ZÁKLADNÍ TOXIKOLOGICKÉ POJMY

ZÁKLADNÍ TOXIKOLOGICKÉ POJMY TOXICITA - to, co je látka schopna v organisku vyvolat, schopnost vyvolat toxický účinek. Je to relativní vlastnost (závislost na dávce, na druhu organismu, podmínkách a mechanismu působení látky). TOXICKÝ ÚČINEK - výsledek interakce xenobiotika a organismu, která organismu škodí v krátkodobém nebo dlouhodobém horizontu, organismus (nebo jeho potomstvo) pozměňuje nebo ničí. INTOXIKACE - vstup xenobiotika do organismu OVLIVNĚNÍ TOXICKÉHO ÚČINKU: TOXICKÉ ÚČINKY 1. Xenobiotikum - závisí na absolutní a prostorové struktuře (např. každý optický izomer může mít jiný účinekthalidomid- jedna z forem je silně teratogenní) - fyzikálně-chemické vlastnosti (inhalační toxicita železo vs. Ether; PVC vs glyceroltransdermálně) 2. biologický systém - biologický druh- kozy jsou indiferentní vůči nikotinu- mohou spásat tabák, botulotoxin nefunguje na želvách. - Zděděné dispozice- indiáni snadno podléhali alkoholu na rozdíl od evropských námořníku, evropané ho odbourávají snadněji- tradice pití alkoholu v Evropě. - Zdravotní stav daného jedince- muž v plné síle snáší alkohol lépe než dítě. 3. Expozice - jak dlouho a jaké dávce byl organismus vystaven, kovová rtuť vysoce toxická v parách, ale klidně ji můžeme popíjet. 4. Další okolnosti - další xenobiotika- jiné transformační dráhy po požití určitých léků - počasí- po dešti se dýchá lépe atd. TYPY TOXICKÝCH ÚČINKŮ: a) specifické - zásah do biochemického děje (obsazení receptoru-např pro acetylcholin-zabránění přenosu nervového vzruchu, monofluoroctová kyselina- jeden flor je velmi podomný vodíku- vstoupí do citrátového cyklu- zrušení energie v buňce), jsou mnohem nebezpečnější než nespecifické účinky. Je potřeba jen velmi nízkých dávek, účinky reverzibilní (alkohol) i ireverzibilní (mutagenita, smrt organismu). 1

b) nespecifické - vzájemné obecné chemické působení xenobiotika a organismu (narkotický účinek- inhalační narkóza-látka rozpustná v tucích- neurony obaleny lipofilním pouzdrem- pouzdro nabyde a uškrtí axon- nemůže přenášet látku proto není cítit bolest, poleptání) - LD 50 - smrtná dávka- způsobí smrt 50% členů exponované skupiny - botulotoxin- produkt bakterie clostridium botulotoxinum za nepřístupu vzduchu. - Dioxin- syntetický jed, při nedokonalém spalování polychlorovaných derivátů. ÚČINEK PODLE MÍSTA PŮSOBENÍ 1. Orgánová toxicita PULMOTOXICITA - azbest (několik modifikací, jedna z nich silně karcinogenní), chlor, fosgen HEPATOTOXICITA - ethanol, sloučeniny berylia, halogenované uhlovodíky (nejsou běžně součástí přírodních látek, organismus se bude snažit látky zbavit, ale obdrží radikály ničící buňky) NEFROTOXICITA - vylučování jedů, chloroform, chlorid rtuťnatý DERMATOTOXICITA - stříbrné sloučeniny- v kůži se vyredukovávají na kovové stříbro- člověk černá, změna je ireverzibilní NEUROTOXICITA - počkození CNS, olovo, rtuť, oraganofosfáty, periferní nervstvo- akrylamid) 2. Funkční toxicita - imunotoxický účinek - alergizující účinek - karcinogenita, mutagenita a teratogenita (reprodukční toxocita). 3. Nespecifický celkový účinek - narkotický, kumulace látek v organismu (ionty olova a stroncia se ukládají do kostí- organismus je neumí vyloučit, ukládání do tukové tkáně.) - jednotlivé účinky se mohou navzájem překrývat ČASOVÝ PRŮBĚH TOXICKÉHO ÚČINKU a) akutní účinek - po jendom setkání s chem. Látkou, projeví se okamžitě nebo po velmi krátké době, obvykle má velmi vážné následky až smrt, pokud se zregeneruje tak se poměrně nic neděje b) chronický účinek - po dlouhou dobu velmi nízké dávky, měsíce až roky- kouření (rakovina je chronický účinek), zcela olišné projevy od akutního účinku. c) Pozdní (vzdálený účinek) - jednou nebo po jistou dobu se s látkou setkáme, následuje dlouhý výpadek a najednou po nějaké době (doba latence) se projeví nějaké účinky. Obvykle mutagenita, kancerogenita a teratogenita.) 2

- ethylnitrosamin - spálený chleba, uzeniny na grilu. EXPOZICE: - vystavení organismu působení xenobiotika - Časový rozměr - jak často a v jakých časových intervalech se org.s látkou setkal - akutní epozice - chronická - přetržitá (intermitentní)- přerušovaná expozice - průměrná- když to nelze jinak spočítat - Dávkový rozměr - dávka podaná do organismu: mg, mg.kg -1, mol.kg -1. - pokud je otrávená třeba voda mg.m -3, mol.m -3 - Opakované dávky - záleží na opakování a rychlosti odbourávání. - Expozice podle vstupu do organismu: a) inhalační - poměrně častá, po celou dobu života, krev v plicích je v přímém kontaktu s prostředím b) Orální- zažívacím traktem. c) Transdermální/ subkutánní d) intravenózní - Monitorování expozice - jaké dávce byl organismus vystaven 1. monitorování vnějšího prostředí 2. biologické expoziční testy- měření koncentrace v plazmě, moči..., indikátor dávky 3. sledování účinku- indikátor účinku, odezva organismu, poškození- odhad jaké dávce a po jak dlouhou dobu byl organismus látce vystaven. ZÁVISLOST VELIKOSTI ÚČINKU NA DÁVCE: - vystavení jedince chemické látkce- biologická odezva/toxický účinek. - Rozptyl výsledků- pokusy mají různé výsledky, biologická variabilita (statistické zpracování dat), interindividuální rozdíly (odolnost vůči alkoholu- záleží na tom jak často mu studenti holdují) - dva typy závislosti účinku na dávce: a) individuální (gradující) - popis v jednom organismu, podávám větší a větší dávku jednomu jedinci b) skupinová (kvantová) - závislost účinku na dávce- distribuce stejných odpovědí na dávku v populaci organismů. - Bezprahový účinek- jedna jediná molekula může vyvolat karcinogenní bujení - prahový účinek- alkohol. - Výjimky: esenciální látky (vitamíny a stopové prvky- oblast homeostáze- oblast nejnižší a nejvyšší koncentrace, kterou organismus potřebuje- nesmíme je organismu odpírat), látky organicmu cizí- v malých dávkách organizmu prospívají, stimulujího = hormese- nizoučkou dávkou xenobiotika vyvoláme kladnou odezvu (alkohol, tetraethylolovo). - skupinový/kvantový vztah mezi dávkou a odpovědí: - čím více jedinců, tím více klesá statistická chyba. Sledujeme procenta jedinců, kteří vykáží daný účinek. Klasická toxikologie- hlavní účinek smrt. - Morfin podávaný myším- nastane Staubův fenomén (ochrnutí zádových svalů- zvedne se ocásek nahoru. Proložení sigmoidou (po zderivování dostaneme Gaussovu křivku- u řady biologických jevů). 3

