HYDRAGEL 5 PROTEINURIE Ref. 4115 2016/03
POUŽITÍ KITU HYDRAGEL 5 PROTEINURIE kit je určen ke klasifikaci proteinurie v nezahuštěné moči. Kit se používá ve spojení s poloautomatizovaným zařízením HYDRASYS. Elektroforéza na neutrálně pufrovaných SDS-agarózových gelech separuje močové bílkoviny podle jejich molekulové hmotnosti a zcela jasně odlišuje bílkoviny tubulární od bílkovin glomerulárního původu. Výsledek elektroforetického dělení proteinů obarvených kyselou violetí je vizuálně porovnáván s proteinovými markery v referenční stopě. Tímto způsobem lze identifikovat jednotlivé bílkoviny a proteinurii správně klasifikovat. Každý agarózový gel je určen k analýze 5-ti vzorků. Určeno pro diagnostické použití in vitro. POZNÁMKA : V tomto návodu se název "HYDRASYS" používá pro poloautomatické přístroje HYDRASYS a HYDRASYS 2. PRINCIP TESTU 1-14 V přebytku anionického detergentu SDS (Sodium Dodecyl Sulfate laurylsíran sodný) jsou bílkoviny změněny v komplexy obsahující SDS. V těchto komplexech dochází k rozrušení natívní struktury bílkovin a zaujetí uniformní struktury o stejném negativním elektrickém náboji na jednotku hmotnosti. Při elektroforéze na mediu s prosívacími vlastnostmi (HYDRAGEL 5 PROTEINURIE gely s vysokou koncentrací agarózy) dochází k rozdělení močových bílkovin dle jejich molekulární hmotnosti. Jednotlivé bílkoviny tubulárního původu (M.V. < 65-70 kda) jsou jasně odlišeny od glomerulárních (M.V. > 65-70 kda). Dle detekovaných bílkovin lze proteinurii klasifikovat jako tubulární, glomerulární a smíšenou. Nastavení parametrů procedury a citlivost barvení kyselou violetí umožňuje detekci proteinů bez předchozího zahuštění moče. Minimální detekční hladina je 1.5 mg/dl (15 mg/l) na frakci. REAGENCIE A MATERIÁL OBSAŽENÝ V KITU HYDRAGEL 5 PROTEINURIE VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. POLOŽKA KAT. Č. 4115 Agarózové gely (připraveny k použití) 10 gelů Pufrované proužky (připraveny k použití) 10 bal. po 2 ks Kyselá violeť (zásobní roztok) 1 lahv., 75 ml Diluent (připraveny k použití) 1 lahv., 1 ml Proužky filtračního papíru 1 bal., 10 ks OPTIMÁLNÍ ŘÍZENÍ VYSLEDOVATELNOSTI : Všechna činidla ze stejné sady se musejí používat společně. DOSAŽENÍ OČEKÁVANÝCH VÝKONŮ : Musí se dodržovat pokyny z příbalového letáku. 1. AGARÓZOVÉ GELY Agarózové gely jsou připraveny k použití. Každý gel obsahuje : agarózu ; tlumicí roztok ph 7.0 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Nosné medium pro elektroforézu bílkovin v moči. Skladujte v horizontální poloze v originálních ochranných obalech šipkou na přední straně krabice směrem nahoru. Lze skladovat při pokojové teplotě (15-30 C). Zamezte prudkým změnám teploty neskladujte v blízkosti oken nebo tepelného zdroje. Stabilní do doby exspirace vyznačené na krabici či štítcích na obalech gelů. NEMRAZIT A NECHLADIT! Nepoužívejte : (i) v případě nálezu krystalů nebo precipitátů na povrchu gelů a pokud struktura gelu v důsledku zmrazení změkne, (ii) jsou-li přítomny mikroby a plísně, (iii) abnormální množství tekutiny v obalu gelu (výsledek vypocení pufru z gelu v důsledku nesprávného skladování). 2. PUFROVANÉ STRIPY Pufrované houbovité proužky (stripy) jsou připraveny k použití. Každý obsahuje : tlumicí roztok s ph 7.0 ± 0.5 ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. Pufrované stripy slouží jako rezervoár pufru pro elektroforézu a zajišťují kontakt mezi gelem a elektrodami. Stripy skladujte při pokojové teplotě. Jsou stabilní do data exspirace vyznačeného na balení či lahvičkách. NEMRAZIT! Otevřené balení ani vyschlé stripy nepoužívejte! - 98 - SEBIA NÁVOD - Czech
