PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. SK testů pro použití s přístrojem Autostainer Link 48. Použití k určenému účelu Pro diagnostiku in v tro.

PD-L1 IHC 28-8 pharmdx SK005 50 testů pro použití s přístrojem Autostainer Link 48 Použití k určenému účelu Pro diagnostiku in v tro. PD-L1 IHC 28-8 pharmdx je kvalitativní imunohistochemický test využívající králičí monoklonální protilátku Anti-PD-L1, klon 28-8, určený k použití při detekci proteinu PD-L1 u neskvamózního nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC) v tkáních fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu (FFPE) a tkáních melanomu pomocí vizualizačního systému EnVision FLEX v přístroji Autostainer Link 48. Exprese proteinu PD-L1 je definována jako procento nádorových buněk vykazujících pozitivní membránové barvení jakékoli intenzity. Exprese PD-L1 zjištěná testem PD-L1 IHC 28-8 pharmdx u neskvamózního NSCLC může být spojena se zvýšeným přežitím u přípravku OPDIVO (nivolumab). Exprese PD-L1 zjištěná testem PD-L1 IHC 28-8 pharmdx v melanomu může být použita jako pomůcka k posouzení stavu pacientů, kterých je zvažována kombinace léčby OPDIVO (nivolumab) a YERVOY (ipilimumab). Souhrn a výklad Vazba ligandů PD-1, PD-L1 a PD-L2 k receptoru PD-1 na T-buňkách inhibuje proliferaci T-buněk a produkci cytokinů. Up-regulace ligandů PD-1 se vyskytuje u některých nádorů a signalizuje, že prostřednictvím této dráhy lze přispět k inhibici aktivních T-buněk imunitního dozoru nádorů (1). OPDIVO (nivolumab) je humanizovaná IgG4 monoklonální protilátka, která se váže na receptor PD-1 a blokuje jeho interakci s PD-L1 a PD-L2, uvolňuje inhibici imunitní odpovědi zprostředkovanou po dráze PD-1, včetně protinádorové imunitní odpovědi (2). Na modelech syngenních myších nádorů vedlo blokování aktivity PD-1 ke snížení růstu nádoru (3). Klinický přínos protilátky OPDIVO a klinická prospěšnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byla zkoumána v NSCLC a melanomu. Neskvamózní NSCLC: Detekce nádorových buněk exprimujících PD-L1 ve vzorku neskvamózního nemalobuněčného karcinomu plic pacienta může znamenat zvýšený přínos pro přežití v případě léčby přípravkem OPDIVO (nivolumab). Vzorky pacientů v klinických studiích ODPIVO, financovaných společností Bristol-Myers Squibb, byly podrobeny testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. V klinické studii CA209057 se zkoumala klinická validita testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx za účelem posouzení stavu PDL1 u pacientů neskvamózního NSCLC léčených přípravkem OPDIVO (5,11). Melanom: Cytotoxický antigen-4 (CTLA-4) související s lymfocytem T je záporným regulátorem aktivity T-buněk. YERVOY (ipilimumab) je monoklonální protilátkou, která se váže na CTLA-4 a blokuje interakci antigenu CTLA-4 s jeho ligandy, CD80/CD86. Bylo ukázáno blokování CTLA-4 pro augmentaci aktivace a proliferace T-buněk, což přispívá k celkovému zvýšení protinádorové imunitní odpovědi (4). PD-1 a CTLA-4 inhibují protinádorovou imunitu prostřednictvím komplementárních a neredundantních mechanizmů. Monoterapie OPDIVO a kombinace OPDIVO a YERVOY prokázaly značně vyšší zlepšení v přežití bez progrese při použití samotné protilátky YERVOY u pacientů s pokročilým melanomem, kteří před tím léčení nebyli (8-10). Vzorky tkáně melanomu od pacientů léčených protilátkami OPDIVO v klinických studiích financovaných společností Bristol-Myers Squibb byly podrobeny testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. V klinické studii CA209067 se zkoumala klinická validita testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx za účelem posouzení exprese PDL1 u pacientů s melanomem léčených protilátkami OPDIVO, OPDIVO v kombinaci s protilátkou YERVOY a samotnou protilátkou YERVOY. OPDIVO a YERVOY jsou obchodní známky vlastněné společností Bristol-Myers Squibb. Princip metody Test PD-L1 IHC 28-8 pharmdx obsahuje optimalizovaná činidla a protokol nutný k dokončení postupu IHC barvení vzorků FFPE pomocí přístroje Autostainer Link 48 a modulu pro předběžné zpracování vzorků PT Link (6). Po inkubaci s primární monoklonální protilátkou proti PD-L1 nebo činidlem pro negativní kontrolu (Negative Control Reagent, NCR) se vzorky inkubují se specifickou protilátkou proti hostitelskému druhu primární protilátky a pak se vzorky inkubují s vizualizačním činidlem připraveným k okamžitému použití, které obsahuje molekuly sekundárních protilátek a molekuly křenové peroxidázy navázané na společný hlavní řetězec dextranového polymeru. Enzymatická přeměna následně přidaného chromogenu vede k vytvoření viditelného reakčního produktu v místě protilátky. Barva chromogenní reakce je zesílena chromogenním činidlem. Vzorek může být poté kontrastně podbarven a překryt krycím sklíčkem. Výsledky se interpretují pomocí světelného mikroskopu. K validaci sérií barvení slouží kontrolní sklíčka se dvěma humánními buněčnými liniemi fixovanými ve formalínu a zalitými v parafínu. Dodané materiály PD-L1 IHC 28-8 pharmdx (kód SK005) Materiály uvedené níže vystačí pro 50 testů (50 sklíček inkubovaných s primární protilátkou proti PD-L1 a 50 sklíček inkubovaných s odpovídajícím činidlem pro negativní kontrolu, celkem 100 testovacích sklíček). Další primární protilátka proti PD-L1 se dodává v soupravě pro barvení 15 kontrolních sklíček s buněčnými liniemi. Počet testů vychází z použití 2 150 µl každého činidla na sklíčko s výjimkou DAB+ a roztoku Target Retrieval Solution. (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 1/17

Souprava obsahuje dostatečné množství materiálů pro až 15 samostatných sérií barvení. Množství Popis 1 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Pufrovaný roztok obsahující peroxid vodíku, detergent a 0,015 mol/l azidu sodného. 1 19,5 ml Primary Antibody: Monoclonal Rabbit Anti-PD-L1, Clone 28-8 MONOCLONAL RABBIT ANTI-PD-L1 CLONE 28-8 Monoklonální králičí anti-pd-l1 v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného. 1 15 ml Negative Control Reagent* NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonální králičí kontrolní IgG protilátka v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného. *Monoklonální králičí kontrolní IgG protilátka se prodává na základě licence od společnosti Cell Signaling Technology. 1 34,5 ml LINKER, Anti-Rabbit LINKER, ANTI-RABBIT Myší sekundární protilátka proti králičím imunoglobulinům v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku s 0,015 mol/l azidu sodného. 1 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextran spolu s molekulami peroxidázy a molekulami kozích sekundárních protilátek proti králičím a myších imunoglobulinům v pufrovaném proteinovém stabilizačním roztoku a antimikrobiální látce. 15 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Pufrovaný roztok obsahující peroxid vodíku a antimikrobiální látku. 1 5 ml Chromogen DAB+ DAB+ CHROMOGEN 3,3 -diaminobenzidin tetrahydrochlorid v organickém rozpouštědle. 1 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Síran měďnatý ve vodě. 6 30 ml Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Pufrovaný roztok, ph 6,1, obsahující detergent a antimikrobiální látku. 15 sklíček Kontrolní sklíčka PD-L1 IHC 28-8 pharmdx KONTROLNÍ SKLÍČKA Na každém sklíčku jsou části dvou peletovaných buněčných linií fixovaných ve formalinu a zalitých v parafínu: NCI-H226** s pozitivní expresí proteinu PD-L1 a MCF-7 s negativní expresí proteinu PD-L1. PD-L1, SK005 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1 negativní NCI-H226: PD-L1 pozitivní **Poděkování Dr. AF Gazdarovi a Dr. JD Minnovi z NIH za jejich přínos ve vývoji NCI-H226 (číslo ATCC: CRL-5826 )(7) (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 2/17

