskytující se v potravinách je Citrobacter freundii a Citrobacter intermedius. Často se vyskytuje v kontaminovaných potravinách a v kontaminované vodě (GÖRNER, VALÍK, 004; KALHOTKA, 007; ŠILHÁNKOVÁ, 008). U bakterie Citrobacter feundii je zjištěna produkce putrescinu, kadaverinu a histaminu (BOVER-CID, HOLZAPFEL, 999). Rod Enterobacter Gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinky, jejich optimální teplota růstu je 30 až 37 C (SEDLÁČEK, 007). Tyto bakterie jsou schopny přežívat pouze v prostředí o ph vyšším než 4, (GREIF et al., 999). Vyskytují se ve střevním traktu, rostlinách, sekundárně i v mléce. Účastní se kažení potravin, patří do skupiny koliformních mikroorganismů, zkvašují sacharidy za vzniku oxidu uhličitého a vodíku (GÖRNER, VALÍK, 004). Jsou široce rozšířené v prostředí, nacházejí se ve sladké vodě, půdě, odpadní vodě, na rostlinách, zelenině, ve zvířecích výkalech i lidské stolici (SEDLÁČEK, 007). Nejvýznamnější pro člověka jsou druhy Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes a Enterobacter sakazakii (ZAHRADNÍČEK, 003). Enterobakterie patří mezi významné producenty kadaverinu (CAD) a putrescinu (PUT) (SCHIRONE, 0). Rod Escherichia Gramnegativní, fakultativně anaerobní, rovné tyčinky vyskytující se jednotlivě a ve dvojicích. Optimální teplota růstu je 37 C. Vyskytuje se jako normální flóra v koncové části střevního traktu teplokrevných zvířat (SEDLÁČEK, 007). Některé kmeny jsou však schopné vyvolat onemocnění v mírném rozsahu ve formě průjmu anebo mohou vést k potenciálně smrtelným komplikacím jako je hemolyticko - uremický syndrom (HEREDYA et al., 009). Ve střevě je to možné jen tehdy, když je kmen vybaven specifickými faktory virulence. Mimo střevo je E. coli téměř vždy patogenní. Biochemicky je to průměrně aktivní bakterie. Štěpí glukózu a laktózu za tvorby plynu, tvoří indol a neštěpí močovinu (ZAHRADNÍČEK, 003).

GREIF, GREIFOVÁ (004) zjistili u E. coli produkci lyzindekarboxylázy v důsledku toho vzniká kadaverin a také zjistili produkci putrescinu. Dále byla zjištěna produkce tyrozin- a histidindekarboxylázy (SIILA SANTOS, 996). Rod Hafnia Gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinky, jejich optimální teplota růstu je 30-37 C (SEDLÁČEK, 007). Jediným druhem je Hafnia alvei, která je přirozeným patogenem včel (ZAHRADNÍČEK, 003). Podílí se na kažení potravin (GÖRNER, VALÍK, 004). Produkce histaminu byla zjištěna v mletém mase a v rybách (SHALABY, 996). Rod Klebsiella Gramnegativní, fakultativně aerobní tyčinky vyskytující se jednotlivě nebo v řetízcích. Optimální teplota růstu je 37 C (SEDLÁČEK, 007). Je blízká rodu Enterobacter se kterým sdílí řadu charakteristik. Je ale lépe adaptovaná i na život mimo střevo (ZAHRADNÍČEK, 003). Mezi nejvýznamnější druhy patří Klebsiella oxytoca a Klebsiella pneumonie. Klebsiella pneumonie bývá přítomna ve střevním traktu člověka a zvířat, v půdě a ve vodě. Za vhodných podmínek může produkovat enterotoxiny s podobnými vlastnostmi jako mají enterotoxiny E. coli (GÖRNER, VALÍK, 004). BOVER-CID, HOLZAPFEL (999) zjistili u bakterie Klebsiella oxytoca produkci histaminu a kadaverinu. Rod Leclercia Gramnegativní, pohyblivé tyčinky s optimální teplotou růstu 37 C. Jsou indol a ornitindekarboxyláza pozitivní, negativní arginindekarboxyláza. Zástupce: L. adecarboxylata (SEDLÁČEK, 007). Rod Pantoea Gramnegativní, pohyblivé tyčinky, jejich optimální růstová teplota je 30 C. Netvoří plyn, indol negativní. Většinou produkuje žlutý pigment. Oportunní patogen člověka, některé jsou fytopatogenní. Zástupce: P. aglomerans (SEDLÁČEK 007). Rod Plesiomonas Gramnegativní tyčinky, pohyblivé pomocí polárních bičíků. Optimální teplota růstu je 37 C. Netvoří plyn, oxidáza i kataláza pozitivní. Produkují indol a dekarboxylují lyzin