3. KYSELÁ VIOLEŤ HYDRAGEL 5 PROTEINURIE - 2016/03 Lahvička zásobní kyselé violeti může být destilovanou nebo deionizovanou vodou zředěna až na 300 ml. Pracovní barvicí roztok po naředění obsahuje : kyselý roztok ph 2 ; kyselou violeť ; ethylenglykol ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K barvení gelů s rozdělenými bílkovinami po elektroforéze. DŮLEŽITÉ : Barvicí roztok je určen k obarvení pouze 10 gelů. Roztok vyměňte po 10 použitích k barvení. Zásobní i pracovní roztok se skladuje při pokojové teplotě nebo při 2-8 C v těsně uzavřených nádobách, tak aby nedošlo k odpařování. Zásobní roztok je stabilní do data exspirace vyznačeného na obalu, či na štítku lahvičky. Pracovní barvící roztok vydrží 6 měsíců. 4. DILUENT Ředící roztok je připraven k použití. Obsahuje : tlumicí roztok ph 7.0 ± 0.5 ; bromofenolová modř ; přídavné látky nezbytně nutné pro optimální provedení, v koncentracích pro člověka neškodných. K ředění a úpravě vzorků moči. Bromfenolová modř slouží jako praktický aplikační a migrační marker. Skladujte při pokojové teplotě. Je stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu kitu a na štítcích jednotlivých lahviček. V roztoku nesmí být sraženiny. 5. PROUŽKY FILTRAČNÍHO PAPÍRU Určeny k odsátí přebytečné tekutiny z povrchu gelů před aplikací vzorků. POTŘEBNÉ REAGENTY NEOBSAŽENÉ V BALENÍ VAROVÁNÍ : Viz bezpečnostní listy. 1. FYZIOLOGICKÝ ROZTOK Připravte 0.15 M (0.9 g/dl) roztok NaCl v destilované nebo v deionizované vodě. Používá se k ředění vzorků moče s koncentrací bílkovin > 0.2 g/dl (2 g/l). Vydrží asi 3 měsíce v těsně uzavřených láhvích, při pokojové teplotě. Při změně vzhledu, tj. výskytu zákalu způsobeného mikrobiální kontaminací, odstraňte. K prodloužení skladování lze přidat azid sodný 0.1 g/dl. 2. ODBARVOVACÍ ROZTOK Každá lahvička zásobního Odbarvovacího Roztoku (SEBIA, kat. č. 4540, 10 lahv. po 100 ml) je určena k přípravě 100 litrů pracovního odbarvovacího roztoku. Je výhodné připravovat jen 5 litrů pracovního roztoku doplněním 5 ml zásobního roztoku do 5 litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Po zředění vznikne odbarvovací roztok obsahující kyselý roztok ph 2. Roztokem se odstraňuje přebytečné množství barvičky a odbarvuje se pozadí agarózové plotny. Dále se používá k vyplachování barvící komory po vyčištění promývacím roztokem. K neutralizaci kyselé reakce odbarvovacího roztoku nalijte do prázdné nádoby na odpady 15 ml 50 % (w/w) komerčně dostupného roztoku NaOH ( 19 M NaOH). Skladování při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilita do doby exspirace vyznačené na obalu soupravy nebo na štítku lahvičky. Pracovní odbarvovací roztok je stabilní 1 týden při pokojové teplotě v uzavřené láhvi. Nepřidávejte azid sodný! Nepoužívat při změně vzhledu, vzniku zákalu nebo precipitátu v roztoku. Pro zabránění mikrobiální proliferace ve zředěném odbarvovacím roztoku, který má být skladován déle než dva týdny, přidejte 5 μl/dl roztoku ProClin 300 nebo roztoku CLEAN PROTECT (SEBIA, kat. č. 2059, 1 lahvička, 5 ml). Viz příbalový leták s návodem k použití roztoku CLEAN PROTECT. Pracovní odbarvovací roztok s přídavkem roztoku ProClin nebo CLEAN PROTECT je při pokojové teplotě nebo v chladničce v uzavřené nádobě stabilní do doby exspirace vyznačené na obalu sady nebo na štítku lahvičky. 