Poznámka: Všechna obsažená činidla jsou vytvořena speciálně pro použití s touto soupravou. Aby bylo možné test provést podle uvedeného postupu, nelze používat žádné náhrady kromě roztoku EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) (kód K8005). Test PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byl uzpůsoben pro použití s přístrojem Autostainer Link 48. Podrobnější informace viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48 a PT Link. Další potřebné materiály, které nejsou součástí dodávky Modul pro předběžné zpracování vzorků PT Link Pre-treatment Module (kód PT100/PT101) Přístroj Autostainer Link 48 (kód AS480) Pufr EnVision FLEX Wash Buffer (20x) (kód K8007) EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód K8008) Destilovaná nebo deionizovaná voda (v kvalitě činidla) Časovač Pozitivní a negativní tkáně pro kontrolu zpracování (viz část Kontrola kvality a tabulka 1) Mikroskopická sklíčka: Mikroskopická sklíčka Dako FLEX IHC (kód K8020) nebo kontrolní sklíčka Fisherbrand Superfrost Plus. Krycí sklíčka Trvalé uzavírací médium a pomocná činidla potřebná pro vytvoření mikroskopického preparátu pod krycími sklíčky Světelný mikroskop (zvětšení objektivu 4x 40x) Bezpečnostní opatření 1. Pro diagnostiku in vitro. 2. Určeno pro profesionální uživatele. 3. Tento výrobek obsahuje azid sodný (NaN3), který je v čisté formě vysoce toxický. Přestože koncentrace azidu sodného ve výrobku se neklasifikuje jako nebezpečná, může usazenina NaN3 reagovat s olovem a mědí v odpadním potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množstvím vody, aby nedocházelo k usazování azidů kovů v potrubí (12). 4. Primární protilátka, činidlo pro negativní kontrolu, Linker a vizualizační činidlo obsahuje materiál zvířecího původu. 5. Vzorky před a po fixaci a všechny jim vystavené materiály by měly být považovány za potenciálně infekční a mělo by se s nimi nakládat s náležitou opatrností (13). 6. Inkubační časy, teploty nebo metody jiné než ty uvedené, mohou vést k chybným výsledkům. 7. Činidla jsou optimálně naředěna. Další ředění může vést ke ztrátě barvení protilátky. 8. Vizualizační činidlo, tekutý chromogen DAB+ a připravený roztok substrát-chromogen DAB+ mohou být negativně ovlivněny, pokud jsou vystaveny intenzivnímu světlu. Neuchovávejte komponenty systému a neprovádějte barvení za silného světla, jako je například přímé sluneční světlo. 9. Rezidua parafínu mohou vést k falešně negativním výsledkům. 10. Použití objemů činidel jiných než doporučených může vést ke ztrátě viditelné imunoreaktivity PD-L1. 11. Velké řezy tkání pokrývající 2/3 sklíčka mohou vyžadovat 3x150 µl činidla. 12. Obecně platí, že osoby mladší 18 let s tímto přípravkem nesmějí pracovat. Uživatelé musí být pečlivě proškoleni ve správných pracovních postupech, seznámeni s nebezpečnými vlastnostmi přípravku a nezbytnými bezpečnostními pokyny. Další informace viz bezpečnostní list (Safety Data Sheet, SDS). 13. Používejte odpovídající osobní ochranné prostředky, aby nedošlo k zasažení očí nebo pokožky. 14. Nespotřebované roztoky je nutno likvidovat v souladu s místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. 15. Bezpečnostní list pro profesionální uživatele je k dispozici na vyžádání. Nebezpečí Chromogen DAB+: 1 5% bifenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammonium-tetrachlorid H350 Může vyvolat rakovinu. H341 Podezření na genetické poškození. P201 Před použitím si obstarejte speciální instrukce. P202 Nepoužívejte, dokud jste si nepřečetli všechny pokyny pro bezpečné zacházení a neporozuměli jim. P280 Používejte ochranné rukavice. Používejte ochranu očí a obličeje. obličejový štít. P308 + P313 PŘI expozici nebo podezření na ni: Vyhledejte lékařskou pomoc. P405 Skladujte uzamčené. P501 Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. Výstraha Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1 5% kyselina citronová H319 Způsobuje vážné podráždění očí. H411 Toxický pro vodní organismy, s dlouhodobými účinky. P280 Používejte ochranu očí a obličeje. P273 Zabraňte úniku do životního prostředí. P264 Po manipulaci si důkladně omyjte ruce. P305 + P351 + P338 PŘI ZASAŽENÍ OČÍ: Několik minut opatrně oplachujte vodou. Vyjměte kontaktní čočky, jsou-li nasazeny a pokud je lze vyjmout snadno. Pokračujte ve vyplachování. P337 + P313 Přetrvává-li podráždění očí: Vyhledejte lékařskou pomoc. P501 Odstraňte obsah a obal v souladu se všemi místními, oblastními, národními a mezinárodními předpisy. (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 3/17

Uchovávání Všechny součásti PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, včetně kontrolních sklíček, uchovávejte v původním balení v temnu při teplotě 2 8 C, pokud je nepoužíváte s přístrojem Autostainer Link 48. Nepoužívejte soupravu po uplynutí doby exspirace vytištěné na vnějším obalu soupravy. Pokud se činidla skladují za jakýchkoli jiných podmínek než uvedených v příbalovém letáku, musí uživatel tyto podmínky ověřit. Nestabilita přípravku se neprojevuje žádnými výraznými známkami, proto by vzorky pozitivní a negativní kontroly měly být vždy zpracovávány spolu se vzorky pacienta. Příprava vzorku Se vzorky se musí manipulovat tak, aby tkáň pro IHC barvení zůstala chráněna. Všechny vzorky tkání by se měly zpracovávat podle standardních metod. Řezy zalité v parafínu Tkáně fixované ve formalinu a zalité v parafínu jsou vhodné pro použití. Doporučené podmínky zpracování a manipulace: <30 minut od odběru vzorku do jeho ponoření do fixativu, a 24 48hodinová fixace v 10% neutrálním pufrovaném formalinu. Alternativní fixativa nebyla validována a mohou vést k nesprávným výsledkům. Vzorky by měly mít tloušťku 3 nebo 4 mm, měly by být fixované v 10% neutrálním pufrovaném formalinu, dehydrované a vyčištěné v sérii alkoholů a xylenu, po kterém následuje infiltrace s roztaveným parafínem. Teplota parafínu by neměla přesáhnout 60 C. Vzorky tkání je nutno rozřezat na řezy o tloušťce přibližně 4 5 µm. Po vytvoření řezů by tkáň měla být připevněna na nabitá sklíčka Fisherbrand Superfrost Plus, nebo na mikroskopická sklíčka FLEX IHC Dako (kód K8020) a vložena na 1 hodinu do pece při teplotě 58 ± 2 C. Chcete-li zachovat