- Hodnota efektivní dávky pro 50% jedinců (ED 50 )- při této dávce reaguje právě 50% jedinců ze souboru. Je zde nejmenší statistická chyba- nejmenší rozptyl výsledků, proto se nepoužívá ED 1OO. - TD 50 - toxická dávka- vykazuje se toxický účinek. - NOEL- no observadble effekt level - taková dávka, při níž není statisticky dokazovatelná odpověď skupiny. - LOEL- nemusí být ještě toxický. - NOAEL- nepozorován žádný nežádoucí efekt. - Terapeutická šíře pro léčiva: řada látek musí mít účinnou koncentraci, ale nesmím přesáhnout určitou koncentraci. Nastane léčebný účinek, ale nenastane toxický účinek, mezitím se můžou pohybovat. Porovnávání toxicity různých látek: ekvikoncentrační a ekvipotenciální (kolik potřebuju na usmrcení 50% jedinců). TOXIKOKINETIKA - zjišťuje, jak organizmus působí na xenobiotika, od prvního setkání až po zbavení se ho 1. vstup - orálně - inhalačně - intravenozně - transdermální - rektálně 2. distribuce - xenobiotikum musí dosáhnout trasportního media krev, nejrychlejší je intravenozní aplikace - rychlá je i inhalace, krev v plicích je v přímém kontaktu - orální je docela pomalá cesta, musí dojít do žaludečně střevního traktu, musí projít portální žilou, skrz játra, v játrech může být xenobiotikum trasformováno, pak může jít i do žluče a zpět do žal.stř.traktu - xenobiotikum škodí na několika místech (orgány, tkáně, kosti), olovnaté ionty: většinou se dostávají do kostí, kde je už nafurt; ukládání v tukové tkáni 3. vylučování - ledviny močový měchýř moč, některé látky se v kyselém prostředí moči rozkládají a působí na močový měchýř - plíce plicní sklípky vydechnout - játra střeva stolice - sekreční žlázy pot nebo mateřské mléko, následky při kojení - vylučování do vlasů (arsen) a nehtů (proužky způsobené otravou arsenem) 4

VSTUP - místo účinku buňka - cytoplasma: endoplasmatické retikulum (mikrosomální frakce) - karyoplasma - např. blokování mitochondrií ÚČINEK - celkový - specifický interakce jen s nějakou organelou nebo makromolekulou STUPEŇ POŠKOZENÍ - cytopatický účinek - zásah jen do některého pochodu - cytostatikcký účinek - znemožněna reprodukce a dělení - cytotoxický účinek - usmrcení buňky - odolnost buněk různých tkání je různá (regenerace) - různá odolnost buněk téhož druhu - genetické odchylky (vznik rezistence, např. užívání antibiotik) - stadium genetického cyklu VSTUP - překonání buněčné membrány - obaluje a chrání buňku - bariéra mezi krví a buňkou - transport přes membrány - kinetika 1. řádu - k p = ln2/t 1/2 (penetrační konstanta) BIOLOGICKÁ MEMBRÁNA FOSFOLIPIDOVÁ DVOJVRSTVA - cholin kyseliny fosforečné a mastné kyseliny - polární část cholin fosf. kys. - nepolární mastná kyselina, nerozpustný ve vodě - tato struktura se zformuje, tvoří vnitřní a vnější vrstvu, uvnitř je nepolární prostředí PROTEINOVÉ STRUKTURY - kanály (na Na +, kyslík, živiny ) - receptory (pro komunikaci, navázání struktury spustí bioch. reakci uvnitř buňky) NEVODNÉ PROSTŘEDÍ - např. glycin je ve vodném prostředí disociován, moc se mu nechce procházet přes nepolární prostředí membrány - zajišťuje distribuci mezi vodným a nevodným prostředím korelace účinku s rozdělovacím koeficientem n-oktanol voda - P = [xenobiotikum] n-oktanol / [xenobiotikum] voda 5

- vzato spíše logaritmicky (logp), velká čísla - čím polárnější látka, tím menší p polární látky mají většinou záporný logp, nepolární kladný tabulka hodnot pro glycin, EDTA, sarin, kys. acetylsalicylová, kys. benzoová, DDT PRŮCHOD MEMBRÁNOU 1. prostá difuze na základě koncentračního gradientu - přenos látek lipofilní povahy (Fickovy zákony) - průchod póry - pouze látky do M r = 500 - ionty (hydrofilní látky, disociované) neprochází 2. pasivní / aktivní přenašečový transport - kanály v buněčné membráně - i proti koncentračnímu gradientu, stojí to energii - velké hydro- i lipofilní molekuly, anorganické i organické látky 3. transcytoza pronikání skrz buněčnou membránu - pinocytoza - některé látku udělají malou dirku, tu zvětšují, udělají váček a ten se vtáhne, spolu s tím kus okolního prostředí - fagocytoza vstřebání celých částic, likvidace cizorodých látek PORUŠENÍ MEMBRÁNY - pomocí lipofilních látek (org. rozpouštědla), detergentů, chelatotvorných činidel - zhroucení funkce organel, transportu, až smrt buňky - aby mohlo xenobiotikum do buňky vniknout, musí dosáhnout místa účinku - rozhodující charakteristiky: hydrofobnost (logp), stupeň disociace (pak), velikost a geometrie mol. - rozhodující charakteristiky organizmu: počet překonávaných bariér, velikost absorpční plochy (např kůže má o hodně menší plochu styku než plíce), prokrvenost místa kontaktu (opět plíce více) - rychlost nástupu účinku klesá s podáním: - intravenozní - inhalační - intraperitoneální mimo střevní cesty - intramuskulární - rektální - subkutánní - perorální - transdermální - při různých cestách vstupu jsou různé kvantitativní i kvalitativní účinky (např. jedy k otravování šípů: pokud jsou to přírodní proteinové látky, při perorálním užití to vysoké ph v žaludku zničí) INHALAČNÍ VSTUP - nejdůležitější cesta, trvá celý život - plicní sklípky 140 m 2 - hydrofilní látky vlhké prostředí 6

- hydrofobní sklípky, v plynném stavu - po cca 30 minutách ustavení retenční rovnováhy (krev vzduch) - retence (podíl zadrženého xenobiotika) - závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech (rozpustnost, tenze par) - na tělesné námaze, zdravotním stavu plic - aerosoly, prach - částice větši než 5 mikrometrů se tam nedostanou - ty menší mohou být vstřebány a dostat se až do krve - např azbest je nepříjemný a tělo se ho špatně zbavuje, jsou tenké a můžou propíchnout buňku, její jádro, poškození DNA, vzniky jaderného bujení - nejrychlejší a nejúčinější podání xenobiotika ihned se dostává do krevního oběhu (při inhalaci par rtuti více než 50% se dostane do krve) TRANSDERMÁLNÍ VSTUP - plocha asi 2m 2 - pokožka, škára, podkožní vazivo a tuk - prochází ji chloupky, potní a mazové žlázy, i to se může stát cestou vstupu do org. - plyny a páry pokožkou neprochází (je zanedbatelné, nedochází k účinku) - kapaliny pronikání podle vlastností xenobiotika (významné při profesionální expozici chemici) - lipofilní látky projdou mazovými žlázami (dimethylsulfoxid) - hydrofilní kanálky potních žláz - účinek: lokální poleptání, celkový projde až do krve - stav pokožky: vlhkost (mastnota) snadnější průchod, stáří, poranění (až intravenosní expozice) PERORÁLNÍ VSTUP - žaludek střevo tenké (přes klky do kapilár) krev portální žíla játra buď odbourání, transformování, nebo žílami do celého organizmu pak třeba přes ledviny do moči 1. žaludek - vstřebají se: elektroneutrální, hydrofilní i lipo látky (s malou M r ) ionty (jednomocné desítky %, dvojmocné jednotky, vícemocné - desetiny) - ph šťav 2-3 silně ovlivňuje vstřebávání - slabá kyselina: žaludek ph3 0,004% kys, plasma ph7,4 99,5%, moč ph5,0 0,4% ph pk a log *konjugovaná báze+ / *konjugovaná kyselina] 2. tenké střevo - hlavní část vstřebání (plocha 40m - vstřebání závisí na složení potravy olej zamezuje vstřebání - nerozpustné látky se nevstřebají - vstřebané látky přecházejí rovnou do jater, kde může docházet k biotranformaci 7