3. PROMÝVACÍ ROZTOK PRO HYDRASYS Každá lahvička Promývací roztok pro HYDRASYS (SEBIA, kat. č. 4541, 10 lahviček po 80 ml) se ředí do 5 litrů destilovanou nebo deionizovanou vodou. Promývací pracovní roztok po zředění obsahuje : tlumicí roztok ph 8.7 ± 0.5. - 99 -
Slouží k čištění oddílu HYDRASYSu určeného k barvení. Při denním používání přístroje se doporučuje promývat barvící část jednou za týden. Viz příbalový leták. Skladujte zásobní i pracovní promývací roztok v uzavřených nádobách při pokojové teplotě nebo v chladničce. Stabilní do data exspirace uvedeného na štítcích lahviček s promývacím roztokem. Při známkách změny vzhledu pracovního promývacího roztoku, výskytu zákalu v důsledku mikrobiální kontaminace, roztok odstraňte. 4. KONZERVAČNÍ ROZTOK Připravte 15% roztok glycerinu v destilované (deionizované) vodě (obj./obj.). K prevenci poškození (pokrčení či roztržení gelu) v průběhu sušení a skladování. Skladuje se při teplotě místnosti nebo v chladničce v uzavřené láhvi. Tentýž roztok lze použít na 3 gely. Při změně vzhledu roztoku, tj. zákal po mikrobiální kontaminaci, roztok odstraňte. POZNÁMKY : Zkoušky provedené pro ověření reagentů prokázaly, že pro různé roztoky a použití přizpůsobeného vybavení pro rekonstituci objemu, nemají odchylky objemu ± 5 % z konečného objemu vliv na výsledek analýzy. Destilovaná nebo deionizovaná voda používaná k ředění roztoků musí být prostá bakteriální proliferace a plísní (použijte filtr 0,45 µm) a musí mít vodivost nižší než 3 µs/cm, což odpovídá rezistivitě vyšší než 0,33 MΩ x cm. NUTNÉ VYBAVENÍ 1. HYDRASYS Systém SEBIA : HYDRASYS 2 SCAN kat. č. 1200, HYDRASYS 2 kat. č. 1201, HYDRASYS 2 SCAN FOCUSING kat. č. 1202, HYDRASYS 2 FOCUSING kat. č. 1203, HYDRASYS kat. č. 1210 nebo kat. č. 1211 nebo HYDRASYS FOCUSING kat. č. 1212. 2. Souprava kontejnerů dodávaná s HYDRASYSem. 3. Univerzální držák gelu HYDRASYS pro poloviční gely SEBIA, kat. č. 1278, s HYDRASYS a HYDRASYS 2. 4. Pipety 5 µl, 20 µl a 200 µl. 5. Markery molekulární hmotnosti, např. : Molecular Mass Control, SEBIA, kat. č. 4781 nebo LMW Calibration kit, Pharmacia. ANALYZOVANÉ VZORKY Odběr a skladování vzorků Provádíme pouze analýzu čerstvých močí, sbíraných 24 hodin. Lze skladovat v chladničce ihned po odběru po dobu jednoho týdne. Zmražené vzorky vydrží až 1 měsíc. Zmražení s přídavkem HEPES 0.1 M (ph 6.75) a 0.02 g/dl azidu sodného zvyšuje stabilitu skladování vzorku. POZOR : Kyselinu boritou jako konzervans nepoužívejte. Zmražené vzorky po rozpuštění zanechávají na startu stopu z denaturovaných proteinů. vzorků Vezměte 20 µl diluentu (roztok je viskózní pozor na vznik bublinek během pipetování) a přeneste na dno mikrozkumavky nesmí zůstat na stěně. Přidejte 80 µl čisté moči a 5 vteřin promíchejte na vortexu. Vzorek nesmí obsahovat více než 2 g/l bílkovin. Při vyšší koncentraci se moč ředí fyziologickým roztokem a potom se pokračuje standardním způsobem. POZNÁMKA : Difúze