a ornitin. U člověka způsobuje průjmová onemocnění a příležitostně oportunní infekce. Rod obsahuje pouze jeden druh: P. schigeloides (SEDLÁČEK, 007) a u něj byla zjištěna produkce histidindekarboxylázy (SHALABY, 996). Rod Proteus Gramnegativní, pohyblivé, fakultativně anaerobní tyčinky, optimální teplota růstu je 37 C (SEDLÁČEK, 007). Obecně se jedná o bakterie s mohutnou biochemickou, především proteolytickou aktivitou. Jde o saprofyty dokonale přizpůsobené k likvidaci organických zbytků. Výrazně štěpí močovinu, oxidačně deaminují fenylalanin a tryptofan, lyzin nedekarboxylují, jsou agrinindihydroláza negativní a také tvoří sirovodík (ZAHRADNÍČEK, 003, KALHOTKA 007). Vyskytují se ve střevním traktu člověka a zvířat, dále nacházíme v hnoji, půdě a znečištěných vodách. Hlavními zástupci jsou: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris a Proteus penneri, Proteus morganii (SEDLÁČEK, 007). U bakterií Proteus morganii a Proteus vulgaris byla zjištěna produkce histaminu v rybích výrobcích (SHALABY, 996). Rod Salmonella Jsou to gramnegativní, fakultativně anaerobní tyčinky. Optimální teplota růstu je 37 C, nicméně, některé kmeny jsou schopny růst i při teplotách 4 C (FERNANDES, 009). Na rostlinách, v hnoji a v potravinách přežívají někdy měsíce až rok a přitom si zachovávají svoji virulenci. V bujónové kultuře se devitalizují okamžitým zahřátím na 7 C a při 57 C 0 minut. Při pasteraci mléka a při pasteraci vaječné směsi jsou spolehlivě devitalizovány. Přenos na člověka je kontaminovanými potravinami. Do této skupiny patří salmonely náležející k sérovarům typhi, paratyphi A, B, C - původci břišního tyfu a S. enteriditispůvodce salmonelózy (GÖRNER, VALÍK, 004). Rod Shigella Jsou to gramnegativní, nepohyblivé tyčinky, které nefermentují laktózu. Mohou přežít při nízkém ph několik hodin (HEREDYA et al., 009). Jsou původci bacilární úplavice, kterou mohou způsobit při nízké infekční dávce 0 až 00 buněk. Je to onemocnění, které se vyznačuje střevními křečemi, krvavými průjmy a neurologickými příznaky jako jsou bolesti hlavy, letargie, zmatenost. Jde o nemoc tzv. špinavých rukou. Výrazným rozdílem oproti salmonelóze je, že u shigelózy jde o čistě lidskou infekci bez zvířecích rezervoárů 3

(ZAHRADNÍČEK, 003; HEREDYA et al., 009). U bakterie Shigella byla zjištěna produkce tyraminu (SILLA SANTOS, 996).... Čeleď Bacillaceae Rod Bacillus Zahrnuje grampozitivní, fakultativně anaerobní, pohyblivé, sporulující tyčinky s optimální teplotou růstu kolem 37 C (DE VOS et al., 009). Bakterie tohoto rodu nesnášejí nižší ph (GÖRNER, VALÍK, 004). Důležitým znakem tohoto rodu je schopnost tvořit jednu endosporu. Sporulace probíhá pouze za přítomnosti kyslíku, protože pro sporulaci získává buňka energii především oxidací zásobních lipidů z cytoplazmy (RŮŽIČKA, 003). Štěpí bílkoviny za vzniku amoniaku. Sacharidy fermentují s méně výraznou tvorbou kyselin a některé i s tvorbou plynu. Druhy: psychrotrofní - Bacillus insolitus, B. globisporus mezofilní - B. cereus, B. antracis, B. megaterium a jiné termofilní - B. stearothermophillus, B. coagulans, B. acidicaldarius, B. substilis, B. licheniformis (GÖRNER, VALÍK, 004). Bacillus cereus je kultivačně nenáročná, fakultativně anaerobní bakterie, schopná růst v širokém teplotním rozmezí 8-55 C a při ph 4,9-9,3 (RŮŽIČKA, 003). Kataláza pozitivní a oxidáza negativní. Citrát využívá jako jediný zdroj uhlíku. Deaminuje tyrozin (DE VOS et al., 009). Původním stanovištěm je půda a prach a jimi kontaminované potraviny rostlinného a živočišného původu jako masitá hotová jídla, rýže, zelenina, ale i mléko a mléčné výrobky, pudinky a jiné (GÖRNER, VALÍK, 004). B. cereus je producentem řady toxinů a enzymů např. fosfolipázy C, hemolyzin. Za vznik enterotoxikóz jsou zodpovědné enterotoxiny: průjmový a emetický toxin (RŮŽIČKA, 003). RODRIGUEZ-JEREZ et al. (994) cit. podle SHALABY (996) vyizolovali z italského sýra Bacillus macerans tvořící histamin. Bacillus stearothermophilus je schopen aktivního růstu za nepřístupu kyslíku, jeho spory jsou silně termorezistentní, takže často přežívají tepelný sterilační zákrok u nekyselých zeleninových a masozeleninových konzerv. Může být příčinou tzv. plynoprostého kysnutí nekyselých konzerv, neboť při vhodné teplotě tvoří značné množstvé kyselin. Intenzivně se rozmnožuje při teplotě 55-65 C (ŠILHÁNKOVÁ, 008). Bacillus coagulans bývá rovněž příčinou plynuprostého kažení teplem sterilovaných konzerv. Optimální teplota růstu je při 45-55 C (ŠILHÁNKOVÁ, 008). 4