rozdíly v toxicitě při různých podáních enterohepatální cyklus látka vyloučena do žluči a vrácena zpět INTRAVASKULÁRNÍ VSTUP XENOBIOTIK - nejrychlejší a nejúčinnější vstup (a distribuce) xenobiotik - obvykle intravenosní (žilní) podání - xenobiotikum je přímo distribuováno do celého organismu bez průchodu játry rozdíl od orálního podání, kdy se může uplatnit detoxikace biotransformací v játrech, tzv. first-pass efekt (např. amoniak, bisfenol A, THC, chlorpromazin, morfin, nikotin) - krev - formy výskytu xenobiotika v plasmě: DISTRIBUCE 1. volné 2. vázané na biomolekuly - albumin 4,6 g/100 ml plasmy, globuliny, transferrin, ceruloplasmin, glykoproteiny, α- a β- lipoproteiny - ovlivnění distribuce a vylučování xenobiotika, pouze nevázané xenobiotikum prochází buněčnými membránami a může být metabolizováno či vylučováno 3. přeměněné na metabolity (volné vázané) RYCHLOST ZÁVISÍ NA: - průchodnosti stěn krevních kapilár (jaterní vs. mozkové) - prokrvenosti - afinitě xenobiotika k vazbám na biomolekuly plasmy, resp. tkáně (buněčnou stěnou prochází pouze nevázané xenobiotikum) - podmínkách vstupu xenobiotika do tkání (ph, lipofilita, cílený transport) KONCENTRACE XENOBIOTIKA V KRVI V ZÁVISLOSTI NA ZPŮSOBU PODÁNÍ: - biologický poločas xenobiotika t ½ - určen rychlostí vstřebávání, metabolismu a vylučování - ukazuje na kumulaci xenobiotika v těle 8

KUMULACE XENOBIOTIK V TKÁNÍCH - vede k ovlivnění biologického poločasu (jeho prodloužení) - játra a ledviny (místa biotransformace) - velká kapacita pro kumulaci, protože obsahují speciální proteiny schopné vázat látky - játra cytoplasmatický protein ligandin (organické kyseliny) - ledviny metallothionein (kadmium, olovo, rtuť) - oko - pigment melanin (fenothiaziny v lékařství se používají jako psychofarmaka, chlorchinon 100 víc než v játrech) TUKOVÁ TKÁŇ - váže lipofilní xenobiotika (vysoké log P) - individuální na množství tuku (obezita) - malá perfuse krví (3 ml/min na 100 g) - pomalá redistribuce KOSTNÍ TKÁŇ - akumuluje kovy (olovo až 90 % z množství v organismu, stroncium), fluoridy (kostní fluorosa), tetracykliny (antibiotika), cis-platinu používá se při stabilizaci leukémie, ale způsobuje osteosarkom FYSIOLOGICKÉ BARIÉRY DISTRIBUCE XENOBIOTIK - bariéra plazma-nervové buňky (hematoencefalická) - méně prostupná zejména pro hydrofilní látky - ph mozkomíšního moku 7,35 kumulace slabých kyselin - zánět může zvýšit permeaci (penicilín) - placentární bariéra - nejen pro ochranu plodu, ale pro jeho výživu, odstraňování metabolitů - řada buněčných vrstev oddělující matku a plod - prochází zejména lipofilní látky (DDT) rozdíly v ph krve matky 7,44 a plodu 7,3 vedou k zvyšování koncentrace slabých bazí v plodu - bariéra krev-varlata (proti poškození spermií) 9

HEMATOENCEFALICKÁ BARIÉRA - zonula occludens těsné spoje mezi buňkami krevní kapiláry - fosfolipidová dvojvrstva zabraňující průniku nabitých polárních látek - transportéry a iontové kanály - enzymatická bariéra odpuzující cizorodé látky od stěny kapiláry - odtoková pumpa (efflux pump) odvádějící lipofilní látky, které pronikly do buňky krevní kapilár zpět do krevního řečiště - záporný efekt při dostávání léčiv do mozku DISTRIBUČNÍ OBJEM VD - charakterizuje distribuci xenobiotika v organismu - je to objem kapaliny, ve které by se musela rozpustit podaná dávka xenobiotika, aby dosáhla stejné koncentrace jako v plasmě - může být větší než je celkový objem vody v těle (~ 42 litrů v 70 kg člověku) zdánlivý distribuční objem - velikost závisí na charakteru xenobiotika a) lipofilní xenobiotika - velký V d b) disociovaná, hydrofilní xenobiotika - malý V d BIOTRANSFORMACE BIOTRANSFORMACE XENOBIOTIK - xenobiotika podléhají biochemickým reakcím = biotransformace - cílem biotransformace je zrychlení vylučování xenobiotika - prostředkem je především zvýšením hydrofility (rozpustnosti ve vodě) - výsledek biotransformace - snížení až vymizení toxicity - objevení nebo zvýšení toxicity ( aktivované metabolity) - meziprodukty biotransformačních reakcí jsou reaktivní a často toxické - metabolismus (ř. μεταβολιν = přeměna) všechny osudy chemikálie v organismu 10

V dané chemické látce se organismus pokusí pomocí enzymatických reakcí změnit funkční vlastnosti, aby se tam pokud možno objevily atomy vykazující polární vlastnost 2. fáze: je potřeba zvýšit polaritu, proto dochází ke konjugaci (spojení) s nějakou látkou tělu vlastní (glukuronová kys.), navázáním vzniká glukuronid látka hydrofilní je snadno močí vyloučitelná Někdy může dojít u xenobiotika jen k druhé fázi, nebo je mít přehozené LOKALIZACE BIOTRANSFORMAČNÍCH POCHODŮ - hlavním biotransformačním orgánem játra (hepatocty) - enterohepatální cyklus - vliv poškození jater (notoričtí alkoholici mohou být paradoxně odolnější nevznikají u nich aktivované metabolity) - další orgány: plíce, ledviny, střevní stěna, svaly, slezina - ojediněle v buňkách kůže a sliznic (např. poškození očního nervu CH 3 OH) - buňky - endoplasmatické retikulum - mitochondrie - cytosol Zrnité (zer) a hladké (her) endoplasmatické retikulum v hepatocytu 11