vzorků moči do špičky aplikátorů může být narušena, pokud je moč (čistá nebo koncentrovaná) zakalená. V tomto případě se doporučuje odstranit částice působící zákal centrifugací (Postupujte podle obvyklých doporučení pro předanalytickou fázi pro analýzu vzorků moči) nebo filtrací (např. stříkačkový filtr 0.45 µm). POZNÁMKA : Odběrové zkumavky a centrifugační parametry pro biologické vzorky jsou popsány v dostupné dokumentaci k předanalytické fázi pro biomedicínskou analýzu (údaje poskytnuté výrobci for zkumavek, návody a doporučení k odběru biologických vzorků ). Nejsou-li v návodu k použití pro typ zkumavek, které mají být použity, nebo k centrifugaci uvedeny žádné pokyny, postupujte podle této dokumentace a v případě rozměrů zkumavek, které mají být použity, postupujte podle dokumentu SEBIA "Charakteristiky zkumavek používaných podle přístroje". Předanalytická fáze musí být provedena podle stavu poznání, různých doporučení, mimo jiné doporučení výrobců zkumavek a platných předpisů. PRACOVNÍ POSTUP HYDRASYS je multiparametrický, poloautomatizovaný systém. Automatizované kroky zahrnují postupně elektroforetickou migraci, sušení, barvení, odbarvování a konečné osušení gelové plotny. Manipulace se vzorky, gely, vkládání reagencií a nastavení přístroje k uvedení do chodu se provádí ručně. DODRŽUJTE PEČLIVĚ POKYNY UVEDENÉ V MANUÁLU HYDRASYS / HYDRASYS 2 SYSTÉMU. - 100 -
I. NASTAVENÍ MIGRACE 1. Zapněte HYDRASYS. 2. Vybalte gel. Je praktické položit gel na horní část uzavřené krabice s gely. 3. Jemně a rychle odsajte přebytek tekutiny z jamek pomocí proužku filtračního papíru. Strip umístěte tak, aby byl zarovnán s jamkami. 4. Napipetujte pečlivě 5 µl upraveného vzorku močí do každé jamky, bez přenesení bublin. Po každé aplikaci vyměňte (otřete) špičku pipety. Během pipetování se nesmíte dotknout dna jamek. 5. Otevřete víko migračního modulu a zvedněte migrační rámeček s elektrodami a nosičem aplikátorů nahoru. POzOR : Nikdy nezavírejte víko pokud je migrační rámeček nahoře! 6. Z menu přístroje umístěného v levé části klávesnice zvolte program migrace "1*5 PROTEINURIE" pro jeden gel nebo "2*5 PROTEINURIE" pro dva gely. 7. Vyjměte z ochranného obalu pufrované stripy uchopením za plastikové konce. Děrovanými konci plastikového vyztužení je upevněte na výstupky elektrodového nosiče. Plastikové vyztužení stripů musí směřovat k nosiči (viz Obr. 1). 8. Naneste 120 µl destilované nebo deionizované vody na dolní střední část rámečku vyznačeného na migrační plošině migračního modulu pro jeden gel nebo po 100 µl na dolní pravou i levou polovinu při použití dvou gelů. - Opřete gelovou plotnu (gelem nahoru) dolním okrajem o zarážku na spodní části vyznačeného rámečku (viz Obr. 2). - Nyní gel ohněte a pokládejte do vody tak, aby se voda rozprostřela rovnoměrně pod celým gelem bez vzduchových bublin. Gel musí být zarovnán s vyznačeným rámečkem (viz Obr. 2). 9. Snižte migrační rámeček dolů. V této pozici se pufrované stripy nedotýkají gelu. NA MIGRAČNÍ RÁMEČEK NETLAČTE DOLŮ SILOU! 10. Uzavřete víko migračního modulu. 