antigenicitu měly by se tkáňové řezy, jakmile jsou umístěny na sklíčka, uchovávat v temnu při teplotě 2 8 C, nebo při pokojové teplotě do 25 C, a barveny do 4 měsíců po nařezání. Teplota při skladování nebo manipulaci by nikdy překročit 25 C, a to v žádném okamžiku po umístění na sklíčka, aby se zajistila integrita a antigenicita tkáně. Použití PD-L1 IHC 28-8 pharmdx na dekalcifikovaných tkáních nebylo validováno a nedoporučuje se. Příprava činidla Před barvením je třeba připravit následující činidla: Roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x) Připravte si dostatečné množství roztoku 1x Target Retrieval Solution, Low ph (50x) jeho rozředěním vodou v kvalitě činidla v poměru 1:50; ph roztoku 1x Target Retrieval Solution musí být 6,1 ± 0,2. Jedna 30ml lahvička roztoku Target Retrieval Solution, Low ph (50x), rozředěného v poměru 1:50 poskytne 1,5 l 1x činidla stačí na naplnění jedné nádržky přístroje PT Link a ošetření až 24 sklíček na jedno použití. Roztok 1x Target Retrieval Solution zlikvidujte po třech použitích a nepoužívejte jej déle než 5 dní po rozředění. V případě potřeby je k dispozici další roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), pod kódem K8005. Pufr EnVision FLEX Wash Buffer (20x) Připravte si dostatečné množství pufru Wash Buffer rozředěním pufru Wash Buffer 20x v poměru 1:20 vodou v kvalitě činidla pro mytí. Nespotřebovaný roztok činidla 1x skladujte při teplotě 2 8 ºC ne déle než jeden měsíc. Čidlo zlikvidujte, pokud je zakalené. Podrobnější informace viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48. Pufr EnVision FLEX Wash Buffer (20x) je k dispozici pod kódem K8007. Roztok substrát-chromogen DAB+ Tento roztok by měl být před použitím důkladně promíchán. Jakékoliv sraženina v roztoku nemá vliv na kvalitu barvení. Pro přípravu roztoku substrát-chromogen DAB+ přidejte 1 kapku chromogenu Liquid DAB+ Chromogen na ml pufru DAB+ Substrate Buffer a promíchejte. Připravený substrát-chromogen je stabilní po dobu 5 dnů, pokud je uchováván v temnu při teplotě 2 8 C. Důležitá upozornění: Pokud použijete celou lahev pufru DAB+ Substrate Buffer, přidejte 9 kapek chromogenu DAB+. Ačkoli na štítku je uvedeno 7,2 ml, jedná se o použitelné množství, ale není připočten mrtvý objem v lahvi. Barva chromogenu Liquid DAB+ Chromogen v lahvi se může lišit, od bezbarvé po fialově-hnědou. Tím není ovlivněna výkonnost přípravku. Ředění provádějte podle pokynů výše. Nadměrné přidání chromogenu Liquid DAB+ Chromogen do pufru DAB+ Substrate Buffer povede ke zhoršení pozitivního signálu. Postup barvení pomocí přístroje Autostainer Link 48 Poznámky k postupu Uživatel by si měl před použitím pečlivě přečíst tyto pokyny a seznámit se se všemi komponenty a vybavením (viz Bezpečnostní opatření). Všechna činidla musí být před imunologickým barvením ekvilibrována na pokojovou teplotu (20 25 C). Stejně tak by se všechny kroky inkubace měly provádět za pokojové teploty. Řezy tkání nesmí během barvení uschnout. Řezy suché tkáně mohou zvýraznit nespecifické barvení. (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 4/17

Všechny požadované kroky a časy inkubace jsou naprogramovány v softwaru Dako Link. Podrobnější informace o programování protokolů a vkládání sklíček a činidel viz návod k použití přístroje Autostainer Link 48 a PT. Poznámka: Činidla a pokyny dodávané s tímto systémem byla vytvořena za účelem optimálního výkonu při použití s doporučenými činidly a materiály. Další ředění činidel nebo pozměnění časů inkubace nebo teplot může vést k chybným nebo nesouhlasným výsledkům. Protokol barvení V možnostech rozevírací nabídky softwaru DakoLink vyberte protokol barvení PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Všechny požadované kroky a časy inkubace pro barvení jsou naprogramovány v softwaru DakoLink. Pokud na vašem serveru nejsou příslušné protokoly PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, kontaktujte svého místního zástupce technických služeb. Krok 1: Postup deparafinizace, rehydratace a vyhledání cíle (3 v 1) Doporučený postup: Podrobné informace viz návod k použití přístroje PT. Nastavte funkci Preheat and Cool (Předehřátí a ochlazování) v přístroji PT Link (kód PT100/PT101) na 65 C. Funkci Heat (Ohřev) nastavte na 97 C po dobu 20 minut. Naplňte každou nádrž přístroje PT Link 1,5 l pracovního roztoku Target Retrieval Solution, Low ph, 1x pro pokrytí řezů tkáně. Předehřejte roztok Target Retrieval Solution na 65 C. Ponořte stojánky Autostainer s řezy tkáně FFPE na sklíčkách do předehřátého roztoku Target Retrieval Solution, Low ph, (1x pracovní roztok) v nádržce přístroje PT Link. Inkubujte 20 minut při teplotě 97 C. Jakmile uplyne doba inkubace pro vyhledání cíle a dojde k poklesu teploty na 65 C, vyjměte každý stojan se sklíčky Autostainer z nádržky přístroje PT Link a ihned přemístěte stojan Autostainer se sklíčky do nádržky (např. PT Link Rinse Station, kód PT109) s rozředěným pufrem Wash Buffer o pokojové teplotě (kód K8007). Ponechte sklíčka v rozředěném pufru Wash Buffer o pokojové teplotě po dobu 5 minut. Krok 2: Postup barvení Po deparafinaci, rehydrataci a vyhledání cíle (3 v 1) se stojánky Autostainer se sklíčky vloží do přístroje Autostainer Link 48. Pomocí pufru zajistěte, aby sklíčka zůstala vlhká během vkládání a před spuštěním série. Přístroj provede proces barvení, tj. aplikuje příslušné činidlo, monitoruje časy inkubace a opláchne sklíčka mezi jednotlivými činidly. Časy pro jednotlivá činidla jsou naprogramovány v softwaru Dako Link. Krok 3: Kontrastní barvivo Sklíčka by měla být kontrastně podbarvována po dobu 7 minut EnVision FLEX Hematoxylin (Link) (kód K8008). Inkubační doba hematoxylinu je předprogramována v protokolu. Krok 4: Montáž Je vyžadováno bezvodé permanentní uzavírací médium. Poznámka: U některých obarvených sklíček se může po určité době vyskytnout blednutí v závislosti na několika faktorech, například na kontrastním podbarvení, uzavíracích materiálech a metodách a na podmínkách uchovávání sklíček. Pro minimalizaci vyblednutí uchovávejte sklíčka v temnu při pokojové teplotě (20 25 C). Kontrola kvality Činidla PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byla z hlediska kvality kontrolována imunohistochemicky za použití vyhledávání cíle a postupů barvení uvedených výše. Odchylky od doporučených postupů pro fixaci tkání, zpracování a zalití může vést ke značné variabilitě výsledků získaných v laboratoři uživatele. Každá série barvení by měla být podrobena kontrolám kvality. Tyto kontroly kvality jsou uvedeny v tabulce 1 a obsahují: vzorky tkáně pacienta obarvené hematoxylinem a eosinem (H&E); laboratoří dodané pozitivní a negativní kontrolní tkáně; a kontrolní sklíčko dodané společností Dako (15). V USA prostudujte zásady kontroly kvality patologů z College of American Pathologists (CAP) Certification Program for Immunohistochemistry (certifikační program pro imunohistochemii), další informace viz též zajištění