Bacillus licheniformis je také fakultativně anaerobní, pohyblivá tyčinka, vyskytující se jednotlivě v párech nebo řetízcích. Teplota růstu se pohybuje v rozmezí od 5 do 50-55 C. Optimální ph růstu je mezi 5,7 až 6,8. Roste i při 7 % NaCl. Kataláza pozitivní, oxidáza variabilní. Citrát a propionát jsou využívány jako zdroje uhlíku pro většinu kmenů (LOGAN, DE VOS, 009). B. licheniformis patří mezi bacily s menší proteolytickou aktivitou (KALHOTKA et al., 0). Spolu s B. cereus, B. subtilis a dalšími druhy je B. licheniformis častým kontaminantem syrového i tepelně ošetřeného mléka a mléčných výrobků. (FRANK, 00; GRIFFITHS, 009). KALHOTKA et al. (0) prokázali u testovaných izolátů Bacillus licheniformis dekarboxylázovou aktivitu pro tyrozin, tryptofan, fenylalanin a ornitin. Rod Clostridium Zahrnuje sporulující bakterie rostoucí za anaerobních podmínek. Vegetativní formy těchto bakterií mají tvar tyčinek a to poměrně velkých. Jsou grampozitivní, ale postupem času mohou jejich kultury grampozitivu ztrácet. Většinou jsou díky peritrichálně uloženým bičíkům pohyblivé. Bakterie se vyskytují obvykle jako saprofyté a účastní se hnilobných procesů. K jejich hojnému rozšíření v přírodě přispívá schopnost tvořit vysoce rezistentní spory, které jsou značně odolné vůči nepříznivým podmínkám zevního prostředí, jako je teplota, záření, vyschnutí a různé chemické látky. Energii získávají fermentačními procesy. Bohatá enzymatická výbava umožňuje většině klostrídiím rozkládat proteiny za vzniku hnilobných produktů (H S, NH 3 ) či kvasit sacharidy za vzniku kyseliny máselné, kyseliny octové, CO, H, proměnlivého množství alkoholu a acetonu (RŮŽIČKA, 003; GÖRNER, VALÍK, 004). K proteolytickým druhům patří: Clostridium botulinum typ A, C. sporogenes, C. histolyticum a jiné. A k sacharolytickým druhům patří: C. botulinum typ E, C. butyricum, C. felsineum, C. pasteurianum, C. tyrobutyricum, C. perfringens a jiné. Jen pár druhů je schopno vyvolat onemocnění člověka či zvířat, mezi něž patří botulismus, tetanus, sněť, enterotoxikózy, neurotoxikózy, sepse, které často komplikuje intoxikace bakteriálními toxiny a metabolickými produkty (RŮŽIČKA, 003; JOHNSON, 009). U bakterie Clostridium perfringes byla zjištěna produkce histaminu v rybách ( SHALABY, 996). 5

...3 Čeleď Pseudomonadaceae Rod Pseudomonas Zahrnuje obvykle mírně zahnuté gramnegativní, striktně aerobní tyčinky, které jsou většinou pohyblivé, oxidáza a kataláza pozitivní a biochemicky poměrně aktivní (ONDROVČÍK, 003; GÖRNER, VALÍK, 004; ŠILHÁNKOVÁ, 008). Řada druhů tvoří fenazinová barviva žlutých, zelených, modrých nebo červených odstínů, která uvolňují do růstového prostředí. Tím způsobují nežádoucí zabarvení potravin (např. modrání nebo červenání mléka). Přítomnost železa v médiu tvorbu pigmentů podporuje (ŠILHÁNKOVÁ, 008; FERNANDES 009). Jejich optimální teplota růstu je v rozmezí 5-30 C (PALLERONI, 005). U bakterií Pseudomonas spp. byly zjištěny pozitivní histidina tyrozindekarboxylázy (SILLA SANTOS, 996) a také produkce putrescinu (SHALABY, 996)....4 Čeleď Staphylococcaceae Rod Staphylococcus Zahrnuje grampozitivní, fakultativně anaerobní nepohyblivé koky s optimální teplotou růstu 30-37 C. Dokáže přežít i při nízkých teplotách, pasterace tuto bakterii devitalizuje. Většina kmenů stafylokoků roste v rozsahu ph 4, - 9,3 (FERNANDES 009, HEREDIA et al., 009). Bakterie je také velmi odolná na sůl (až 0 %), odolná proti dusitanům a schopná růst i při a w 0,83. Rod Staphylococcus má 47 druhů a poddruhů a v praxi se tradičně dělí podle jejich schopnosti koagulovat plazmu, na stafylokoky koagulázapozitivní a koagulázanegativní. Hlavní zástupce koagulázapozitivních stafylokoků je S. aureus, ten produkuje mnoho enzymů a toxinů, které zahrnují 4 hemolyziny, nukleázy, proteinázy, lipázy, hyaluronidázy a kolagenázy. S. auerus je nejčastější příčinou otravy vyvolané požitím tepelně stabilního enterotoxinu produkovaného v potravinách enterotoxigenním S. aureus. Tyto enterotoxiny jsou stabilní i při tepelném zpracování 00 C po dobu 30 minut. Potraviny ze kterých může být často stafylokoková otrava jsou hovězí a vepřové maso, klobásy, šunka, mléko, sušené mléko a další mléčné výrobky (ONDROVČÍK, 003; HEREDIA et al., 009). Potravinářsky významné jsou dva druhy koagulázanegativních stafylokoků Staphylococcus carnosus a S. xylosus. Tyto bakterie jsou součástí startovacích kultur pro výrobu masných výrobků (SEDLÁČEK, 007). Staphylococcus spp. byl identifikován jako histamin produkující bakterie v rybách (SILLA SANTOS, 996). 6

...5 Čeleď Micrococcaceae Rod Micrococcus Jsou grampozitivní, nepohyblivé, kataláza a oxidáza pozitivní a koaguláza negativní, striktně aerobní koky, uspořádané často v tetrádách (ČERNOHORSKÁ, 003). Produkují oranžovočervený pigment, redukují dusičnan a jsou halotoleratní - rostou v prostředí s 5 % NaCl. Jejich optimální teplota růstu je 5-35 C. Vyskytují se především v mléce a v mléčných výrobcích. Zvýšený počet bakterií poukazuje na nedostatečnou sanitaci. (GÖRNER, VALÍK, 004; SEDLÁČEK, 007). U mikrokoků byla zjištěna produkce histaminu (SILLA SANTOS, 996)... Bakterie mléčného kvašení (BMK) Tato skupina je tvořena 3 rody grampozitivních bakterií Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Lactobacillus, Lactosphaera, Leuconostos, Oenococcus, Pediococcus, Paralactobacillus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weisella (JAY et al., 005). Společným znakem bakterií mléčného kvašení je tvorba kyseliny mléčné z fermentovaných sacharidů. Dále je možno je třídit podle hlavních a vedlejších fermentačních produktů na homofermentativní (fermentovaný sacharid se přemění výlučně na kyselinu mléčnou) a heterofermentativní (fermentovaný sacharid se mění na kyselinu mléčnou asi 50 %, kyselinu octovou, oxid uhličitý a za určitých okolností i na ethanol). U některých rodů BMK je možné jako identifikační znak použít optickou otáčivost vzniklé kyseliny mléčné. Z morfologického hlediska se BMK vyskytují s menší pestrostí, nacházíme koky v párech, v krátkých a delších řetízcích, tyčinky izolované i v řetízcích (GÖRNER, VALÍK, 004). Laktokoky mají malou schopnost rozkládat aminokyseliny. Naproti tomu laktobacily katalyzují řadu přeměn aminokyselin. Enterokoky mají výraznou schopnost dekarboxylovat aminokyseliny na biogenní aminy (GÖRNER, VALÍK, 004). Laktobacily jsou považovány za producenty histaminu, tyraminu a putrescinu (SCHIRONE, 0). Enterokoky mohou produkovat vysoké koncentrace histaminu a tyraminu, ale pouze v případě, když potravina obsahuje tyto bakterie v množství 0 7 KTJ/g a v sýru, který zraje po dobu alespoň 6 měsíců (HASSAÏNE et al., 009). Slabými producenty aminů jsou i bakterie z rodu Propionibacterium, které jsou důležité při zrání tvrdých sýrů a pro tvorbu ok a některé laktobacily (L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. plantarum a jiné) (GÖRNER, VALÍK, 004). 7