I. FÁZE BIOTRANSFORMACE - chemická změna xenobiotika oxidačně-redukčními procesy - zvýšení hydrofility zavedením / odkrytím polárních skupin OH, NH 2, SH 1. Oxidační reakce - dominující - působení enzymových systémů (oxidoreduktas), zejména: cytochrom P-450 FAD-dependentní monooxygenasy (substráty s N, S, P) - enzymové systémy mikrosomální (P-450, FAD) nemikrosomální (alkoholdehydrogenasa, aminooxidasa aj.) 12

2. Redukční reakce 3. Hydrolytické reakce 13

II. FÁZE BIOTRANSFORMACE - produkty I. fáze dále podléhají reakcím s endogenními (tělu vlastními) sloučeninami konjugace (spojení) s molekulami s polárními skupinami - účelem je další zvýšení hydrofility molekuly ( vyloučení močí) - produkty II. fáze polárnější a méně toxičtější než produkty I. fáze - v některých případech může II. fáze předcházet I. fázi 14

ENTEROHEPATÁLNÍ CYKLUS - zdržuje vylučování xenobiotika z organizmu - glukuronidy vylučované do žluči mohou být ve střevu dekonjugovány a následně znovu absorbovány (bakteriemi) - nutné cyklus přerušit - např. methyl rtuť, thallné sloučeniny, nitrosloučeiny, akrylamid, bisfenol A (látku navážou a zabrání resorpci) FAKTORY OVLIVŇUJÍCÍ BIOTRANSFORMACI ROZDÍLY V TOXICITĚ LÁTEK (MEZIDRUHOVÉ I INTERINDIVIDUÁLNÍ) - plynou z rozdílů v biotransformačních pochodech VNITŘNÍ FAKTORY (INTERINDIVIDUÁLNÍ) a) věk a stupeň vývoje organismu - u savců se jaterní enzymy aktivují až po narození (plod v těle matky nemá funkční játra) - ve stáří klesá enzymová aktivita ( snížení tvorby glukuronidů, musí tvořit něco jiného) b) pohlaví organismu - u hlodavců samci biotransformují rychleji než samice (při pokusech je nutná parita, stejně obou) - u člověka neprokázáno (jen pokles biotransformace v těhotenství, organizmus tím chrání plod, pak taky tím, že se stará o jiné reakce) c) zdravotní stav - jaterní onemocnění značný vliv na průběh biotransformace - choroby ledvin ovlivňují vylučování močí (člověk může umřít otravou organizmu) - vzájemné ovlivnění lék xenobiotikum (indukce / inhibice enzymů) 15

d) genetické dispozice Koncentrace antituberkulotika isoniazidu v plasmě po 6 hodinách od podání 9,8 mg/kg (pro 267 pokusných jedinců) e) mezidruhové rozdíly - rozdíly v genetické informaci - předmět studia srovnávací toxikologie (nesmíme bezmyšlenkovitě přenášet pokusy mezi živočichy, želva je odolná botoxu, člověk ne) specifické účinky herbicidy aj. - studium toxických účinků výběr vhodného modelu (člověk metabolicky příbuznější praseti než potkanovi), (z hlediska biotransfomace je člověk podobnější praseti) - rozdíly v I. i II. fázi biotransformace např. hydroxylace anilinu: masožravci vykazují ortho-hydroxylaci, hlodavci vykazují para-hydroxylaci - rozdíly se týkají i biologického poločasu xenobiotika - genetická rozdílnost v rámci jednoho druhu (lidská rasa) interindividuální rozdíly VNĚJŠÍ FAKTORY: 1. složení potravy (dieta) - např. nízkoproteinová dieta u potkanů brání aktivaci kancerogenního dimethylnitrosaminu (opečené jídlo, spálené buřty) - dále: cukry, tuky, vitaminy, biogenní prvky 2. fyzikální jevy z okolního prostředí - teplota, vlhkost, přirozené radiační záření (v čechách poměrně vysoké) 3. střídání světla a tmy - aktivita monooxygenas vykazuje 24 hodinové i měsíční cykly 4. stres 5. současné působení více chemikálií - obvykle značně nespecifické kompetitivní (soutěživá) inhibice enzymů (methanol ethanol) 16

indukce syntézy mikrosomálních enzymů (fenobarbital, dioxiny zvýši se produkce monooxigenáz, ty mohou rychle transformovat) - výsledkem vzájemné interakce může být potenciace toxicita látky se zvýší současně podanou látkou bez nebo s malým toxickým účinkem (nejhorší varianta) synergismus toxicita směsi vyšší než součet toxicit dvou látek antagonismus toxicita směsi menší než součet toxicit dvou látek (ideální) Isoboly popisující vzájemný vztah dvou xenobiotik VYLUČOVÁNÍ XENOBIOTIK - xenobiotikum je vylučováno jednak z jednotlivých tkání a orgánů (eliminace) a jednak z celého organismu (exkrece) - exkrece xenobiotika (a jeho metabolitů) probíhá a) ledvinami - do moči (hlavní vylučovací cesta) b) játry - žlučí do střeva a do stolice c) plícemi - vydechováním d) jinými cestami - tělní sekrety (pot, sliny, slzy, mateřské mléko aj.) - každé xenobiotikum má svoji hlavní vylučovací cestu (buď moč, nebo stolice), která závisí na: - fyzikálně-chemických parametrech látky - biotransformačních mechanismech (např. enterohepatální oběh) - kumulaci látky v organismu - obvykle se xenobiotika vylučují několika cestami zároveň 17

RYCHLOST VYLUČOVÁNÍ XENOBIOTIK BIOLOGICKÉ POLOČASY (POLOČASY ODBOURÁVÁNÍ) 1. hodiny - lehko vylučitelné organické látky (benzen, styren) 2. desítky hodin - obtížněji vylučitelné organické látky (trichlorethylen) 3. stovky hodin - ionty kovů (rtuť) 4. tisíce hodiny - ionty kovů (olovo, kadmium, arsen) nebo lipofilní organické látky VYLUČOVÁNÍ XENOBIOTIK LEDVINAMI (MOČÍ) 1. GLOMERULÁRNÍ FILTRACE - průtok krve ledvinami asi 1200 ml/min - exkrece volných molekul xenobiotika a jeho metabolitů (do M r ~ 4000) - ne látky vázané na plasmatické bílkoviny - hnací silou je hydrostatický a koloidně-osmotický tlak - probíhá v Bowmanových pouzdrech (póry 50 100 nm) - velmi rychlá exkrece (asi 120 ml/min = 180 litrů denně) - reabsorpcí v tubulech se sníží objem primární moči 18

2. TUBULÁRNÍ SEKRECE A RESORPCE - probíhá v tubulech, tvořených semipermeabilní lipoidní membránou - umožňuje vylučování ale i zpětnou reabsorpci vázaných molekul xenobiotik - na základě aktivní reabsorbce, nebo pasivní koncentrační gradient aktivní transcelulární sekrece na obrázku 19

- nejdůležitější cesta exkrece xenobiotik - rychlost je ovlivněna činností ledvin i krevního oběhu - při poruše ledvin změna rychlosti exkrece - zvýšení diuresy medikamentózně nebo příjmem tekutin vede ke zrychlení ekrece - ovlivnění ph moči (podáním NH 4 Cl sníží ph moči, nebo NaHCO 3 zvýší ph moči) vede ke změně exkrece disociovatelných látek - některé konjugáty se mohou rozpadat v močovém měchýři a xenobiotikum se může znovu absorbovat do krve nebo napadat měchýř - vliv ph a pk a na vylučování xenobiotika močí (pasivní reabsorpce): VYLUČOVÁNÍ XENOBIOTIK JÁTRY (STOLICÍ) - druhá nejvýznamnější cesta exkrece (průtok asi 1300 ml/min krve) - cesta zejména pro metabolity lipofilních xenobiotik - krev a žluč odděluje lipidová membrána s velkým počtem pórů - látka je vyloučena do žluče (0,8 ml/min) a s ní do tenkého střeva enterohepatální cyklus DRUHY ELIMINACE - lipofilní látky prostou difusí (koncentrační gradient) - hydrofilní látky (konjugáty) s M r > 300 aktivním transportem - závisí na zdravotním stavu jater 20