kvality CLSI pro imunocytochemii, schválené pokyny (14). Ověření stanovení Před prvním použitím barvicího systému v rámci diagnostického postupu by měl uživatel ověřit provedení rozboru tak, že jej otestuje na sérii laboratoří dodaných pozitivních a negativní tkáních se známými IHC charakteristikami. Viz postupy kontroly kvality dříve uvedené v této části přílohy k přípravku. Tyto postupy kontroly kvality by se měly opakovat pro každou novou soupravu, nebo kdykoli dojde ke změně v testovacích parametrech. Možnosti řešení potenciálních problémů, jejich příčiny a navrhovaná nápravná opatření jsou uvedeny v tabulce 12. Interpretace zbarvení neskvamózní NSCLC a melanom Sklíčka by měl vyhodnotit patolog za použití světelného mikroskopu. Při hodnocení imunohistochemického barvení a interpretaci postupujte následovně: pro prvotní posouzení celých vzorků lze použít objektiv se 4násobným zvětšením a poté stanovit výsledek za použití objektivu se zvětšením 10 20x (v případě potřeby lze pro ověření použít 40x). Barvení PD-L1 je charakterizováno hnědou reakcí produktu (3,3 -diaminobenzidin, DAB). Barvení PD-L1-pozitivní je definováno jako kompletní obvodové a/nebo částečné lineární barvení plazmatické membrány nádorových buněk jakékoli intenzity. Vyhodnotit se musí celý vzorek. Všechny životaschopné nádorové buňky na celém obarveném sklíčku pacienta musí být vyhodnoceny a zahrnuty do interpretace exprese PD-L1. Na obarveném sklíčku pacienta musí být přítomno minimálně 100 životaschopných nádorových buněk, aby bylo možné stanovit procenta obarvených buněk exprimujících PD-L1. Cytoplazmatické barvení, pokud je přítomno, se do interpretace nezahrnuje. Nemaligní buňky a buňky imunitního systému (např. infiltrující lymfocyty nebo makrofágy) mohou být také obarveny PD-L1; ale do interpretace pro stanovení PD-L1 pozitivity se nezahrnují. (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 5/17

POZNÁMKA: Při interpretaci vzorků od pacientů s melanomem se může vyskytovat hnědá pigmentace melanomu. Melanin musí být vyloučen, když se provádí exprese zabarvení plazmatické membrány; porovnání s následným sklíčkem zbarveným pomocí NCR může být užitečné pro identifikaci a vyloučení obsahu melaninu. Pokud velmi zvýšený melanin brání expresi zabarvení plazmatické membrány nádorových buněk, vzorek lze vyloučit z interpretace a lze jej považovat za neurčitý. Každá série barvení sklíček by měla být vyšetřena v pořadí uvedeném v tabulce 1 pro určení platnosti barvení série a možnosti posouzení barvení vzorku tkáně. Další pokyny viz příručka interpretací PD-L1 IHC 28-8 pharmdx pro neskvamózní nemalobuněčný karcinom plic nebo melanom. Tabulka 1: Doporučené pořadí hodnocení sklíček Vzorky Zdůvodnění Požadavky 1. H&E (dodaná laboratoří) Barvení vzorku tkáně hematoxylinem a eosinem (H&E) se hodnotí jako první pro posouzení histologické a konzervační kvality tkáně. 2. Kontrolní sklíčko (dodává spol. Dako) Kontrolní sklíčko s buněčnými liniemi barvené primární protilátkou PD-L1 od PD-L1 IHC 28-8 pharmdx by mělo být vyšetřeno za účelem zjištění, zda všechna činidla fungují správně. Kontrolní sklíčko obsahuje peletu s PD-L1-pozitivními buněčnými liniemi a s PD-L1-negativními buněčnými liniemi. Test PD-L1 IHC 28-8 pharmdx a barvení H & E by se měly provádět na sériových řezech ze stejného parafínového bločku vzorku. Tkáňové vzorky by měly být neporušené, dobře zachovalé a měly by potvrdit indikaci nádoru. Jedno kontrolní sklíčko se obarví primární protilátkou proti PD-L1 v každé sérii barvení. Kritéria přijatelnosti NCI-H226 (PD-L1-pozitivní kontrolní buněčná linie): Barvení plazmatické membrány u 80 % buněk o průměrné intenzitě barvení 2+. Nespecifické barvení o intenzitě <1+. Kritéria přijatelnosti MCF-7 (PD-L1-negativní kontrolní buněčná linie): Nespecifické barvení. Nespecifické barvení o intenzitě <1+. Poznámka: někdy lze u buněčné pelety MCF-7 pozorovat barvení několika buněk. Platí následující kritéria přijatelnosti: přítomnost 10 buněk celkem se zřetelným zbarvením plazmatické membrány, nebo s cytoplazmatickým barvením s intenzitou 1+ uvnitř hranic buněčné pelety MCF-7 je přijatelná. 3. Sklíčka s pozitivní kontrolní tkání (dodaná laboratoří) 4. Sklíčka s negativní kontrolní tkání (dodaná laboratoří) Poté by měla být vyšetřena sklíčka s pozitivní kontrolní tkání obarvenou primární protilátkou proti PD-L1 a činidlem pro negativní kontrolu. Tato sklíčka ověřují účinnost metody fixace a cílového procesu vyhledání. Známé kontrolní vzorky pozitivní tkáně by se měly používat pouze ke sledování správného zpracování tkáně a testovacích činidel, NIKOLI jako pomůcka pro diagnostiku vzorků pacienta. Poté by měla být vyšetřena sklíčka s negativní kontrolní tkání (o známé PD-L1 negativitě) obarvenou primární protilátkou proti PD-L1 a činidlem pro negativní kontrolu, a to za účelem ověření specificity značení cílového antigenu primární protilátkou. Alternativně mohou negativní části pozitivní kontrolní tkáně sloužit jako negativní kontrolní tkáň, ale to by mělo být ověřeno uživatelem. Pokud žádná z kontrolních buněčných linií toto kritérium nesplní, budou výsledky testů vzorků pacienta považovány za neplatné. Kontrolními vzorky by měly být biopticky nebo chirurgicky odebrané vzorky stejného nádoru jako pacientův vzorek, které jsou co nejrychleji fixovány, zpracovány a zality stejným způsobem, jako pacientovy vzorky. Pro interpretaci výsledků použijte intaktní vzorky, protože nekrotické nebo degenerované buňky se často barví nespecificky. Tkáně vybrané jako kontrolní vzorky pozitivní tkáně by měly při barvení PD-L1 vykazovat slabé až středně pozitivní barvení, aby pomohly odhalit jemné změny v citlivosti testu. Do každé série barvení by se měla přidat dvě sklíčka s pozitivní kontrolní tkání. Sklíčko obarvené PD-L1: Měla by být pozorována přítomnost hnědého zabarvení plazmatické membrány. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Sklíčko obarvené činidlem pro negativní kontrolu: Žádné barvení membrány. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Pokud kontrolní vzorky pozitivní tkáně selžou v demonstraci příslušného pozitivního barvení, budou výsledky testů vzorků považovány za neplatné. Kontrolními vzorky by měly být biopticky nebo chirurgicky odebrané vzorky stejného nádoru jako pacientův vzorek, které jsou co nejrychleji fixovány, zpracovány a zality stejným způsobem, jako pacientovy vzorky. Do každé série barvení by se měla přidat dvě sklíčka s negativní kontrolní tkání. Sklíčko obarvené PD-L1: Žádné barvení membrány u nádorových buněk. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Sklíčko obarvené činidlem pro negativní kontrolu: Žádné barvení membrány. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Pokud na sklíčkách s negativní kontrolní tkání dojde k nechtěnému specifickému zbarvení plazmatické membrány, budou výsledky testů vzorků pacienta považovány za neplatné. (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 6/17