Tabulka : Rody BMK, jejich fermentační typ a produkty (GÖRNER, VALÍK, 004) ROD TYP FERMENTACE HLAVNÍ PRODUKTY Lactococcus homofermentativní laktát Streptococcus homofermentativní laktát Pediococcus homofermentativní laktát Lactobacillus homofermentativní Laktát Leuconostoc heterofermentativní laktát: acetát: CO... Čeleď Lactobacillaceae Rod Lactobacillus Zahrnuje fakultativně anaerobní anebo mikroaerofilní nepohyblivé tyčinkovité BMK. (GÖRNER, VALÍK, 004). Mohou se množit i v kultivačním prostředí s hodnotou ph 5. Jestli však ph poklesne pod 4, růst většiny laktobacilů se zastavuje. Neprodukují enzym katalázu, který katalyzuje rozklad peroxidu vodíku na kyslík a vodu (KLABAN, 00). Jejich hlavním metabolitem fermentace je kyselina mléčná, ale i octová, etanol a CO (GÖRNER, VALÍK, 004). Rod Lactobacillus se podle fementace dělí na 3 skupiny: Skupina I: Jsou obligátně homofermentativní laktobacily, které hexózy fermentují na kyselinu mléčnou. Jejich optimální teplota růstu je mezi 30-45 C a optimální ph 5,5-6, (GÖRNER, VALÍK, 004). Tyto druhy jsou uvedeny v tabulce. U bakterie Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus byla zjištěna produkce tyrozindekarboxylázy a tvorba histaminu. U bakterie Lactobacillus acidophilus byla zjištěna tvorba histidindekarboxylázy. U bakterie Lactobacillus heleveticus byla zjištěna tvorba histaminu (SHALABY, 996). Skupina II: Jsou fakultativně heterofermentativní laktobacily, které hexózy fermentují na kyselinu mléčnou. Při nedostatku glukózy produkují některé druhy kyselinu octovou a kyselinu mravenčí. Jsou to mezofilní, grampozitivní, mikroaerofilní tyčinky a jejich optimální teplota růstu je 8-3 C (GÖRNER, VALÍK, 004). Tyto druhy jsou uvedeny v tabulce 3. U bakterie Lactobacillus plantarum byla zjištěna produkce histaminu. U bakterie Lactobacillus casei a Lactobacillus curvatus byla zjištěna tvorba histidindekarboxyláza (SHALABY, 996; RUSSO, 00). Skupina III: Jsou obligátně heterofermentativní laktobacily, které fermentují hexózy na kyselinu mléčnou a kyselinu octovou, etanol a CO. Pentózy fermentují na kyselinu mléčnou 8

a kyselinu octovou. Jejich optimální teplota růstu je 8-3 C (GÖRNER, VALÍK, 004). Tyto druhy jsou uvedeny v tabulce 4. U bakterie Lactobacillus buchneri byla zjištěna produkce histaminu a u Lactobacillus brevis produkce tyraminu (SHALABY, 996; RUSSO, 00). Tabulka : Skupina I obligátně homofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 004) upraveno Druh ssp. Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky L. delbrueckii ssp. Rostl. mat. fermentovaný při vyšších teplotách (40-53 C) delbrueckii L. delbrueckii ssp. Jogurt a sýry bulgaricus L. delbrueckii ssp. Kyselé mléko, sýry, lisované kvasnice, obilní zápary lactis L. helveticus Ementálská kultura, tvrdé sýry (ementálský typ), kyselé mléko, maximum při 50-5 C L. acidophilus Intestinální trakt lidí a zvířat, ústní dutina lidí L. farciminis Masné výrobky (tepelně neošetřené), pekárenský kvas, snáší 0 - % NaCl L. salivarius Ústní dutina a intestinální trakt lidí a zvířat 9