11. Stisknutím tlačítka "START" označeného zelenou šipkou (levá strana klávesnice) je procedura ihned zahájena. DŮLEŽITÉ : Přesvědčte se, zda není blokován otvor vzduchové ventilace na pravé straně přístroje. MIGRACE POPIS AUTOMATICKÝCH ČINNOSTÍ Vzorek difunduje do gelu po dobu 10ti minut. Všechny části migračního rámečku jsou sníženy stripy s pufrem jsou v kontaktu s povrchem gelu. Proběhne migrace při konstantních 10 W pro jeden gel nebo při 20 W pro dva gely při 20 C regulovaných pomocí Peltierova efektu až do 60 Vh (asi 15 minut). Po zvednutí nosiče elektrod se elektrody odpojí. Hlasité pípnutí signalizuje odjištění víka migračního modulu. POZN. : Víko migračního modulu zůstává uzavřeno během všech migračních kroků. II. PŘÍPRAVA ZPRACOVÁNÍ GELU 1. Otevřete víko. 2. Zvedněte migrační rámeček, vyjměte pufrované stripy uchopením za plastikové konce a odstraňte je. 3. Vyjměte usušený gel(y) pro další zpracování. 4. Po každém použití otřete elektrody i migrační plochu vlhkým hadříkem nebo gázou a můžete začít nové dělení. 5. Vyjměte držák gelu z barvící komory, otevřete jej, umístěte usušenou gelovou plotnu (gelovou stranou dopředu) do žlábků obou jeho tyček a držák uzavřete. Ujistěte se, že plotna je umístěna správně uvnitř držáku (viz Obr. 3). DŮLEŽITÉ: Při barvení jednoho nebo dvou gelů HYDRAGEL 5 PROTEINURIE s HYDRASYS 2 je nezbytné použít univerzální držák gelu HYDRASYS, SEBIA, kat. č. 1278. 6. Vložte držák gelu do modulu na zpracování a barvení gelu. DŮLEŽITÉ : Před nastartováním programu pro zpracování a barvení zkontrolujte : - zda kontejner pro barvení obsahuje 300 ml barvícího roztoku, - zda kontejner pro odbarvování obsahuje nejméně 1 litr odbarvovacího roztoku, - zda kontejner na konzervační roztok obsahuje 300 ml tohoto roztoku, - zda kontejner na odpad není plný. Pro připojení přívodů reagencií se řiďte pokyny zobrazovanými na obrazovce přístroj (zvolte klávesu : REAGENT LINES). DŮLEŽITÉ : Nezapomeňte zablokovat nepoužité přívody. 7. Vyberte z menu přístroje barvící program "PROTEINURIE" a stiskněte "START" (zelená šipka na pravé straně klávesnice). Během barvení, odbarvování a sušení zůstává tento oddíl zajištěn. Po ochlazení je odjištění signalizováno hlasitým pípnutím ventilace je udržována až do vynětí držáku s gelem. III. ZÁVĚREČNÉ ZPRACOVÁNÍ 1. Vyjměte držák s gelem, otevřete jej a vyjměte osušený gel. 2. V případě potřeby očistěte zadní plastikovou stranu suchého filmu vlhkým, měkkým hadříkem nebo buničinou. KONTROLA KVALITY Doporučuje se zařadit na každou sérii vzorků kontrolu se známými hodnotami molekulárních hmotností. VÝSLEDKY Interpretace SEBIA doporučuje interpretaci gelu ihned po dokončení jeho zpracování. Kvalita gelu se s časem zhoršuje v závislosti na podmínkách skladování, včetně (světla, tepla...). Každá laboratoř musí definovat optimální podmínky mezi dokončením gelu a jeho interpretací na základě těchto podmínek prostředí laboratoře. Delší skladování gelů (na suchém místě a mimo světlo) je možné pouze pro účely archivace. Interpretace je kvalitativní viz LITERATURA. - 101 -