5. Sklíčko s tkání pacienta obarvenou činidlem pro negativní kontrolu 6. Sklíčko s tkání pacienta obarvenou primární protilátkou proti PD-L1. Dále vyšetřete vzorky pacienta ošetřené činidlem pro negativní kontrolu od PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Činidlo pro negativní kontrolu se používá namísto primární protilátky a pomůcek pro interpretaci specifického barvení v místě protilátky. Jako poslední vyšetřete celé sklíčko se vzorky pacienta obarvené primární protilátkou proti PD-L1 z testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Konkrétní informace ohledně imunoreaktivity PD-L1 IHC 28-8 pharmdx viz kapitoly Souhrn a výklad, Omezení a Charakteristiky účinnosti. Absence barvení plazmatické membrány ověřuje specifické značení cílového antigenu primární protilátkou PD-L1. Nespecifické barvení by mělo být 1+. Pozitivní intenzitu barvení je třeba posuzovat v kontextu jakéhokoliv nespecifického zbarvení pozadí zaznamenaného na sklíčku s činidlem pro negativní kontrolu ve stejné sérii. U každého imunohistochemického testu negativní výsledek znamená, že protilátka nebyla detekována, ale nutně to neznamená, že protilátka nebyla v analyzovaných buňkách/tkáních přítomna. Všechny životaschopné nádorové buňky na celém obarveném sklíčku pacienta musí být vyhodnoceny a zahrnuty do interpretace exprese PD-L1. Na obarveném sklíčku pacienta musí být přítomno minimálně 100 životaschopných nádorových buněk, aby bylo možné stanovit procenta obarvených buněk exprimujících PD-L1. Všeobecná omezení 1. Imunohistochemie je vícekrokový diagnostický postup, který vyžaduje specializované zaškolení ve výběru vhodných činidel a tkáně, fixaci a zpracování; přípravě imunohistochemických sklíček a interpretaci výsledků barvení. 2. Barvení tkání závisí na manipulaci a zpracování tkáně před barvením. Nesprávná fixace, zmrazení, rozmrazování, mytí, sušení, zahřívání, řezání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může způsobovat artefakty, zachycení protilátky nebo falešně negativní výsledky. Nekonzistentní výsledky mohou vzniknout kvůli odchylkám v metodách fixace a zalití nebo v důsledku skrytých nepravidelností tkání. 3. Nadměrné nebo neúplné kontrastní podbarvení může ohrozit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace pozitivního barvení, nebo jeho nepřítomnosti, musí být vyhodnocena v kontextu klinických projevů, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli barvení, nebo jeho nepřítomnosti, musí být doplněna morfologickými studiemi, řádnými kontrolami a dalšími diagnostickými testy. Za interpretaci barveného sklíčka zodpovídá kvalifikovaný patolog, který zná použité protilátky, činidla a použité metody. Barvení se musí provádět v certifikované laboratoři s příslušným oprávněním a pod dohledem kvalifikovaného patologa zodpovědného za hodnocení barvených sklíček a zaručení adekvátnosti pozitivních a negativních kontrol. 5. U tkání osob infikovaných virem hepatitidy B a s povrchovým antigenem hepatitidy B (HBsAg) se může projevovat nespecifické barevní křenovou peroxidázou (15). 6. Možnost neočekávané reakce nemůže být zcela vyloučena u testovaných typů tkání, a to v důsledku biologické variability exprese antigenu v novotvarech nebo jiných patologických tkáních. Pokud zdokumentujete neočekávané reakce, kontaktujte technickou podporu společnosti Dako. 7. K falešně pozitivním výsledkům může docházet v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo substrátu reakčních produktů. Mohou být také způsobeny pseudoperoxidázovou aktivitou (erytrocyty) a aktivitou endogenní peroxidázy (cytochrom c) (14). 8. Činidla a pokyny dodávané s tímto systémem byla vytvořena za účelem optimálního výkonu. Další ředění činidel nebo pozměnění časů inkubace nebo teplot může vést k chybným nebo nesouhlasným výsledkům. Omezení specifická pro tento produkt 1. Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny degradací antigenu v tkáních, ke které může po určité době docházet. Tkáňové řezy by se měly po umístění na sklíčka uchovávat v temnu při teplotě 2 8 C, nebo při pokojové teplotě do 25 C, a barveny do 4 měsíců po nařezání. Teplota při skladování nebo manipulaci by nikdy překročit 25 C, a to v žádném okamžiku po umístění na sklíčka, aby se zajistila integrita a antigenicita tkáně. 2. Abyste dosáhli optimálních a reprodukovatelných výsledků, je třeba vyhledat cíl u proteinu PD-L1 před ošetřením, kdy jsou tkáně běžným postupem fixovány (neutrální pufrovaný formalin) a zality v parafínu. 3. Nezaměňujte činidla jiných čísel šarže tohoto přípravku nebo souprav od jiných výrobců. Jedinou výjimkou je roztok EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x), který je v případě potřeby k dispozici pod kódem K8005. 4. Obarvené linie kontrolních buněk by se měly použít pouze pro validaci barvení série, ale neměly by se používat pro interpretaci barevné reakce v řezech tkání. 5. Použití testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx na tkáních s jinými fixativy než 10% neutrálním pufrovaným formalinem nebylo validováno. 6. Excizionální, incizionální biopsie nebo biopsie pomocí duté nebo vykrajovací jehly byly považovány za akceptovatelné typy vzorků pro klinická hodnocení při provádění testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Vzorky nasáté tenkou jehlou nebo jiné cytologické vzorky byly nedostatečné pro biomarkerové analýzy a byly vyloučeny z klinických hodnocení při provádění testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx. Neklinické hodnocení výkonnosti Analytická specifičnost PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Primární protilátkou v testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx je králičí monoklonální antihumánní protilátka proti PD-L1, klon 28-8. Imunogenem použitým pro generování protilátek je purifikovaný rekombinantní humánní PD-L1 s extracelulární doménou (Phe19-Thr239) lidského PD-L1. IHC barvení protilátkou proti PD-L1 nevykazovalo zkříženou reaktivitu k PD-L2 exogenně vyjádřeného v ovariálních buňkách čínského křečka (CHO). Test PD-L1 IHC 28-8 pharmdx specificky detekuje membránový protein PD-L1 exprimovaný v nádorových buňkách v tkáních FFPE, který lze zcela odstranit přidáním PD-L1 antigenu. Test PD-L1 IHC 28-8 pharmdx nedetekuje membránový protein PD-L1 u nádorových buněk s genovým knock-out, u kterých je gen PD-L1 geneticky vyřazen. (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 7/17