Tabulka 3: Skupina II fakultativně heterofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 004) upraveno Druh ssp. Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky L. bavaricus Kysané zelí, růst mezi - 37 C (L. sake) L. casei ssp. Mléko, sýry, ml. výrobky, pek. kvas, kravský hnůj, siláž, intestinální casei trakt a ústní dutina lidí L. casei ssp. Dtto rhamnosus L. curvatus Mléko, masné výrobky, kysané zelí, kravský hnůj, pek. kvas L. plantarum Mléčné výrobky, siláž, kysané zelí a jiná zelenina, pek. kvas, intestinální trakt a ústní dutina lidí, kravský hnůj L. sake Kys. zelí a jiné ferm.rostl. produkty, masné výrobky, pek. kvas, původně (L. bavaricus) izolován z kvasnic na výrobu japonského saké, roste i při - 4 C Tabulka 4: Skupina III. Obligátně heterofermentativní (GÖRNER, VALÍK, 004) upraveno Druh ssp. Prostředí ve kterém se převážně vyskytuje a jiné charakteristiky L. brevis Mléko, sýry, kysané zelí, pek. kvas, intestinální trakt a ústní dutina lidí L. buchneri Mléko, sýry, fermentovaný rostlinný materiál, ústní dutina lidí L. fermentum Kvasnice, mléčné výrobky, pek. kvas, fermentovaný rostlinný materiál, kravský hnůj, intestinální trakt a ústní dutina lidí L. kefir Kefírová zrna a kefír L. reuteri Masné výrobky, lidské a zvířecí fekálie Rod Pediococcus Jsou to grampozitivní, aerobní až mikroaerofilní, nepohyblivé koky, jež se často seskupují do čtveřic neboli tetrád. Při zkvašování sacharidů tvoří jenom kyselinu mléčnou, jsou tedy homofermentativní. Rostou optimálně při ph prostředí 5-5,8. Také poměrně dobře snášejí velmi široké teplotní rozmezí od 5-45 C. Jejich původním stanovištěm jsou rostliny a z nich se dostávají do příslušných potravin. V některých škodí, v jiných jsou součástí fermentační mikroflóry. Zpravidla se vyskytují ve společenstvu s laktokoky, s leukonostoky 0

a laktobacily. Pozitivní úlohu mají pediokoky při fermentaci rostlinných potravin: zelí, zeleninových směsí, v sójových a rýžových fermentovaných produktech. Při kvašení zelí se uplatňuje jejich acidotolerantnost. Rozmnožují se v třetí fázi kysnutí, při nižších teplotách i v prostředí které obsahuje,5 - % kyselin. Fermentují přitom i těžce fermentovatelné pentózy (arabinóza, xylóza). Pediokoky jsou také složkou bakteriálních kultur používaných při výrobě a zrání klobás a salámu. Negativně působí v pivovarnictví, neboť produkují aceton, který se oxidací vzdušným kyslíkem mění na aromatický diacetyl. Ten nepříznivě ovlivňuje chuť piva. Do piva se dostávají ze sladovnického ječmene a z něho vyrobeného sladu (GÖRNER, VALÍK, 004). Nejznámější druhy jsou Pediococcus pentosaceus, P. acidilactici a P. halophilus snášející až 5 % koncentraci NaCl. V Japonsku se uplatňuje při výrobě sýru miso ze sojové mouky. Dále lze uvést i druhy P.dextrinicum, P. inopinatus a P. parvulus (KLABAN, 00).... Čeleď Streptococcaceae Rod Lactococcus Tento rod byl vyčleněn z rodu Streptococcus. Laktokoky jsou grampozitivní ovoidní buňky vyskytující se v párech nebo v řetízcích, fakultativně anaerobní, homofermentativní. Optimální teplota růstu je 30 ºC. Jsou součástí čistých mlékařských kultur používaných při výrobě smetany, másla, kysaného mléka, tvarohů a sýrů (GÖRNER, VALÍK, 004). Lactococcus lactis ssp. lactis V bujónové kultuře s glukózou dosahuje při teplotě 30 ºC konečnou hodnotu 4,5 až 4 ph. Je schopen růst na krevním agaru se 40 % žluči, neroste však v přítomnosti 6,5 % NaCl. Kyselinu citrónovou neštěpí, netvoří aceton, diacetyl a ani CO. Pepton štěpí ta tvorby amoniaku. Pro růst v syntetickém médiu vyžaduje přítomnost 4 až 5 vitamínu skupiny B, 0-3 aminokyselin, octan, oleát a lipoát. Některé kmeny produkují bakteriocin nisin, v potravinářství je používaný na inhibici grampozitivních bakterií. Některé kmeny produkují aminokyselimu leucin za vzniku 3- metylbutanalu, který je nosnou aromatickou látkou, která určuje sladkou chuť v mléčných produktech. Je také součástí kyselinotvorné složky všech typů základních smetanových kultur používaných v mlékárenské výrobě (KLABAN, 00; GÖRNER, VALÍK, 004).

Lactococcus lactis ssp. cremoris Má některé charakteristické vlastnosti, kterými se liší od Lactococcus lactis ssp. lactis: má nižší optimální teplotu - udává se 8 ºC, tvoří měřitelné množství CO, morfologicky se vyznačují zpravidla většími buňkami a tvorbou dlouhých řetízků a laktózu fermentuje pomaleji. Roste v médiu s obsahem % NaCl, ale při 4 % už ne. Je proto typickým smetanovým nebo mléčným streptokokem, ne však univerzálním sýrařským mikroorganismem. V 4 % roztoku peptonu neuvolňuje amoniak. Kasein nepatrně peptonizuje (GÖRNER, VALÍK, 004). Rod Leuconostoc Jsou to grampozitivní, nesporulující, nepohyblivé koky ovoidního tvaru seskupené do dvojic nebo řetízků. Jsou fakultativně anaerobní, nehemolyzují, jsou kataláza negativní a neredukují dusičnan na dusitan. Kolem svých buněk většinou vytvářejí slizové pouzdro. Jejich optimální teplota růstu je v širokém rozmezí 0-30 ºC, některé rostou i při teplotě kolem 5 ºC. V živných půdách vyžadují přítomnost růstových faktorů, aminokyselin a vitamínů skupiny B. Růst je podmíněný přítomností fermentovatelného sacharidu. Většina leukonostoků disimiluje za přítomnosti fermentovatelného sacharidu citran za tvorby diacetylu, acetonu a,3 butylenglykolu. Diacetyl je v mlékařství významnou aromatickou látkou. Naproti tomu v pivu a ve víně je nežádoucí. Kmeny leukonostoků tvořící dextranový sliz mají v buněčné stěně enzym dextran - sacharázu. Bakterie z rodu Leuconostoc se zúčastňují i při fermentaci zeleniny a plodů, například zelí. Jsou též významnou složkou mikroflóry masa a masných výrobků (KLABAN, 00; GÖRNER, VALÍK, 004). Mezi významné leukonostokoky patří: L. mesenteroides ssp. cremoris, L. mesenteroides ssp. dextranicum, L. mesenteroides ssp. mesenteroides L. mesenteroides ssp. cremoris Je součástí tzv. máslařské kultury. Produkuje diacetyl dodávající vyrobenému máslu příjemné aroma. Je syntetizován z kyseliny citrónové jako vedlejšího produktu mléčného kvašení. Netvoří za sacharosy sliz. V bujónu tvoří zpravidla dlouhé řetízky sedimentující na dno jako vločky. Z rodu Leuconostoc je nejméně aktivní a nejnáročnější na růstové faktory, vitamíny skupiny B a aminokyseliny. Upřednostňuje redukční prostředí a teploty 8-5 C (KLABAN, 00; GÖRNER, VALÍK, 004).