VYLUČOVÁNÍ XENOBIOTIK PLÍCEMI (DECHEM) - mezi krví a vzduchem je lipoidní bariéra s velkým počtem pórů - pro nepolární látky s vysokou tenzí par (ether, chloroform, ethanol) staré zelené policejní trubičky chrom, se redukoval na dvojchroman - k vylučování může dojít i po ukončení exposice - ovlivněno plochou plic, rychlostí dýchání (fyzická zátěž) VYLUČOVÁNÍ XENOBIOTIK OSTATNÍMI CESTAMI - podružný význam (lékařství diagnóza) vylučování slinnými, potními, mazovými nebo slznými žlázami - vylučování do mateřského mléka - snadno lipofilní látky (DDT, polychlorované bifenyly, nikotin, morfin, acetylsalicylová kyselina, kofein) - koncentrace látek rovny až koncentraci v krvi 21

TOXIKOKINETICKÉ MODELY - koncentrace xenobiotika v krvi (krevní plasmě) je výslednicí rychlosti adsorpce, distribuce, biotransformace a exkrece - toxikokinetické modelování - predikce časového průběhu účinku xenobiotika - možnosti snížení následků působení xenobiotika (léčba) - modely - kompartmentové nahrazuje části organismu bloky - fyziologické KOMPARTMENTOVÉ MODELY 1. jednokompartmentový model - uvažuje kinetiku 1. řádu - t 1/2 = ln2/k e = 0,693/k e - průběh koncentrace xenobiotika v plasmě po orálním podání - Batemanova funkce 2. dvoukompartmentový model - zahrnuje distribuci krev tkáně 22

FYSIOLOGICKÉ MODELY - toxikokinetický model pro ethylen (ET) a ethylenoxid (EO) CLEREANCE - objem krve (plasmy) očištěný od xenobiotika za jednotku času - vyjadřuje míru vylučování xenobiotika ( očištění organismu) - z angl. to clear = vyčistit rychlost eliminace - podle orgánu, ve kterém exkrece probíhá, můžeme rozlišit - renální clearanci Cl r - hepatickou clearanci Cl h (= biotransormace) - intestinální clearanci Cl i - Cl = Cl r + Cl h + Cl i - toxikokinetické modely - jednokompartmentový - dvoukompartmentový BIOLOGICKÁ DOSTUPNOST (BIOAVAILABILITY) - podíl množství podaného xenobiotika, které je obsaženo v krevní plazmě jako nezměněné - závisí na cestě vstupu xenobiotika a na rychlosti jeho eliminace - obraz - dána podílem AUC při sledované a intravenosní aplikaci (dávka) AUC TOXIKODYNAMIKA - toxikodynamika (řec. δίνευω = pohánět, točit) - popisuje interakce xenobiotika s cílovým místem (buňkou) v živém organismu a následující biologickou odpověď (jak xenobiotikum působí na organismus) - toxický účinek - nespecifický obecné chemické působení xenobiotika destrukce buňky (organismu), např. poleptání - specifický specifická reakce xenobiotika s buňkou (organelou) ovlivnění fyziologické rovnováhy organismu - mechanismy specifických toxických účinků VAZBA XENOBIOTIKA NA CÍLOVÉ MÍSTO - velikost účinku interakce xenobiotika s místem účinku NEKOVALENTNÍ INTERAKCE - reversibilní - velký význam slabých mezimolekulových interakcí - vznik mezimolekulových komplexů - interakce: elektrostatické, hydrofobní, přenos náboje, sterická repulze - cílem je receptor, iontový kanál, enzym - např. vazba strychninu na glycinový receptor, interkalace akridinu do DNA 23

ELEKTROSTATICKÉ INTERAKCE a) iont iont, dipól iont, dipól dipól - elektrostatické přitahování opačně nabitých pólů polárních molekul ( E p 1/ r 3 ) uplatnění především v polárních molekulách b) dipól indukovaný dipól (Londonovy dispersní síly) - indukce vlivem elektrického pole permanentního dipólu ( E p 1/r 6 ) - význam v nepolárních membránách mohou přispívat ke specificitě interakce chemikálie s místem účinku c) vodíková vazba (vodíkový můstek) - interakce dipól dipól u sloučenin s vodíkem vázaným k elektronegativnímu prvku (P, O, N) - výjimečná vlastnost vodíku - velký význam ke stabilizaci prostorových struktur (terciární struktura proteinů, DNA) - narušení vodíkové vazby může vést k značnému poškození - vodíkové vazby jsou v DNA 24

HYDROFOBNÍ INTERAKCE - nepolární části molekul se ve vodném prostředí shlukují - uvolnění molekul vody z hydratačního obalu vede ke zvýšení entropie systému - význam při stabilizaci biopolymerů - korelují s relativní rozpustností ve vodě - uplatnění - transport přes membrány - hydrofobní kapsy uvnitř molekul bílkovin rozpustných ve vodě - kompetice se substráty enzymů vázaných v membránách VAZBA S PŘENOSEM NÁBOJE (CT CHARGE TRANSFER) - energií se blíží k vazbě kovalentní - vznik mezi dvojicí donor elektronů akceptor elektronů - velikost energie souvisí s geometrií částic (až překrytí molekulových orbitalů) - hypotéza kancerogeneze - sandwichové komplexy DNA - (Interkalace pyrenu do DNA) STERICKÁ REPULSE - přispívá ke zvláště specifickým interakcím - uplatňují se při inhibicích antagonistou KOORDINAČNÍ VAZBA - význam při vazbě anorganických iontů s organickými ligandy (komplexní sloučeniny, cheláty) - elektronový pár donoru (O, N, S) je sdílen anorganickým kationem (Fe, Cu, Co) - silně závisí na struktuře organického ligandu - význam u sloučenin s porfyrinovým kruhem (hem) KOVALENTNÍ INTERAKCE - prakticky irreversibilní - výsledek vazby elektrofilních/nukleofilních látek (často radikálů) na nukleofilní/elektrofilní atomy - cílem jsou DNA, biomolekuly RECEPTORY - proteinové struktury, které: 1. nesou specifické vazebné místo, které umožňuje navázat pouze molekulu určitých vlastností (tvaru) transmiter teorie: zámek klíč 2. po vazbě transmiteru změní konformaci (případně funkční stav), která vede ke změně nějaké buněčné funkce specifická odpověď IONTOVÉ KANÁLY ŘÍZENÉ LIGANDEM - např. nikotinový acetylcholinový receptor nervosvalové ploténky - umožňuje prostup Na +, K + - Ach + receptor prostup Na + změna akčního potenciálu kontrakce svalu - reguluje rychlé pohyby kosterního svalstva - receptor GABA (γ-aminomáselná kyselina), glutamátový, serotoninový, aj. - xenobiotika: vazba na α-, α- podjednotky, blokace kanálu, vazba na vnější vazebná místa 25