Normální a neoplastické tkáně V tabulce 2 je uveden souhrnný přehled imunoreaktivity králičí monoklonální antihumánní protilátky proti PD-L1 na doporučeném panelu normálních tkání. V tabulce 3 je souhrnný přehled imunoreaktivity králičí monoklonální antihumánní protilátky proti PD-L1 na neoplastických tkáních u microarrays multinádorové tkáně. Všechny tkáně byly fixovány formalinem, zality v parafínu a obarveny PD-L1 IHC 28-8 pharmdx podle pokynů na tomto příbalovém letáku. Test PD-L1 IHC 28-8 pharmdx detekoval protein PD-L1 v plazmatické membráně buněk, o kterých je známo, že exprimují PD-L1 jako imunitní buňky a nádorové buňky převážně epiteliálního původu. Tabulka 2: Souhrn reaktivity normální tkáně v testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Typ tkáně (počet testovaných) Pozitivní barvení plazmatické membrány: Prvky tkáně Pozitivní barvení cytoplazmy: Prvky tkáně Brzlík (3) 3/3 medulární epitel 0/3 Děloha (3) 0/3 0/3 Děložní hrdlo (3) 1/3 epitel 1/3 epitel Hypofýza (3) 1/3 přední adenohypofýza 1/3 přední adenohypofýza 3/3 zadní neurohypofýza Játra (3) 2/3 imunitní buňky 2/3 imunitní buňky Jícen (3) 0/3 0/3 Kostní dřeň (3) 3/3 megakaryocyty 3/3 megakaryocyty Kůže (3) 0/3 1/3 epitel Ledvina (3) 3/3 tubulární epitel 3/3 tubulární epitel Malý mozek (3) 0/3 0/3 Mandle (3) 3/3 epitel krypty 0/3 3/3 zárodečné centrum (buňky imunitního systému) Mezoteliální buňky (3) 0/3 0/3 Mozek (3) 0/3 0/3 Nadledvina (3) 3/3 medulární buňky 3/3 medulární buňky Nerv periferní (3) 0/3 0/3 Pankreas (3) 3/3 epitel (hlavně buňky ostrůvků) 3/3 epitel (hlavně buňky ostrůvků) Plíce (3) 3/3 alveolární makrofágy 0/3 Prostata (2) 0/2 0/2 Prs (3) 0/3 0/3 Příštítná tělíska (3) 3/3 epitel 0/3 Slezina (3) 1/3 makrofágy 0/3 3/3 litorální buňky Slinná žláza (3) 0/3 0/3 Sval srdeční (3) 0/2 0/2 Sval, kosterní (3) 0/2 0/2 Štítná žláza (3) 0/3 0/3 Tenké střevo (2) 0/2 0/2 Tračník (3) 2/3 makrofágy 0/3 Vaječník (3) 0/3 0/3 Varlata (3) 0/3 1/3 Leydigovy buňky Žaludek (3) 0/3 0/3 Tabulka 3: Souhrn reaktivity neoplastické tkáně v testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx Typ tumoru Místo/orgán PD-L1 pozitivní/celkem (N=162) Bronchoalveolární karcinom, plicní 0/1 Děloha, endometrium 1/3 Děloha, z jasných buněk 1/1 Děložní čípek, endocervikální typ 0/1 GI, metastázující do plic 0/1 Hlava a krk, tvrdé patro 0/1 Jícen 1/1 Konečník 2/4 Plíce 2/5 Prostata 2/4 Prs, DCIS 0/2 Adenokarcinom Prs, invazivní duktální 3/7 Prs, invazivní duktální metastázující do lymfatické uzliny 1/1 Příloha 1/1 Slinivka břišní 1/2 Slinivka břišní, duktální 0/3 Slinné/příušní žlázy 0/2 Štítná žláza, folikulární 0/1 Štítná žláza, folikulární-papilární 0/1 Štítná žláza, papilární 0/3 Tenké střevo 0/2 Tlusté střevo, metastázující do jater 1/1 Tlusté střevo, mucinózní 0/1 Tračník 2/5 (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 8/17

Typ tumoru Místo/orgán PD-L1 pozitivní/celkem (N=162) Vaječník 0/1 Vaječník, endometrioid 0/1 Vaječník, mucinózní 0/1 Vaječník, sérový 0/1 Žaludek 1/6 Žaludek, mucinózní 0/1 Žlučník 2/4 Adrenokortikální karcinom Nadledvinka 0/1 Astrocytom Přední mozek 0/3 Embryonální karcinom Varle 0/1 Ependymom Mozek 0/1 Glioblastom Mozek 0/1 Hepatoblastom Játra 0/1 Hepatocelulární karcinom Játra 1/5 Chordom Pánevní dno 0/1 Konečník 0/1 Intersticiální karcinom Tenké střevo 0/1 Tračník 0/1 Karcinom Nosohltan, NPC 0/1 Karcinom bazálních buněk Kůže 0/1 Karcinom ledviny Papilární Ledvina 0/1 Z jasných buněk Ledvina 0/6 Metastázující karcinom tlustého střeva z buněk tvaru Karcinom z buněk tvaru pečetního 0/1 pečetního prstenu do vaječníku prstenu Tračník 0/1 Karcinom z přechodných buněk Ledvina 0/1 Močový měchýř 3/6 Liposarkom Břišní dutina, mucinózní 0/1 Lymfom Anaplastický velkobuněčný Lymfatické uzliny 1/1 Difuzní B-buněk Lymfatické uzliny 2/4 Hodgkin Lymfatické uzliny 2/2 Non-Hodgkin Lymfatické uzliny 1/1 Malobuněčný karcinom Plíce 1/2 Medulární karcinom Štítná žláza 0/1 Meduloblastom Mozek 0/1 Melanom Konečník 0/1 Nosní dutina 0/1 Meningiom Mozek 0/2 Mesotheliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Měkká tkáň, bedra 0/1 Primitivní neuroektodermální tumor Retroperitoneum 0/1 Sarkom Chondrosarkom Kost 0/1 Leiomyosarkom Měkká tkáň, hrudní stěna 0/1 Močový měchýř 0/1 Liposarkom Břišní dutina, mucinózní 0/1 Osteosarkom Kost 0/2 Měkká tkáň, embryonální 0/1 Rhabdomyosarkom Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Synoviální sarkom Pánevní dno 0/1 Z jasných buněk Břišní stěna 0/1 Seminom Varle 0/2 Spermatocytom Varle 0/2 Děloha 1/1 Děložní čípek 2/4 Hlava a krk 0/2 Spinocelulární karcinom Jícen 4/7 Kůže 1/2 Metastatický esofageální spinocelulární karcinom do lymfatických uzlin Plíce 1/3 Thymom Mediastinum 1/1 Tumor z ostrůvkových buněk Slinivka břišní 0/1 Velkobuněčný karcinom Plíce 1/1 (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 9/17 1/1

Analytická citlivost: Neskvamózní NSCLC Analytická citlivost PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byla testována na 112 unikátních případech vzorků FFPE neskvamózního NSCLC ve stádiu I až IV za použití výrobní šarže. Hodnocení exprese PD-L1 prokázalo barvení v rozsahu 0 100 % pozitivních nádorových buněk a intenzitou barvení 0 3. Opakovatelnost: Neskvamózní NSCLC Opakovatelnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byla vyhodnocena společností Dako. Výkonové parametry jsou uvedeny v tabulce 4. Procentuální shoda negativity (NPA), procentuální shoda pozitivity (PPA) a celková procentuální shoda (OA) nezávislého párového srovnání testů se stanovovaly pro každou hodnocenou úroveň exprese PD-L1. Nejčastěji se vyskytující pozorování byla použita jako reference pro výpočet NPA, PPA, OA a odpovídajících 95% Wilsonových intervalů spolehlivosti, to znamená, že vždy jeden z výsledků daného pozorování byl vyloučen z párových srovnání. Tabulka 4: Opakovatelnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx neskvamózní NSCLC Opakovatelnost Metoda Mezi přístroji Mezi analytiky Mezi dny Mezi šaržemi Mezi sériemi Každý z 10 vzorků neskvamózního NSCLC s různou expresí PD-L1 IHC byl testován ve třech opakováních na každém ze tří přístrojů Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 60 nezávislých párových srovnání. Každý z 12 vzorků neskvamózního NSCLC s různou expresí PD-L1 IHC byl testován ve třech opakováních třemi analytiky na jednom přístroji Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 72 nezávislých párových srovnání. Každý z 10 vzorků neskvamózního NSCLC s různou expresí PD-L1 IHC byl testován ve třech opakováních po pět dní, které nenásledovaly za sebou, na jednom přístroji Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 80 nezávislých párových srovnání. Každý z 20 vzorků neskvamózního NSCLC s různou expresí PD-L1 IHC byl testován ve dvou opakováních s každou z pěti šarží činidla na jednom přístroji Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 160 nezávislých párových srovnání. Každý z 10 vzorků neskvamózního NSCLC s různou expresí PD-L1 IHC byl testován v osmi opakováních během jedné série na přístroji Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 70 nezávislých párových srovnání. % shoda (95% IS) Úroveň exprese 1 % Úroveň exprese 5 % Úroveň exprese 10 % NPA 100 (82,4, 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (94,3, 100) PPA 100 (96,2, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (84,5, 100) PPA 100 (92,7, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (86,2, 100) PPA 100 (90,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (88,6, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 100 (89,3, 100) PPA 100 (92,6, 100) OA 100 (95,4, 100) NPA 100 (95,4, 100) PPA 100 (95.4, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (87,9 100) PPA 100 (91,6, 100) OA 100 (94,8, 100) NPA 100 (91,6, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,0, 100) NPA 100 (93,4, 100) PPA 100 (82,4, 100) OA 100 (94,9, 100) NPA 98,2 (90,6, 99,7) PPA 100 (86,2, 100) OA 98,8 (93,3, 99,8) NPA 100 (96,4, 100) PPA 100 (93,6, 100) OA 100 (97,7, 100) NPA 100 (92,7, 100) PPA 100 (84,5, 100) OA 100 (94,8, 100) Externí reprodukovatelnost: Neskvamózní NSCLC Externí reprodukovatelnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byla hodnocena na třech externích testovacích pracovištích. Vyřazování a randomizace barvených řezů se prováděly před expresí barvených řezů. Výkonové parametry jsou uvedeny v tabulce 5. Procentuální shoda negativity (NPA), procentuální shoda pozitivity (PPA) a celková procentuální shoda (OA) nezávislého párového srovnání testů se stanovovaly pro každou hodnocenou úroveň exprese PD-L1. Nejčastěji se vyskytující pozorování byla použita jako reference pro výpočet NPA, PPA, OA a odpovídajících 95% Wilsonových intervalů spolehlivosti, to znamená, že vždy jeden z výsledků daného pozorování byl vyloučen z párových srovnání. (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 10/17

Tabulka 5: Reprodukovatelnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx neskvamózní NSCLC, testováno na třech externích pracovištích Reprodukovatelnost Ověření mezi jednotlivými pracovišti (tři pracoviště) Ověření na pracovišti Mezi pozorovateli (jeden pozorovatel na každém ze tří pracovišť) Podle pozorovatele (jeden pozorovatel na každém ze tří pracovišť) Metoda Každý z 10 vzorků neskvamózního NSCLC s různou IHC expresí PD-L1 byl testován po pět dní, které nenásledovaly za sebou. Ověření mezi pracovišti bylo provedeno mezi třemi pracovišti a spočívalo v párovém srovnání 140 hodnot. Každý z 10 vzorků neskvamózního NSCLC s různou IHC expresí PD-L1 byl testován po pět dní, které nenásledovaly za sebou, na každém ze tří pracovišť. Ověření na pracovišti bylo provedeno na třech pracovištích a spočívalo v párovém srovnání 120 hodnot. Každý z 15 vzorků neskvamózního NSCLC s různou IHC expresí PD-L1, barvený PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, byl zpracován třemi patology, jeden na každém ze tří studijních pracovišť, po tři dny, které nenásledovaly za sebou. Ověření mezi pozorovateli bylo provedeno mezi třemi pracovišti a spočívalo v párovém srovnání 120 hodnot. Každý z 15 vzorků neskvamózního NSCLC s různou IHC expresí PD-L1, barvený PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, byl zpracován třemi patology, jeden na každém ze tří studijních pracovišť, po tři dny, které nenásledovaly za sebou. Ověření podle pozorovatele bylo provedeno na třech pracovištích a spočívalo v párovém srovnání 90 hodnot. % shoda (95% IS) Úroveň exprese 1 % Úroveň exprese 5 % NPA 100 (93,6, 100) PPA 98.8 (93,6, 99,8) OA 99,3 (96,1, 99,9) NPA 100 (92,6, 100) PPA 98,6 (92,5, 99,8) OA 99,2 (95,4, 99,9) NPA 96,9 (89,3, 99,1) PPA 100 (93,6, 100) OA 98,3 (94,1, 99,5) NPA 95,8 (86,0, 98,8) PPA 100 (91,6, 100) OA 97,8 (92,3, 99,4) NPA 91,4 (82,5, 96,0) PPA 97,1 (90,2, 99,2) OA 94,3 (89,1, 97,1) NPA 96,4 (87,9, 99,0) PPA 95,3 (87,1, 98,4) OA 95,8 (90,6, 98,2) NPA 100 (94,3, 100) PPA 89,3 (78,5, 95,0) OA 95,0 (89,5, 97,7) NPA 100 (93,1, 100) PPA 100 (90,8, 100) OA 100 (95,9, 100) Klinické hodnocení výkonnosti: Neskvamózní NSCLC Klinické využití testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx bylo hodnoceno ve studii CA209057 Otevřená, randomizovaná studie fáze III hodnotící nivolumab versus docetaxel u dospělých ( 18 let) pacientů s pokročilým nebo metastázujícím neskvamózním NSCLC po neúspěšné předchozí chemoterapii dvojkombinací na bázi platiny. Bylo randomizováno celkem 582 pacientů na 112 pracovištích ve 22 zemích (Argentina, Austrálie, Rakousko, Brazílie, Kanada, Chile, Česká republika, Francie, Německo, Hong Kong, Maďarsko, Itálie, Mexiko, Norsko, Peru, Polsko, Rumunsko, Ruská federace, Singapur, Španělsko, Švýcarsko a Spojené státy americké). Pacienti byli randomizováni v poměru 1:1 a stratifikováni podle 1) předchozího použití udržovací terapie vs. nepoužití udržovací terapie a 2) druhé linie versus třetí linie léčby. Předstudijní (výchozí) vzorky nádorové tkáně byly odebrány před randomizací a před první léčbou, aby se provedly předem plánované analýzy účinnosti podle předem definovaných úrovní exprese PD-L1 (sekundární cíl). Primárním cílem bylo celkové přežití (OS). Dalšími sekundárními cílovými parametry byly míra objektivní odpovědi (ORR), přežití bez progrese (PFS) a zlepšení symptomů souvisejících s onemocněním za 12 týdnů na základě skóre škály příznaků rakoviny plic (Lung Cancer Symptom Scale, LCSS). Demografické údaje a charakteristiky onemocnění byly mezi randomizovanými pacienty ve skupinách s nivolumabem a docetaxelem obecně vyvážené. Průměrný věk byl 62 let (rozmezí: 21 až 85), 34 % 65 let a 7 % 75 let. Většina pacientů patřila k bílé rase (92 %) a byli to muži (55 %); základní výkonnostní stav byl ECOG 0 (31 %), nebo 1 (69 %). Sedmdesát devět procent pacientů byli bývalí/aktivní kuřáci. Vzorky nádorů byly shromážděny z neskvamózního NSCLC v souladu s požadavky na zařazení do studie. Frekvence exprese PD-L1 v každé z předem definované výchozí úrovně exprese u všech randomizovaných pacientů ve studii CA209057 jsou uvedeny v tabulce 6. Tabulka 6: Frekvence předstudijní exprese PD-L1 u všech randomizovaných subjektů s neskvamózním NSCLC CA209057 Výchozí kategorie exprese PD-L1 populace Nivolumab 3 mg/kg Docetaxel Celkem Celkově 292 290 582 Kvantifikovatelný PD-L1, N (%) 231 (79,1) 224 (77,2) 455 (78,2) Exprese PD-L1 1 % 123/231 (53,2) 123/224 (54,9) 246/455 (54,1) Exprese PD-L1 < 1 % 108/231 (46,8) 101/224 (45,1) 209/455 (45,9) Exprese PD-L1 5 % 95/231 (41,1) 86/224 (38,4) 181/455 (39,8) Exprese PD-L1 < 5 % 136/231 (58,9) 138/224 (61,6) 274/455 (60,2) Výchozí exprese PD-L1 10 % 86/231 (37,2) 79/224 (35,3) 165/455 (36,3) Exprese PD-L1 < 10 % 145/231 (62,8) 145/224 (64,7) 290/455 (63,7) Nekvantifikovatelný PD-L1, N (%) 61 (20,9) 66 (22,8) 127 (21,8) Pacienti s expresí PD-L1 podle všech předem definovaných úrovní exprese ve skupině OPDIVO vykázali zvýšenou míru přežití ve srovnání s docetaxelem, zatímco u pacientů bez exprese PD-L1 byla míra přežití podobná jako u docetaxelu. Významné rozdíly v mediánu OS byly pozorovány u podskupin s nivolumabem vs docetaxelem při analýze podle úrovně exprese PD-L1. Medián OS byl 17,1, 18,2 a 19,4 měsíců u pacientů léčených nivolumabem ve srovnání s 9,0, 8,1 a 8,0 měsíci u pacientů léčených docetaxelem s 1%, 5%, a 10% úrovní exprese PD-L1, v uvedeném pořadí. Nebyly zjištěny žádné rozdíly v OS mezi léčenými skupinami u pacientů s < 1%, < 5% a < 10% úrovní exprese a rozpětím mediánu OS 9,7 až 10,4 měsíce pro nivolumab a 10,1 až 10,3 měsíce pro docetaxel. Nestratifikované poměry rizik (HR) a medián celkového přežití (OS) jsou uvedeny na obrázku 1. Kaplan-Meierův graf pro podskupiny podle úrovně exprese PD-L1 je znázorněn na obrázku 2 a 3. (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 11/17