Fyziologická proteinurie Je slabá, 120 mg / 24 hod. bez signifikantního rozdílu mezi pohlavími. Hlavním proteinem je albumin sdružený se stopami transferinu a imunoglobulinů. Proteinurie nad 120 mg / 24 hod. musí být považována za patologickou. Měla by být vždy následována kvalitativní analýzou vyloučených proteinů. Glomerulární proteinurie Je charakterizována výskytem proteinů s molekulární hmotností > 65-70 kda (např. : albumin, transferin, Ig G) lokalizovanými mezi bodem aplikace vzorku a frakcí albuminu. Albumin je hlavní frakcí. Tubulární proteinurie Je charakterizována bílkovinami s molekulární hmotností < 65-70 kda lokalizovanými mezi albuminovou frakcí a anodickou stranou gelu např. : a-1 mikroglobulin, monoklonální volné lehké řetězce, ß-2 mikroglobulin, RBP (retinol binding protein), lysozym. U tubulární proteinurie je albumin druhořadou frakcí. Kromě monomerů (25 kda) mohou být přítomny dimery (50 kda) a vyšší polymerizované formy volných lehkých řetězců. Vzácně lze pozorovat jen jeden proužek polymerizovaných lehkých řetězců. K rozlišení polyklonálních volných lehkých řetězců od monoklonálních volných lehkých řetězců lze použít imunofixaci (HYDRAGEL 1/2/4 BENCE JONES kit SEBIA, kat. č. 4321, 4322 nebo 4324). K potvrzení přítomnosti lehkých řetězců v proužku, o nichž se dá předpokládat, že jsou polymery, by vzorky měly být ošetřeny redukující reagencií (např. : ß-merkaptoetanol), jež slouží k depolymerizaci lehkých řetězců a elektroforéza by měla být opakována. Přidejte 5 µl ß-Merkaptoetanolu 10ti-násobně naředěného destilovanou nebo deionizovanou vodou ke 100 µl moči, dobře promíchejte a přidejte diluent (viz vzorku). Smíšená proteinurie Vyznačuje se přítomností tubulárních i glomerulárních bílkovin. Omezení Zmražené a znovu rozmražené vzorky mohou zanechávat na startu stopu denaturovaných proteinů. Díky omezené rozlišovací schopnosti a citlivosti zónové elektroforézy, je možné, že některé monoklonální komponenty nebudou detekovány touto metodou. Problémy Pokud testy nevycházejí při dodržení veškerých instrukcí pro přípravu, skladování a provedení testu uvedených v příbalovém letáku, volejte Technicko- Servisní středisko vašeho dodavatele. Bezpečnostní datové listy soupravy činidel a informace o čištění a likvidaci odpadů, označování a bezpečnostní pravidla používaná společností SEBIA, obaly pro přepravu biologických vzorků a informace o čistění přístroje jsou k dispozici na webových stránkách SEBIA : www.sebia.com. HODNOTY Všechny elektroforeogramy byly hodnoceny vizuálně. Reprodukovatelnost Byly použity močové vzorky s tubulární, glomerulární a smíšenou proteinúrií. Kontrola molekulové hmotnosti (Pharmacia) byla aplikovaná vždy do jedné jamky každého gelu. Reprodukovatelnost na gelu Tři vzorky byly aplikovány do čtyřech jamek každého gelu. Reprodukovatelnost mezi gely Čtyři různé vzorky byly aplikovány na každý z 10-ti gelů stejné šarže. Reprodukovatelnost mezi šaržemi Čtyři různé vzorky byly aplikovány do čtyřech jamek každého gelu třech různých šarží. Po vizuální analýze elektroforeogramů nebyly pozorovány žádné rozdíly mezi opakováními. Přesnost Byl použit nemocniční močový vzorek (n = 90) a moče zdravých dospělých jedinců (n = 14). Močové proteiny, zvolené jako indikátory typu nefropatie (alfa 1-microglobulin, beta 2-mikroglobulin, volné & vázané kappa lehké řetězce a volné & vázané lambda lehké řetězce pro tubulární poškození, a Ig G, albumin a transferin pro glomerulární poškození), byly každý kvantitativně anylyzován v laboratoři klinické biochemie imunologickou metodou : nefelometricky (Beckman Array systém) nebo imunoenzymaticky (Abbot IMX system). Analýzy byly provedeny na čerstvých močových vzorcích. Vzorky pro elektroforetickou