RECEPTORY SPŘAŽENÉ S G-PROTEINEM - receptory pro adrenalin, dopamin, histamin aj. - mechanismus přenosu signálu - efektorové proteiny - adenylátcykláza glykogenolýza, lipolýza, aktivace Ca 2+ kanálů - fosfolipáza C kontrakce hladkých svalů, žlázová sekrece - otvírač iontových kanálů RECEPTORY S TYROKYNÁZOVOU AKTIVITOU - receptory pro inzulin, růstové faktory, aj. - přenos signálu přes buněčnou membránu - fosforylace buněčných proteinů - stimulace procesů: např. transportu glukosy, syntéza enzymů apod. RECEPTORY REGULUJÍCÍ PROTEOSYNTÉZU (TRANSKRIPCI DNA) - receptory pro steroidní hormony a hormony štítné žlázy AGONISTÉ A ANTAGONISTÉ - agonisté chemické látky, které mají vysokou afinitu k receptoru a aktivují receptorový protein tzv. vnitřní aktivita (může se lišit) - antagonisté chemické látky, které se reversibilně vážou na receptor, ale neaktivují receptorový protein - blokace vazebných míst, proto aktivita vyvolaná agonistou je nižší TOXICKÉ ÚČINKY XENOBIOTIK - toxický účinek = výsledek interakce xenobiotika a organismu, který organismu škodí v krátkodobém nebo dlouhodobém horizontu, organismus (nebo jeho potomstvo) pozměňuje nebo i ničí - široké spektrum toxických účinků - vratné nevratné - zasahující jedince zasahující i jeho potomky TOXICITA - funkční toxicita = účinek na funkci systému - genotoxické účinky mutagenita, teratogenita, teratogenita - imunotoxické účinky alergie - orgánová toxicita = účinek na funkci orgánu - dermatotoxicita - hepatotoxicita 26

- pulmotoxicita - neurotoxicita - hematotoxicita GENOTOXICKÉ ÚČINKY - genetická informace: - pár bazí < gen < DNA < chromozom - mutageneze změna genetické informace (lat. mutatio = změna, řec. genaó = tvořím) ať již spontánní nebo vyvolaná vnějším vlivem - mutace probíhají i spontánně (evoluce reparační mechanismy) rychlostí asi 5 10 5 mutací na 1 gen za jednu generaci - působením xenobiotik může dojít ke změně genetické informace - chemomutace MUTACE PODLE STUPNĚ ÚČINKU NA GENETICKOU INFORMACI GENOVÁ MUTACE - změna v pořadí nebo počtu nukleotidů v DNA - vznik odlišného proteinu (změna účinnosti) ztráta funkce genu - metabolické poruchy (i vrozené) CHROMOSOMOVÁ MUTACE - změna v řetězci DNA vede ke změně struktury chromosomů - chromosomová aberace (lze pozorovat mikroskopicky) - změna buněčného dělení až smrt buňky 27

GENOMOVÉ MUTACE - změna počtu chromosomů v buňce a) polyploidie - znásobení počtu úplných chromosomových sad - přenáší se do další generace b) aneuploidie - snížení či zvýšení počtu jen určitých chromozomů - obvykle vede ke smrti buňky, nebo např. Downův syndrom MUTACE PODLE DRUHU BUNĚK GAMETICKÁ MUTACE - zárodečné buňky mohou být poškozeny před oplodněním - gametické mutace neslučitelné se životem - smrt gamet (jak vajíček, tak spermií) ovlivnění fertility - zvýšení četnosti potratů - gametické mutace slučitelné se životem - abnormální vývoj plodu (vrozené vady, teratogenita) snížení kvality života potomstva - mohou být přenosné i na další generace (změna genotypu) SOMATICKÁ MUTACE - mutace genetické informace tělních buněk - v embryonálním stádiu chybný vývoj orgánu - vrozené vady - případně potrat - v pozdějším stádiu života - poruchy metabolismu - smrt buňky - nádorové bujení (kancerogenese) MECHANISMY CHEMOMUTACE - xenobiotikum versus DNA - chemická reakce - adukce, interkalace PŘÍKLADY XENOBIOTIK - nitrosoguanidin - hydroxylamin - analogy basí (5-bromuracyl) - alkylační činidla - methylační činidla - polycyklické aromatické uhlovodíky - radikály ALKYLACE DNA - reaktivní organické látky (typicky: epoxidy, hydroxyderiváty, ionty) odštěpují karboniové 28

ionty typu CH 3 +, které reagují se skupinami bohatými na elektrony (NH, OH, =N ) bílkoviny, DNA, RNA 2 - vznikají mj. biotransformací původně neúčinné látky, zejména lipofilních xenobiotik - např. dimethylnitrosamin - bis(2-chlorethyl)methylamin - polycyklické aromatické uhlovodíky (PAU), angl. polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) - charakteristické strukturní uspořádání oblast zálivu (angl. bay region) CHEMICKÁ TRANSFORMACE BÁZÍ DNA - např. HNO 2 mění cytosin na uracyl, adenin na hypoxanthin INKORPORACE ABNORMÁLNÍCH ANALOGŮ - např. 5-bromuracyl (záměna za thymin) nebo 2-aminopurin INTERKALACE LIPOFILNÍCH MOLEKUL - např. pyren (podívat se na obrázek) TYPICKÉ FUNKČNÍ SKUPINY XENOBIOTIK S GENOTOXICKÝMI ÚČINKY 29

STANOVENÍ MUTAGENNÍCH ÚČINKŮ - epidemiologické studie - dlouhodobé testy na zvířatech (in vivo) - např. cytogenetická analýza kostní dřeně hlodavců - testy in vitro, např. Amesův test - zpětná mutace inhibovaných genů pro syntézu esenciálních aminokyselin KARCINOGENITA - karcinogenese nadměrné bujení buněk a tkání vedoucí k tvorbě nádorů - (řec. καρκινος = rak, řec. γενναν = tvořím) - kancerogenese (lat. cancer = rak) NÁDORY - benigní (nezhoubný) - nezakládá dceřiná ložiska a roste omezeně - maligní (zhoubný) - při růstu ničí okolní tkáně a zakládá dceřiná ložiska (metastázy) VZNIK NÁDORU ZPŮSOBEN - fyzikálně (UV záření) - chemicky - biologicky (onkoviry) CHEMICKÁ KARCINOGENITA - karcinogeny látky vyvolávající zhoubné bujení buněk a tkání - kokarcinogeny látky zesilující účinek karcinogenů ale samy nekarcinogenní - prekarcinogeny karcinogenní účinek mají až metabolity - asi 80 % genotoxických látek (mutagenů) je zároveň karcinogeny (mutagenní poškození reparačních mechanismů) - karcinogenní účinek mohou mít i látky nemutagenní (a obráceně) např. benzen, chloroform, 1,4- dioxan, trichlorethylen MECHANISMUS KARCINOGENESE - složitý, ztráta kontroly buněčného růstu (zpětné vazby proliferace) - nádorový proces může indukovat libovolné množství karcinogenu, v extrémním případě i jediná molekula - bezprahový účinek 30