L. mesenteroides ssp. dextranicum Je méně náročný na živiny a růstové faktory. Disimiluje citran a používá se v mlékárenské technologii jako složka smetanového zákysu na produkci aromatického diacetylu. Tento leukonostok se také používá k výrobě dextranu, což je vysokomolekulární polymer glukózy s relativní molekulovou hmotností 5 tisíc až 0 miliónů. Používá se jako náhrada krevní plazmy k udržení funkce krevního oběhu při akutně vzniklých krvácivých stavech s velkou ztrátou krve. Dextran se však také využívá v oboru tzv. gelové chromatografie k dělení různých směsí bílkovin (KLABAN, 00; GÖRNER, VALÍK, 004). Rod Streptococcus Ve starší klasifikaci se rod Streptococcus dělí na šest skupin. Pyogenní streptokoky, orální streptokoky, jiné streptokoky, anaerobní streptokoky, enterokoky a mléčné streptokoky. Fermentují sacharidy hlavně na kyselinu mléčnou a malé množství kyseliny octové, mravenčí, ethanolu a CO. V alkalickém prostředí produkují z glukózy významné množství ethanolu, kyseliny octové a mravenčí. Některé druhy fermentují i organické kyseliny (malonová, citrónová) a aminokyseliny (serin a arginin). Neredukují dusičnan na dusitan. Jsou náročné na živiny, vyžadují pro svůj růst a metabolismus aminokyseliny, peptidy, puriny, pyrimidiny a vitamíny (GÖRNER, VALÍK, 004). Streptococcus salivarius ssp. thermophilus Má velký význam pro mlékárenský průmysl, kde je běžně používaný jako složka zákysových kultur pro výrobu jogurtu, kysaného mléka, a mnoha druhů sýrů. (MARINO et al., 008). Nesnáší zvýšené koncentrace NaCl (nad %). Je velmi citlivý na antibiotika a jiné inhibiční látky. Tvoří kulovité až vejčité buňky vyskytující se v párech nebo v řetízcích. Roste v teplotní rozmezí 0-50 ºC, jeho optimální teplota je mezi 40-50 ºC, dohromady dobře roste při 37 ºC. Nejvhodnější prostředím pro jeho kultivaci je mléko. V syntetických mediích je náročný na živiny a růstové faktory. Mléko sráží při teplotě do 30-45 ºC do jednoho dne. Čerstvé kultury dobře fermentují sacharózu a laktózu. Glukózovou část laktózy fermentuje na kyselinu mléčnou a galaktózu vylučuje do prostředí (GÖRNER, VALÍK, 004). U několika kmenů S. thermophilus byla popsána produkce tyraminu (MARINO et al., 008). 3

...3 ČeleďEnterococcaceae Rod Enterococcus Zástupci rodu Enterococcus patří do skupiny mikroorganismů označovaných jako bakterie mléčného kvašení, které mají význam v životním prostředí, potravinách i klinické mikrobiologii (FRANZ et al., 003). Z lékařského hlediska jsou prakticky významné 4 druhy: Enterococcus faecalis, E. faecium, E. durans, E. avium (KLABAN, 999). Enterokoky jsou grampozitivní, nesporulující, fakultativně anaerobní koky, které se vyskytují jednotlivě, v párech anebo v řetízcích (DUCKOVÁ et al., 008). Enterokoky jsou schopny růst v bujónu v přítomnosti 6,5 % NaCl, při ph 9, 6, 40 % žlučových kyselin a přežívají 30 minutový záhřev při 60 C (GARDINI, 00). Z potravinářského hlediska je z těchto kritérií významná značná odolnost vůči zvýšené koncentraci soli v potravinách a tím i nízkým hodnotám a w a skutečnost, že může přežívat nižší pasterační a termizační teploty (GÖRNER, VALÍK, 004). Enterokoky v potravinářské mikrobiologii na první pohled působí protichůdně. Ve fermentovaných potravinách mají probiotické vlastnosti, jsou schopny tvořit bakteriociny nazývané enterociny, které působí inhibičně například na Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Vibrio cholera, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens. Dále jsou potřebné při zrání sýrů a vytváření jejich aroma, pravděpodobně v důsledku jejich proteolytické, lipolytické aktivity a rozkladu kyseliny citrónové na diacetyl, acetoin a dalších důležitých prchavých látek (GREIFOVÁ et al., 003; DUCKOVÁ et al., 008). Naopak v nefermentovaných potravinách poukazují na nedostatečné zahřátí suroviny a na nedostatečnou sanitaci výrobního zařízení (GÖRNER, VALÍK, 004). Tyto mikroorganismy podporují hromadění - fenylethylaminu (SUZZI, GARDINI, 003). Dále v sýrech typu čedar významnou proteolýzu vykazoval hlavně E. faecalis. Aminokyselinu tyrozin dekarboxyluje na biogenní amin tyramin (SILLA SANTOS, 996; GÖRNER, VALÍK, 004). Některé druhy enterokoků vykazují i lyzin-, histidin- a ornithindekarboxylázovou aktivitu (VALENZUELA et al., 009). LADERO et al. (0) zjišťovali obsah termorezistentních kmenů laktobacilů a enteokoků v mléce po proběhlé pasteraci a nejvyšší odolnost ukázala bakterie E. durans. Tato bakterie je nejběžnější enterokok v mléce, což znamená, že pokud je přítomná v surovině, může přežít pasteraci a může růst během zrání sýrů, což může přispívat k akumulaci tyraminu (LADERO et al., 0). DE PALENCIA et al. (0) zjistili, že tyramin produkující kmen IPLA655 E. durans, který byl obsažen v sýru je schopen přežít a produkovat tyramin během průchodu GIT a proto může přispět k obsahu tyraminu v hostiteli. 4