slepou analýzu byly ochlazeny a použity po čtyřech dnech po odběru. Výsledky kvantitativní proteinové analýzy byly interpretovány pro každou jednotlivou bílkovinu ve smyslu stanovení tubulárního, glomerulárního, nebo smíšeného (mixed, mixed mostly tubular or mixed mostly glomerular) poškození : od nulového poškození (hodnoty bílkoviny byly pod nebo na normální hodnotě) až po vážné poškození (> 5x normálních hodnot). Elektroforegramy byly hodnoceny vizuálně. Jednotlivé proteinové frakce byly identifikovány podle jejich molekulové hmotnosti. Tato byla stanovena podle kalibrační krivky založené na mobilitě márkrů molekulové hmotnosti (Pharmacia). Navíc, frakce byly semi-kvantitativně vizuálně ohodnoceny podle jejich intenzity, např., slabý, střední a silný proužek. Ve smyslu přítomnosti/nepřítomnosti nefropatie a jejího typu, interpretace výsledků kvantitativní proteinové analýzy (QPA) a SDS proteinové elektroforézy (SDS-EP) byla identická v 83 případech (80 %). V 19 případech (18 %) oba systémy detekovaly proteinurii, ale rozdílného typu, ponejvíce podle podtříd. Některé proteiny stanovené SDS-EP nebyly měřitelné pomocí QPA (např. lysozym) ; tyto případy demonstrují výhody SDS-EP, která poskytuje požadovaný elektroforeogram bílkovin přítomných v moči, oproti QPA, která je omezená na několik vybraných proteinů. Výsledky jsou sumarizovány níže : - 102 -
QPA SDS-EP Počet % pozn. N N 21 20.2 identická interpretace T T 6 5.8 identická interpretace G G 11 10.6 identická interpretace S S 22 21.1 identická interpretace S(T) S(T) 12 11.5 identická interpretace S(G) S(G) 11 10.6 identická interpretace S S(G) 6 5.8 identická interpretace N, S(G), nebo G(2) T, S(T), S(G) nebo S 4 3.8 SDS-EP poskytuje kompletní profil močových proteinů zatímco QPA měří pouze reprezentativní proteiny M, S(G) or S(T) G 9 8.6 méně citlivá detekce tubulárních proteinů pomocí SDS-EP N T 1 1 detekce protein degradačních produktů pomocí SDS-EP T S(T) 1 1 detekce protein polymerizačních produktů pomocí SDS-EP Celkem 104 100 N = normální ; T = tubulární ; G = glomerulární ; S = smíšená ; S(T) = smíšená hlavně tubulární ; S(G) = smíšená hlavně glomerulární. Citlivost Citlivost detekce byla stanovena z nejvyššího ředění albuminového a lysozymového roztoků, které dávalo pozorovatelnou frakci, na 1.5 mg/dl. ELEKTROFOREOGRAM ß2 Microglobulin (12 kda) Lysozyme (15 kda) RBP (21 kda) Proteins of tubular origin (< 70 kda) Free light chains (25 kda) α1 Microprotein (33 kda) Dimer of free light chains (50 kda) Albumin (70 kda) Transferrin (80 kda) Proteins of glomerular origin (> 70 kda) Ig G (160 kda) Ig A (165 kda) Haptoglobins α2 Macroglobulin - Ig M (800-900 kda) Application point - 103 -
BIBLIOGRAPHIE / BIBLIOGRAPHY 1. Cameron JS. 1987. The nephrotic syndrome. Am J Kidney Dis, 10 : 157-171. 2. Chopin N. 1991. Étude de la protéinurie. Inf Tech Biol, 1 : 23-28. 3. Cohen R, François B, Sabot JF, Bernard P, Picq JP, Adeleine P. Étude comparative de l immunoélectrophorèse urinaire et de quatre index de sélectivité glomérulaire au cours des glomérulopathies chroniques. 1985. Path Biol, 33 : 23-26. 4. Joachim GR, Cameron JS, Chwartz M, Belker EL. 1964. Selectivity of protein excretion in patients with the nephrotic syndrome. J Clin Invest, 43, 2332-2346. 