- na druhé straně - karcinogenní látka se nemusí na místo účinku dostat - poškození DNA může být opraveno - mutace DNA nemusí být podstatná z hlediska dělení buňky - nádorová buňka může být zničena imunitním systémem - exposici karcinogenním látkám je třeba minimalizovat, nelze ji odstranit ( přirozené přírodní karcinogeny) - zjišťování karcinogenních vlastností je velmi obtížné - epidemiologické studie (nelze pro nové látky) - chronické testy na zvířatech (mezidruhové rozdíly!) - odhad z testů na mutagenitu - příklady karcinogenních látek - anorganické: arsen, berylium, kadmium, chrom, nikl, radon - organické - směsi: azbest, tabákový kouř, uhelný dehet - volné radikály (kyslík) - zacházení s karcinogeny upraveno předpisy - International Agency for Research on Cancer (IARC) http://www.iarc.fr/ 31

PROCENTUÁLNÍ ZASTOUPENÍ FAKTORŮ VYVOLÁVAJÍCÍCH RAKOVINU U LIDÍ - tabák, diety, sexuální chování, infekce TERATOGENITA - teratogeny chemikálie vyvolávající vrozené vady nebo abnormality (řec. τερατος = stvůra, řec. γενναν = tvořím) - zasahují do normálního embryonálního vývoje - čistý teratogen účinkuje bez změny genotypu - mění se jen fenotyp a změny nejsou dědičné - v období blastogenese (do 17. dne těhotenství) - buňky nejsou ještě diferencovány - při rozsáhlém poškození smrt embrya - při malém poškození náhrada buněk a dále normální vývoj bez vrozených vad (pokud nejde zároveň o mutagenní účinek) - nejkritičtější období organogenese (17. až 90. den těhotenství) - vývoj orgánů - poškození vede k degeneraci orgánů - po 60. dni vývoj dostatečně daleko riziko teratogenního účinku se snižuje - po ukončení organogenese - vznik malformací nemožný - může dojít k ovlivnění funkčního zrání orgánů, vrozená vada není anatomická, ale funkční (projeví se v pozdějším období) - embryotoxický účinek při vysoké míře poškození smrt embrya - teratogenní účinek je pokládán za prahový - vyvíjející organismus se do určité míry poškození regeneruje TESTOVÁNÍ TERATOGENITY - epidemiologické studie vzácné (Contergan) - testování in vivo náročné, na několika savčích druzích - látka podávána samičkám minimálně v období organogenese (nesmí dojít k úhynu samičky) TESTOVÁNÍ VÝVOJOVÉ (REPRODUKTIVNÍ) TOXICITY - mutagenita + teratogenita - vícegenerační testy - látka podávána samcům i samičkám i v období spermatogenese, dále po celou dobu gravidity a laktace a po narození mláďatům, atd. - velké mezidruhové rozdíly - nezbytné před uvedením nové látky na trh PŘÍKLADY TERATOGENNÍCH LÁTEK - antibiotika (tetracyklin) - cytostatika (aminoferin, cyklofosfamid, busulfan) - antithyroidní léky (methimazol) - chelatační látky - halogenované bifenyly - cigaretový dým - kokain - ethanol - ethylen oxid - ionty kovů (lithium, rtuť, olovo) - thalidomid - toluen 32

IMUNOTOXICKÉ ÚČINKY - imunitní systém chrání organismus před látkami organismu cizími (antigeny) - vliv xenobiotik na imunitní systém alergické reakce HYPERSENSIBILIZUJÍCÍ ÚČINEK, ALERGENY - alergeny chemikálie zvyšující aktivitu organismu neúměrnou změnou imunitní odezvy (řec. αλλος = jiný, řec. ενχερεια= činnost) - nepřiměřená kvalitativní / kvantitativní reakce na podnět antigenu - alergické onemocnění - kromě bílkovin (mikroorganismy) mohou imunitní reakci vyvolat i nízkomolekulární látky (hapteny), jejichž vazbou na bílkoviny organismu vlastní dojde ke konformační změně - imunitní odezva 1. senzibilizující expozice tvorba protilátek, aktivace T-buněk 2. provokující (výbavná) exposice další kontakt organismu s látkou vyvolá již alergickou reakci 33

ALERGIE BEZPROSTŘEDNÍHO TYPU - odezva několik minut po expozici - účinek histaminu, serotoninu uvolněných po reakci imunoglobulinu s látkou ALERGIE OPOŽDĚNÉHO TYPU - odezva se projeví až do 48 hodin - produkty aktivovaných lymfoidních buněk ALERGICKÉ PROJEVY - záněty kůže (alergické dermatitidy) - senná rýma - křeče dýchacích cest (astmatické záchvaty) - až anafylaktický šok (i smrt) - velký počet alergenů - přírodní látky: pyly, roztoči, prach, plísně - léčiva (antibiotika, acetylsalicylová kyselina - průmyslové chemikálie a produkty (formaldehyd) - anorganické ionty (nikl, chrom) - prakticky každý organismus je na něco alergický, otázkou je zda se realizuje expozice alergenem - četné alergeny jsou zároveň karcinogeny či mutageny - expozice nejčastěji kůží či sliznicí (senná rýma), ale i požitím - testování alergenů - obvykle kožní senzibilizace na morčatech - u člověka epikutální testy (terčíky s látkou přilepené na kůži) nebo sledování protilátek v krvi PULOMOTOXICKÉ LÁTKY: - asbest, berylium, oxid kademnatý, chlór, NO x, SO 2, O 3, fosgen, SiO 2 LÁTKY TOXICKÉ PRO CNS: - ionty Pb 2+, Hg 2+, methanol, halogenované ulovodíky, dimethylrtuť HEPATOTOXICKÉ LÁTKY: - berylium, tetrachlormethan, vinyliden chlorid NEUROTOXICKÉ LÁTKY: - ionty Pb 2+,akrylamid, sirouhlík, n-hexan NEFROTOXICKÉ LÁTKY: - chloroform, HgCl 2, hexachlorbutadien DERMATOTOXICKÉ ÚČINKY - leptavé účinky H+, resp. H O+, způsobují koagulaci tkání - silné kyseliny: - HCl - pouze změna ph - H 2 SO 4 - dehydratace - HNO 3 - oxidace, nitrace - ionty OH - působí zmýdelnění tkání, pronikají hlouběji - špatná hojivost ran 34

- oxidační činidla - reakce s proteiny, alkylace a acylace - organická rozpouštědla rozpouštění tuků ŠKÁLA PROJEVŮ JE ŠIROKÁ - indukce apoptosy (fyziologická smrt kožních buněk) - dermatitida (vředy, záněty) - fotosenzibilizace - akné (chlorová akné) - alergizace (kontaktní dermatitida) - změny pigmentace (např. arsen) - tvorba granulomů - nekrosa - karcinogenese PULMOTOXICKÉ ÚČINKY - dráždivý účinek xenobiotik na plíce - otok (edém) plic - astma, bronchitidy - pneumokoniosy změny struktury plic vlivem inhalace neutrálního prachu - silikosa, azbestosa - horečka slévačů alergické reakce na denaturované bílkoviny tvořící se v dýchacích cestách - rakovina plic (azbest) HEMATOTOXICKÉ ÚČINKY - krev: - krevní plasma a bílkoviny - červené krvinky (erytrocyty) - krevní destičky (trombocyty) - bílé krvinky (leukocyty) INHIBICE PŘENOSU KYSLÍKU 1. reakce s kyslíkem snížení jeho dostupnosti 2. blokování vazebného místa na nosiči (hemoglobin) - kompetitivní inhibice (CO, NO) 3. oxidace Fe 2+ Fe 3+ - projevuje se cyanosou (zmodráním), methemoglobinemie - oxyhemoglobin - karboxyhemoglobin (250 silnější vazba) 35