...4 Čeleď Propionibacteriaceae Rod Propionibacterium Zahrnuje druhy tvořící grampozitivní, nepohyblivé, nesporulující, anaerobní až aerotolerantní bakterie. Sacharidy fermentují vždy na propionovou kyselinu spolu s octovou kyselinou a některými dalšími organickými kyselinami a s CO a H O. Některé druhy se používají pro výrobu kvašených mléčných výrobků nebo pro kvasnou výrobu propionové kyseliny, která má silné protiplísňové účinky. Příslušnící tohoto rodu jsou také součástí sýrařské kultury při výrobě ementálského typu (GÖRNER, VALÍK, 004; ŠILHÁNKOVÁ, 008). U bakterie Propionibacterium byla zjištěna tvorba histaminu (SHALABY, 996)..3 Biogenní aminy Biogenní aminy (BA) jsou nízkomolekulární bazické dusíkaté látky vznikající v potravinách a potravinových surovinách nejčastěji dekarboxylací aminokyselin nebo aminací a transaminací aldehydů a ketonů. Tyto organické báze se mohou tvořit působením nativních enzymů potravin nebo činností bakteriálních dekarboxyláz (SILLA SANTOS, 996; PALEOLOGOS et al., 004; KOMPRDA, 005). Pozitivně dekarboxylující mikroorganismy mohou být součástí přirozené mikroflóry potravin nebo mohou být přítomny jako důsledek kontaminace při zpracování, výrobě a skladování potravin (GREIF, GREIFOVÁ, 004). Dle chemické struktury se BA člení do několika skupin. Tabulka 5: Rozdělení biogenních aminů (KALAČ, KŘÍŽEK, 998) Chem.struktura Biogenní amin Aminokyselina ALIFATICKÉ Putrescin (PUT) Ornitin (Orn) Kadaverin (CAD) Lysin (Lys) AROMATICKÉ Tyramin (TYR) Tyrozin (Tyr) -fenylethylamin (FEA) Fenylalanin (Fea) HETEROCYKLICKÉ Histamin (HIS) Histidin (His) Tryptamin (TRY) Tryptofan (Try) POLYAMINY Spermin (SPM) Ornitin (Orn) Spermidin (SPD) Ornitin (Orn) Agmatin (AGM) Arginin (Arg) Putrescin (PUT) Arginin (Arg) 5

Z histidinu vzniká jako produkt dekarboxylace histidindekarboxylázou histamin. Z lyzinu vzniká působením lyzindekarboxylázy kadaverin. Dekarboxylací argininu arginindekarboxylázou vzniká agmatin. Dekarboxylací fenylalaninu fenylalanindekarboxylázou vzniká -fenylethylamin, z tyrosinu činností tyrosindekarboxylázy tyramin. Dekarboxylací tryptofanu tryptofandekarboxylázou vzniká tryptamin (VELÍŠEK, 00). Putrescin může vznikat způsoby: buď přímo z ornitinu působením ornitindekarboxylázy, což je hlavní cesta nebo nepřímo z argininu přes agmatin působením ureohydrolázy (KALAČ, KŘÍŽEK, 005). Putrescin je řazen i mezi polyaminy, protože je přímým meziproduktem syntézy sperminu a spermidinu (KOMPRDA, 005). Polyaminy jsou tedy BA, které nevznikají bakteriální činností, ale biochemickou syntézou v živých organismech od bakterií po člověka (KALAČ, KŘÍŽEK, 005). Biosyntéza polyaminů vychází z aminokyselin argininu či ornitinu, které dekarboxylací dávají vznik agmatinu a diaminu putrescinu. Polyaminy spermidin a spermin vznikají z putrescinu připojením aminopropylových zbytků vzniklých z S-adenozylmetioninu po jeho dekarboxylaci (PROCHÁZKA et al., 998). Podle GREIFA a GREIFOVÉ (998) biogenní aminy v potravinách mohou být i fyziologického původu vzniklé aminací aldehydů a ketonů. Tvorba BA z aldehydů je možná dvěma cestami: redukční aminací a transaminací aldehydů a ketonů pomocí aminotransferáz. Celkový počet vzniklých biogenní aminů závisí na typu potraviny a na počtu a druhu přítomných mikroorganismů. Situace je komplikovaná tím, že uvnitř jednotlivých druhů existují desítky kmenů, které se mohou v této vlastnosti lišit. Uvádí se, že rozdíly mohou být až tisícinásobné. To pak způsobuje, že obsahy jednotlivých aminů v určitém druhu potraviny kolísají v širokém rozpětí nejen mezi jednotlivými výrobci, ale i mezi šaržemi stejného výrobce (BRINK et al., 990; KALAČ, KŘÍŽEK, 00)..3. Faktory ovlivňující růst mikroorgasnimů s dekarboxylázovou aktivitou a tvorbu biogenních aminů Produkce BA je komplexní jev, který závisí na několika proměnných faktorech, jako je například přítomnost BA - produkujících mikroorganismů, jejich proteolytické a dekarboxylační činnost, doba zrání a skladování, atd. Nicméně, podobně jako jiné chemicko - fyzikální podmínky (např. dostupnost aminokyseliny, teplota, ph nebo koncentrace soli), je obtížné změnit tyto parametry, protože jsou vlastní procesu fermentace. To jasně ukazuje, že klíčové akce, aby se zabránilo hromadění BA je třeba řešit směrem k snížení počtu 6

