INFEKČNÍ SÉROLOGIE Parazitologie IMUNOENZYMATICKÉ SOUPRAVY K DIAGNOSTICE TOXOPLAZMÓZY Toxoplasma gondii ELISA a IMUNOBLOT soupravy jsou určeny ke stanovení specifických protilátek třídy IgA, IgE, IgG a IgM v lidském séru nebo plazmě
Úvod Toxoplasmóza je parazitární onemocnění, jehož původcem je prvok Toxoplasma gondii. Jedná se o parazita se složitým vývojovým cyklem, který se vyskytuje v několika morfologicky odlišných stádiích. Primárním hostitelem jsou kočkovité šelmy. Člověk a ostatní teplokrevní obratlovci se mohou nakazit buď primárně infikovanou potravou (nedostatečně tepelně upravené maso) nebo pozřením oocyst (znečištěné prsty, předměty atd.). Získaná toxoplasmóza probíhá u imunokompetentních jedinců obvykle asymptomaticky nebo jen s mírnými příznaky (lymfadenopatie, subfebrilie, únava) a bez následků. Závažnější projevy onemocnění (encefalitida, hepatitida, myokarditida, generalizovaná forma) mohou nastat u imunokompromitovaných jedinců, kteří jsou navíc ohroženi i reaktivací latentní infekce. Vrozená toxoplasmóza je způsobena přenosem infekce z matky na plod. Primoinfekce matky krátce před otěhotněním nebo v graviditě může vést k abortu, porodu mrtvého dítěte nebo porodu dítěte s různým stupněm poškození (kalcifikace mozku, hydrocefalus, poruchy zraku, ovlivnění duševního vývoje). Diagnostika onemocnění Diagnostika onemocnění je založena na klinickém obrazu, epidemiologické anamnéze a laboratorních testech. Přímá detekce parazita není dostupná pro rutinní diagnostiku. Významnou roli v diagnostice hraje sérologie. Screening - stanovení celkových protilátek metodou KFR Stanovení specifických protilátek třídy IgA, IgE, IgM a IgG metodou ELISA, případně konfirmační metodou IMUNOBLOT
Protilátková odpověď IgG Titr protilátek IgE Avidita IgG IgA KFR IgM 1 2 3 4 5 7 8 9 1 11 12 13 Měsíce ELISA IgM protilátky: Vysoce senzitivní marker akutní infekce Mohou přetrvávat déle než rok po prodělání akutní infekce IgE protilátky: Vysoce specifický marker akutní infekce Přetrvávají méně než měsíců po prodělání akutní infekce IgA protilátky: Senzitivní a specifický marker akutní infekce Přetrvávají -9 měsíců po prodělání akutní infekce IgG protilátky: Přetrvávají dlouhodobě (mnoho let) Zajišťují ochranu před novou infekcí Stanovení avidity umožňuje přesnější určení fáze onemocnění Použití souprav Diagnostika toxoplazmózy: vhodná je kombinace stanovení celkových a specifických protilátek třídy IgA, IgE, IgM a IgG včetně testu avidity Antigen Purifikovaný a inaktivovaný nativní antigen T. gondii (RH kmen)
Princip testu Pracovní postup Souprava IgG je založena na sendvičovém typu ELISA metody Soupravy IgA, IgE a IgM jsou založeny na capture typu ELISA metody Krok č. 1 Kroky testu Ředění vzorků séra/plazmy (1+1) Sandwich ELISA Capture ELISA 2 Dávkování kontrol a ředěných vzorků 1 µl blank = prázdná jamka HRP HRP 3 Inkubace min. při 37 C Anti-Hu IgG Tracer 4 Odsátí a promytí jamek 5 krát Ag 5 Dávkování Konjugátu nebo Traceru 1 μl blank = prázdná jamka IgG IgM Inkubace min. při 37 C 7 Odsátí a promytí jamek 5 krát Ag Anti-Hu IgM 8 Dávkování substrátu (TMB-Complete) 1 μl včetně blanku Mikrotitrační destička Mikrotitrační destička Tracer: antigen T. gondii + protilátka anti-p3 značená HRP 9 Inkubace 2 min. při 37 C 1 Dávkování Zastavovacího roztoku 1 μl včetně blanku 11 Fotometrické měření při 45 nm Uživatelský komfort Charakteristiky souprav Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené reagencie Zaměnitelnost komponent Barevně značené stripy s odlamovacími jamkami CUT-OFF kontrola Semikvantitativní hodnocení výsledků (Index pozitivity-ip) Kalibrátory (EIA Toxoplasma IgG) Kvantitativní hodnocení výsledků IgG (IU/ml) ELISA Diagnostická citlivost Diagnostická specifita EIA Toxoplasma IgA 9,9 % 99, % EIA Toxoplasma IgE 9,9 % 99, % EIA Toxoplasma IgG 98,9 % 99,2 % EIA Toxoplasma IgM 9,4 % 97,9 %