HEPATOTOXICKÉ ÚČINKY - játra jsou hlavím orgánem biotransformace - možné poškození metabolity - projevy hepatotoxického poškození - ztučnění jater (steatosa) CCl, ethanol - nekrosa hepatocytů dimethylformamid, Cu2+ - cholestatida - zadržování žluči 1,1-dichlorethylen, Mn2+ - cirrhosa - vinylchlorid, As3+ NEUROTOXICKÉ ÚČINKY NARKOTICKÝ ÚČINEK - rozpouštění těkavých lipofilních látek (diethylether, toluen, chloroform) v tukových strukturách membrán nervových vláken - reverzibilní brzděni přenosu nervového vzruchu DEGENERATIVNÍ POŠKOZENÍ NEURONU (PŘENOSU VZRUCHU): 1. organokovové sloučeniny rtuti, olova, akrylamid, sloučeniny hliníku, alkohol 2. n-hexan, akrylamid, CS, Pb 2+, PCB 3. Pb 2+, CN -, dichloroctová kyselina, hexachlorofen 4. bakteriální toxiny (botulotoxin), Pb 2+, nikotin, organofosfáty HODNOCENÍ TOXICITY XENOBIOTIK - toxické vlastnosti látek jsou hodnoceny: - na zvířatech (in vivo) experimentální toxikologie - na tkáňových a jiných kulturách (in vitro = ve skle) (např. bakteriální) - počítačovými modely (in silico = v křemíku) - predikční toxikologie - sběrem dat - pracovní lékařství a klinická toxikologie - z etických důvodů se pokusy na člověku neprovádějí - cílem je stanovení vlastností látek a stanovení příslušných limitů (ve vodách a ptravinách) ochrana života a zdraví - problémem je obrovské množství chemických látek (zejména organických) dnes několik desítek milionů sloučenin - prvním krokem je vždy studium chemické a toxikologické literatury (Chemical Abstracts, počítačové databáze) 36

TESTY NA ZVÍŘATECH (IN VIVO) - cesta pro získání většiny toxikologických údajů - existence mezidruhových rozdílů nesnadná interpretace dat (i když je něco pro zvíře netoxické, pro člověka to může toxické být) - klíčovou roli hraje: - správný výběr pokusného zvířete - vhodné uspořádání testu (cesta podání, dávkování) - správný postup získávání a interpretace dat - testuje se a) akutní toxicita b) subakutní toxicita c) chronická toxicita kancerogenita, mutagenita a genotoxicita - pro vlastní experimenty platí přísná pravidla (zákony a nařízení) - způsob ustájení (čistota, krmivo, světlo, teplo, vlhko, světlo-tma) - zdravotní kontrola zvířat (stres) - dodržování předepsaného postupu, protokoly - dodržování správné laboratorní praxe, kontroly a řízení kvality pokusů - každý test obvykle na alespoň dvou druzích zvířat (hlodavec nehlodavec) - obvykle parita pohlaví, vhodné stáří, a vždy jedna kontrolní skupina - v toxikologii nejčastěji: - laboratorní myš (Mus musculus) - laboratorní potkan (Rattus norvegicus) - králík domácí (Oryctolagus cuniculus) - pes domácí (Canis familiaris), plemeno Beagle - křeček zlatý-syrský (Mesocricetus auratus) TESTY NA AKUTNÍ TOXICITU - hodnoceny účinky po krátké době a jednorázovém podání - zásadní: druh aplikace, čas pozorování 1. Akutní orální toxicita - nejčastější úvodní test stanovení LD 50 - účinek látky podané v dávce *mg/kg+ v krátkém úseku (24 hod) - látka se nesmí absorbovat v dutině ústní aplikace kovovou sondou do žaludku - nejčastěji se používá potkan obojího pohlaví 2. Akutní inhalační toxicita - testování účinků plynů, par a aerosolů LC 50 [ml/m 3 ] - sleduje se úmrtí v důsledku nadýchání - hlava zvířete v inhalační komoře se stálou koncentrací testované látky (regulace plicní ventilace) 3. Akutní dermální toxicita - u látek s předpokládanou významnou kožní expozicí - depilace asi 10 % povrchu těla 24 hodin před nanesením toxické látky (ne holení, aby nevznikly rány) 37

- nanesení látky, zvíře fixováno, aby neolizovalo kontaktní místo 4. Akutní dermální dráždivost - účinek škodliviny přímo na depilovanou pokožku zvířete - nejčastěji používán albinotický králík - depilace asi 6 cm 2 povrchu těla 24 h před experimentem - nanesení 0,5 g nebo 5 ml testované látky - po 4 hodinách omytí vodou a pozorování změn - vratné změny kůže překrvení (erytém), otok (edém) tvorba puchýřků, pupínků a strupů vypadávání chlupů - nevratné změny kůže 5. Akutní podráždění (poleptání) oka - sledování účinku látky na oko pokusného zvířete - nejčastěji používán albinotický králík - aplikace 0,1 ml kapalné nebo 1 mg rozpuštěné látky (ph látky v rozmezí 2 11) do spojivkového vaku oka zvířete - používá se lokální anestetikum (0,5 % prokain) - působení po dobu 24 hodin, poté vymytí, příp. obarvení oka fuchsinem (zvýrazní poškození) - pozorování po 1, 24, 48 a 72 hod. lupou nebo mikroskopem - zjištění reverzibilních a ireverzibilních změn (druhé oko kontrola) TESTY NA SUBAKUTNÍ, SUBCHRONICKOU A CHRONICKOU TOXICITU - dlouhodobější testy trvající - 28 dní (subakutní toxicita) - 90 dní (subchronická toxicita) - více než 10 % doby života zvířete (chronická toxicita) - užitečné pro studium dlouhodobého působení xenobiotika - aplikace: orální, inhalační (výjimečně dermální) - obvykle se podává desetina LD 50, jednorázově po 24 hodinách - tři skupiny zvířat: pokusná, kontrolní a volná - pokusná zvířata umístěna v metabolických klecích (odběr výkalů, úprava vnitřní atmosféry) - u zvířat se sleduje - obsah studované látky (metabolitů) v moči a stolici - úmrtnost - růst, změny hmotnosti, potřeba vody a stravy - chování a ovlivnění podmíněných reflexů (neklid, apatičnost,...) - fyziologická vyšetření (plicní funkční testy, funkce ledvin a jater, EEG, EKG) - biochemická vyšetření (aktivita enzymů, hematologické vyšetření) - reprodukční schopnosti - po příslušné době utracení všech zvířat - anatomicko-patologická vyšetření (důležité pro odhalení karcinogenů) - zjištění kumulačního efektu - časově, experimentálně i ekonomicky náročné 38

ALTERNATIVNÍ METODY TESTOVÁNÍ TOXICITY - vyvíjeny z etických i ekonomických důvodů SNÍŽENÍ SPOTŘEBY LABORATORNÍCH ZVÍŘAT (REDUCTION) - alternativní testy získání LD 50 - redukce počtu zvířat ve skupině - například NÁHRADA KLASICKÝCH TESTŮ (REPLACEMENT) - testy ve zkumavce (in vitro) - tkáňové kultury - bílé krvinky - hepatocyty - testy na kuřecích vejcích - testy na nižších jednoduchých organismech - bakterie (Phosphobacter Microtox) - prvoci (bičíkovci Tetrahymena pyriformis) - rybky (paví očka) - červi (nítěnka Tubifex tubifex) 39