mikroorganismů produkující BA během výroby sýru (LINARES 0). K nejdůležitějším faktorů, které ovlivňují růst mikroorganismů a tvorbu BA patří: Dostupnost substrátu, aktivita vody, teplota, ph, koncentrace soli, redox potenciál a přístup kyslíku, doba zrání a skladování, startovací kultury, přísná aplikace hygienických zásad získávání surovin a i při jejich následném zpracováním, tepelné ošetření a mléka, homogenizace..3.. Dostupnost substrátu Význam má nejen přítomnost volných aminokyselin, ale také přítomnost využitelných cukrů. Jako optimální je v této souvislosti uváděna koncentrace glukózy 0,5 % (SILLA- SANTOS, 996). BOVER-CID et al. (008) nezjistili výraznější vliv dostupnosti glukózy na produkci tyraminu u Lactobacillus curvatus, přičemž mírně vyšší produkce byla zaznamenána v prostředí s vyšší koncentrací glukózy..3.. Aktivita vody Voda je základní složkou živé hmoty. Činí až 80 % živé váhy bakteriální buňky. Stupeň dostupnosti vody se označuje jako vodní aktivita a w. Matematicky se vyjadřuje jako podíl tlaku vodní páry nad příslušným roztokem vůči tlaku vodní páry nad čistou vodou. Čistá voda má a w =. Je zřejmé, že čím vyšší je koncentrace rozpuštěných látek, případně čím vyšší je osmotický tlak, tím nižší je vodní aktivita (a w ) (VOTAVA, 00). Hlavní význam vodní aktivity z hlediska mikrobiologie spočívá v tom, že určuje, zda v dané potravině může nebo nemůže dojít k pomnožování mikroorganismů (BARTL, 00). Mikroorganismy ke svému životu potřebují určité hodnoty a w. Optimální hodnota a w je pro většinu mikroorganismů a w > 0,98. Při snížení hodnoty a w prostředí odnímáním vody (sušením, uzením), přídavkem soli, cukru, mrazením atd. se koncentrace mikroorganismy využitelné vody snižuje a jejich růst je částečně nebo úplně inhibovaný. Každý druh nebo dokonce i typ mikroorganismu má určitou limitní hodnotu a w a pod tuto hodnotu již není schopen růstu ani pomnožování a není schopen ani vytvářet toxin. Minimální hodnoty a w, které mikroorganismy potřebují pro svůj růst, jsou do značné míry spoluurčované i s dalšími faktory jako je ph, teplota a parciální tlak kyslíku (BARTL et al., 003; GÖRNER, VALÍK, 004). Limitující hodnota a w pro různé druhy mikroorganismů je různá. Obecně lze říct, že bakterie vyžadují pro růst více dostupné vody, tj. prostředí s vyšší a w, kvasinky a plísně jsou 7

tolerantní k nižším hodnotám a w. Růst většiny patogenů je inhibován při a w < 0,9. Minimální hodnota probakterie působící kažení potravin je 0,9-0,9, pro kvasinky 0,87-0,94 a pro plísně 0,7-0,8. Převážná část mikroorganismů není schopna růst při a w pod 60 (BARBOSA et al., 007). Řada mikroorganismů má schopnost reagovat na sníženou hodnotu a w a upravovat si osmotický tlak protoplazmy. Pro běžnou potravinářskou praxi to ale nemá význam, protože zvýšení osmotolerance je nepatrné (BARTL et al., 003). Mezi aktivitou vody a produkcí biogenních aminů byl zjištěn pozitivní vztah. Vysoké hodnoty vodní aktivity tedy podporují dekarboxylázovou aktivitu a tím i produkci biogenních aminů (KŘÍŽEK, KALAČ, 998). Tabulka 6: Minimální hodnoty a w pro růst mikroorganismů (GÖRNER, VALÍK, 004) Interval Skupina Min. Příklady mikroorganismů (druh nebo rod) Hodnot a w mikroorganismů Hodnota a w 0,97-0,95 bakterie 0,97 0,96 0,95 Pseudomonas spp. C. botulinum typ E., Acinetobacter Lactococcus, E. coli, Klebsiella, Shigella 0,94-0,9 většina bakterií 0,94 Salmonella, Enterobacteriaceae, Bacillus, Clostridium, Microbacterium, Lactobacillus, Streptococcus, Pediococcus 0,94-0,87 kvasinky 0,94 0,88 0,87 Candida utilis Většina kvasinek kazící potraviny Debaromyces 0,90-0,86 grampozitivní koky 0,90 0,86 Micrococcus Staphylococcus aureus 0,93-0,80 plísně 0,93 0,83 0,8 0,80 Rhizopus nigricans Penicillium expansum Penicilium patulum Většina plísní kazící potraviny 0,80-0,75 halofilní bakterie 0,75 Halobacterium halobium 0,65-0,6 osmotolerantní/filní kvasinky 0,78-0,6 xerotolerantní/filní plísně 0,6 Zygosaccharomyces rouxii 0,78 0,77 0,75 0,7 0,70 0,69 0,6 Aspergillus flavus Aspergillus ochraceus Walemia sebi Aspergillus glaucus Europium chevalieri Chrysosporium fastidium Europium echinulatum 8