5. Laemli U.K. 1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227 : 680-685. 6. Le Bricon T, Erlich D, Bengoufa D, Dussaucy M, Garnier JP, Bousquet B. 1998. SDS-agarose gel electrophoresis of urinary proteins : Application to multiple myeloma. Clin Chem., 44 : 1991-1997. 7. Le Carrer D. 1990. Protéinuries : Mise au point sur leur exploration biologique en 1990. L Eurobiologiste, 190 : 395-405. 8. Le Carrer D, Chopin N. 1994. Profil protéique urinaire : Proposition d un protocole d exploration biologique des protéinuries. Revue française des laboratoires, 269 : 29-37. 9. Le Carrer D, Nicolas A, Ducasse L. 1992. L analyse des protéinuries au laboratoire de biologie en 1992. Revue française des laboratoires, 225 : 41-47. 10. Linstedt G, Lindberg PA. 1974. Loss of tubular proteinuria pattern during urine concentration with a commercial membrane filter cell. Clin Chem Acta, 56 : 125-126. 11. Philipon C. 1989. Protéines urinaires : Intérêt clinique et interprétation. Technique et Biologie, 6 : 239-249. 12. Waller KV, Ward KM, Mahan JD, Wismatt DK. 1989. Current concepts in proteinuria. Clin Chem, 35 : 755-765. 13. Westermeier R., "Electrophoresis in Practice. A Guide to Theory and Practice", VCH Publishers, New York, NY, 1993. 14. Umbreit A, Wiedemann G. 2000. Determination of urinary protein fractions. A comparison with different electrophoretic methods and quantitatively determined protein concentrations. Clinica Chimica Acta, 297 : 163-172. 15. Wendling A. Procédures de diagnostic ou de dépistage : Justification et validité d un test de diagnostic ou de dépistage-sensibilité-spécificité. Impact-Internat, 1986 ; Sept : 93-97. - 154 -
sebia sebia HYDRAGEL 5 PROTEINURIE - 2016/03 SCHÉMAS / FIGURES Figure 1 Figure 2 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Figure 3 HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) 1 2 3 4 5 6 7 HYDRAGEL 7 PROTEIN(E) 1 2 3 4 5 6 7-155 -
Benelux SCS / Comm. V Jan Olieslagerslaan 41 1800 Vilvoorde Belgique / België Tél. : 32 (0)2 702 64 64 Fax : 32 (0)2 702 64 60 e-mail : sebia.benelux@sebia.be Brasil Edifício Baker Office Tower Rua Barão do Triunfo, 73, conjunto 51 CEP 04602-000 Bairro Brooklin Paulista, São Paulo - SP Brasil Tel. : 55 11 3849 0148 Fax : 55 11 3841 9816 e-mail : sebia@sebia.com.br GmbH Münsterfeldallee, 6 36041 Fulda Deutschland Tel. : 49 (0)661 3 30 81 Fax : 49 (0)661 3 18 81 e-mail : sebia@sebia.de Hispania S.A. C/Sicilia, n 394 08025 Barcelona España Tel. : 34 93 208 15 52 Fax : 34 93 458 55 86 e-mail : sebia@sebia.es Inc. 400-1705 Corporate Drive Norcross, GA 30093 U.S.A. Tel. : 1 770 446-3707 Fax : 1 770 446-8511 e-mail : info@sebia-usa.com Italia S.r.l. Via Antonio Meucci, 15/a 50012 Bagno a Ripoli (FI) Italia Tel. : 39 055 24851 Fax : 39 055 0982083 e-mail : info@sebia.it UK Ltd River Court, Meadows Business Park Station Approach, Blackwater Camberley, Surrey, GU17 9AB United Kingdom Tel. : 44 (0)1276 600636 Fax : 44 (0)1276 38827 e-mail : info@sebia.co.uk Parc Technologique Léonard de Vinci CP 8010 Lisses - 91008 EVRY Cedex - France Tél. : 33 (0)1 69 89 80 80 - e-mail : sebia@sebia.com Shanghai Representative Office Cross Tower, Room 2306-07 318 Fuzhou Road Shanghai 200001 China Tel. : 00 86 (21) 6350 1655 Fax : 00 86 (21) 6361 2011 e-mail : sebia@sebia.cn