Interpretace výsledků IgE IgA IgM IgG Hodnocení + Akutní infekce (zřídka) + + + slabě + Akutní infekce + + + + Akutní infekce + + + Akutní infekce nebo postakutní stav slabě + + + Postakutní stav Výhody souprav Vysoká diagnostická účinnost Dobrá reprodukovatelnost Vysoká dynamika testů Identický pracovní postup Celková doba vyšetření 1,5 hodiny Aviditní test (EIA Toxoplasma IgG) Vhodné pro otevřené automatické systémy Možnost nezávislé verifikace (CKS) Komplexní zákaznický servis + + Postakutní stav nebo latentní infekce + Latentní infekce Přítomnost protilátek neprokázána IMUNOBLOT Princip testu Elektroforeticky separované antigeny Toxoplasma gondii jsou přeneseny na nitrocelulózovou membránu. E P Po přidání substrátu vzniká reakcí s enzymem nerozpustný barevný produkt Použití souprav Diagnostika toxoplazmové infekce; konfirmační test ELISA vyšetření Podrobné stanovení přítomnosti protilátek proti specifickým antigenům T. gondii Stanovení kongenitální toxoplazmózy porovnání imunitního profilu sér matky a dítěte Ag Enzymem konjugovaná sekundární protilátka se váže na primární protilátku Specifická primární protilátka se váže na protein Specifický protein antigenu Blokátor Nespecifický protein antigenu Ag Uživatelský komfort Komponenty v pracovním ředění Barevně odlišené reagencie Zaměnitelnost komponent Negativní a pozitivní kontrola Kontrolní linie na stripu Možnost softwarového vyhodnocení Strip
Antigeny Pracovní postup Za specifický je považován antigen o Mr = 3 kda (p3). Krok č. Kroky testu 1 Dávkování Univerzálního roztoku 2 ml Cut-off line Start 2 Smáčení stripů 1 min. při lab. teplotě 3 Odsátí 4 Ředění vzorků séra/plazmy (8 µl+1,5 ml) 35 kda 3 kda 5 Dávkování kontrol a ředěných vzorků 1,5 ml 7 Inkubace min. při lab. teplotě Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min. 8 Dávkování Konjugátu 1,5 ml Charakteristiky souprav 9 1 Inkubace min. při lab. teplotě Odsátí a promytí v Univerzálním roztoku 3 krát 1,5 ml po 5 min. Immunoblot Diagnostická citlivost Diagnostická specifita 11 Dávkování substrátu (BCIP/NBT) 1,5 ml BLOT Toxoplasma IgA 9,9 % 92,9 % 12 Inkubace 1 min. při lab. teplotě BLOT Toxoplasma IgG 91,7 % 91,7 % 13 Odsátí a promytí v destilované vodě 2 krát 2 ml po 5 min. BLOT Toxoplasma IgM 9,9 % 99,5 % 14 Nalepení a vyhodnocení stripů Výhody souprav Jednoduchá interpretace a reprodukovatelnost výsledků Vysoká diagnostická účinnost Vhodné pro automatické systémy Komplexní zákaznický servis
Klinická data Séroprevalence a dynamika protilátek třídy IgG u dárců krve (ČR) Dárci krve (n = 483) Titr protilátek 5 4 3 2 Pozitivní (n = 119) (séroprevalence) Negativní (n = 34) 1 Hraniční 25% 75% Vzorky Avidita Stanovení avidity protilátek IgG Avidita protilátek vyjadřuje pevnost vazby mezi antigenem a protilátkou. Při primární infekci se tvoří nejprve protilátky s nízkou aviditou. V průběhu infekce imunitní odpověď organismu vyzrává a avidita protilátek narůstá. V latentní fázi onemocnění jsou protilátky vysoce avidní a při sekundární infekci nebo reaktivaci produkují paměťové B-buňky ihned IgG protilátky s vysokou aviditou. Stanovení avidity protilátek IgG umožňuje přesnější určení fáze nákazy. IA (%) 1 9 8 7 5 4 3 2 1 3 8 11 2 4 3 5 9 A B C D E F G H Pacientské vzorky A-H Časový interval v měsících (2-11) od 1. testování () 5 1 3 1. vzorek 2. vzorek 3. vzorek 4. vzorek
INFEKČNÍ SÉROLOGIE Ordering Objednací Information údaje Související produkty ELISA Kód Název soupravy Počet testů TgA9 EIA Toxoplasma IgA (capture) 9 TgE9 EIA Toxoplasma IgE (capture) 9 TgG9 EIA Toxoplasma IgG 9 TgM9 EIA Toxoplasma IgM (capture) 9 xxxtln CKS negativní (dle seznamu na www.testlinecd.cz) 3,5 ml xxxtlp CKS pozitivní (dle seznamu na www.testlinecd.cz) 3,5 ml IMUNOBLOT Kód Název soupravy Počet testů TgAB1 BLOT Toxoplasma IgA 1 TgGB1 BLOT Toxoplasma IgG 1 TgMB1 BLOT Toxoplasma IgM 1 KFR Kód TgKF2 TgKF5 Tg-KF1 KFAs KFAs1 KFC1 TgKFN2 TgKFP2 Název soupravy Toxo CF Ag lyophil. (,2 ml) Toxo CF Ag lyophil. (,5 ml) Toxo CF Ag lyophil. (1 ml) CF AMBOCEPTORset (,5 ml) CF AMBOCEPTORset (1 ml) CF COMPLEMENT (1 ml) Toxo CF Negative Control lyophil. Toxo CF Positive Control lyophil. Kontakt TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. Křižíkova 8 12 Brno, Česká republika Tel.: +42 549 121 25 (237, 238) Fax: +42 541 243 39 E-mail: trade@testlinecd.com www.testlinecd.cz TestLine Clinical Diagnostics s.r.o. je držitelem certifikátů ISO 91:28 a ISO 13485:23.