Obrázek 1: Forest Plot OS na základě exprese PD-L1 u pacientů s neskvamózním NSCLC CA209057 Medián OS (měsíců) Úroveň exprese PD-L1 Nestratifikovaný OPDIVO Doceraxel HR 1 % (n = 246) 0,59 17,1 9,0 <1 % (n = 209) 5% (n = 181) <5% (n = 274) 10% (n = 165) <10% (n = 290) Poznámka: Nestratifikovaný poměr rizik a odpovídající 95% IS byly vyhodnoceny Coxovým modelem proporčních rizik za použití randomizovaného ramene jako jediné kovariáty. Obrázek 2: Celkové přežití pacienti s neskvamózním NSCLC s 1% expresí PD-L1 CA209057 1,0 0,9 0,8 0,25 0,5 1,0 2,0 Upřednostňuje OPDIVO 0,90 10,4 10,1 0,43 18,2 8,1 1,01 9,7 10,1 0,40 19,4 8,0 1,00 9,9 10,3 Pravděpodobnost přežití 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Docetaxel 0,0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Celkové přežití (měsíců) Počet rizik OPDIVO 123 98 86 77 73 65 27 13 5 0 Docetaxel 123 102 80 61 44 36 13 4 3 0 (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 12/17

Obrázek 3: Celkové přežití pacienti s neskvamózním NSCLC s <1% expresí PD-L1 CA209057 1,0 0,9 0,8 Pravděpodobnost přežití 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 OPDIVO Docetaxel 0,0 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 Celkové přežití (měsíců) Počet rizik OPDIVO 108 82 70 60 48 39 26 17 4 0 Docetaxel 101 87 69 53 38 30 13 5 2 0 (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 13/17

Analytická citlivost: Melanom Analytická citlivost PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byla testována na 104 unikátních případech vzorků FFPE melanomu ve stádiu I až IV. Hodnocení exprese PD-L1 prokázalo barvení v rozsahu 0 100 % pozitivních nádorových buněk a intenzitou barvení 0 3. Opakovatelnost: Melanom Opakovatelnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byla vyhodnocena společností Dako. Vyřazování a randomizace barvených řezů se prováděly před expresí barvených řezů. Výkonové parametry jsou uvedeny v tabulce 7 a tabulce 8. Průměrná procentuální shoda negativity (ANA), průměrná procentuální shoda pozitivity (APA) a celková procentuální shoda (OA) neredundantního párového srovnání testů se stanovovaly pro každou hodnocenou úroveň exprese PD-L1. Tabulka 7: Opakovatelnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx melanom Opakovatelnost Mezi přístroji Mezi analytiky Mezi dny Mezi šaržemi Mezi sériemi Metoda Každý ze 16 vzorků melanomu s různou expresí PD-L1 IHC byl testován ve třech opakováních na každém ze tří přístrojů Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 160 párových srovnání. Každý ze 16 vzorků melanomu s různou expresí PD-L1 IHC byl testován ve třech opakováních třemi analytiky na jednom přístroji Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 240 párových srovnání. Každý ze 16 vzorků melanomu s různou expresí PD-L1 IHC byl testován ve třech opakováních po pět dní, které nenásledovaly za sebou, na jednom přístroji Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 160 párových srovnání. Každý ze 16 vzorků melanomu s různou expresí PD-L1 IHC byl testován ve dvou opakováních s každou ze tří šarží činidla na jednom přístroji Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 640 párových srovnání. Každý ze 16 vzorků melanomu s různou expresí PD-L1 IHC byl testován v osmi opakováních během jedné série na přístroji Autostainer Link 48. Bylo provedeno celkem 160 párových srovnání. % shoda (95% IS) Úroveň exprese 1 % Úroveň exprese 5 % ANA 89,5 (83,2, 93,6) APA 90,5 (84,8, 94,2) OA 90,0 (86,0, 92,9) ANA 96,4 (92,9, 98,2) APA 96,8 (93,8, 98,4) OA 96,6 (94,5, 97,9) ANA 95,5 (90,3, 97,9) APA 96,8 (93,1, 98,6) OA 96,3 (93,5, 97,9) ANA 98,6 (97,3, 99,3) APA 98,8 (97,8, 99,4) OA 98,7 (98,0, 99,2) ANA 97,1 (92,6, 98,9) APA 97,7 (94,1, 99,1) OA 97,4 (94,9, 98,7) ANA 90,8 (85,7, 94,2) APA 85,5 (77,6, 90,9) OA 88,8 (84,6, 91,9) ANA 91,3 (87,1, 94,2) APA 88,8 (83,4, 92,6) OA 90,2 (87,0, 92,7) ANA 90,0 (84,0, 93,9) APA 90,0 (84,0, 93,9) OA 90,0 (86,0, 92,9) ANA 92,6 (90,6, 94,2) APA 86,6 (83,1, 89,5) OA 90,5 (88,7, 91,9) ANA 93,6 (89,0, 96,4) APA 89,8 (82,7, 94,2) OA 92,2 (88,4, 94,8) Externí reprodukovatelnost: Melanom Externí reprodukovatelnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx byla hodnocena na třech externích testovacích pracovištích. Vyřazování a randomizace barvených řezů se prováděly před expresí barvených řezů. Výkonové parametry jsou uvedeny v tabulce 8. Průměrná procentuální shoda negativity (ANA), průměrná procentuální shoda pozitivity (APA) a celková procentuální shoda (OA) neredundantního párového srovnání testů se stanovovaly pro každou hodnocenou úroveň exprese PD-L1. Tabulka 8: Reprodukovatelnost testu PD-L1 IHC 28-8 pharmdx melanom, testováno na třech externích pracovištích % shoda (95% IS) Reprodukovatelnost Metoda Úroveň exprese 1 % Úroveň exprese 5 % Ověření mezi Každý z 18 vzorků melanomu s různou IHC expresí PD-L1 ANA 99,3 (98,8, 99,7) ANA 93,8 (92,5, 95,1) jednotlivými byl testován po pět dní, které nenásledovaly za sebou. APA 99,3 (98,8, 99,7) APA 92,7 (91,2, 94,2) pracovišti (tři Analýza mezi pracovišti byla provedena mezi třemi OA 99,3 (98,7, 99,7) OA 93,3 (91,9, 94,7) pracoviště) pracovišti a spočívala v párovém srovnání 1350 hodnot. Ověření na pracovišti Mezi pozorovateli (jeden pozorovatel na každém ze tří pracovišť) Podle pozorovatele (jeden pozorovatel na každém ze tří pracovišť) Každý z 18 vzorků melanomu s různou IHC expresí PD-L1 byl testován po pět dní, které nenásledovaly za sebou, na každém ze tří pracovišť. Analýza na pracovišti byla provedena u tří pracovišť a spočívala v párovém srovnání 540 hodnot. Každý z 30 vzorků melanomu s různou IHC expresí PD-L1, barvený PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, byl zpracován třemi patology, jeden na každém ze tří studijních pracovišť, po tři dny, které nenásledovaly za sebou. Analýza mezi pozorovateli byla provedena mezi třemi pracovišti a spočívala v párovém srovnání 810 hodnot. Každý z 30 vzorků melanomu s různou IHC expresí PD-L1, barvený PD-L1 IHC 28-8 pharmdx, byl zpracován třemi patology, jeden na každém ze tří studijních pracovišť, po tři dny, které nenásledovaly za sebou. Analýza podle pozorovatele byla provedena u tří pracovišť a spočívala v párovém srovnání 270 hodnot. ANA 99,3 (98,4, 99,8) APA 99,3 (98,5, 99,8) OA 99,3 (98,5, 99,8) ANA 90,4 (88,1, 92,5) APA 91,7 (89,7, 93,6) OA 91,1 (89,1, 93,1) ANA 99,2 (97,9, 100) APA 99,3 (98,2, 100) OA 99,3 (98,1, 100) ANA 97,3 (95,8, 98,5) APA 96,8 (95,1, 98,2) OA 97,0 (95,6, 98,3) ANA 93,2 (91,3, 94,8) APA 91,9 (89,8, 93,9) OA 92,6 (90,7, 94,3) ANA 97,9 (96,1, 99,4) APA 97,6 (95,4, 99,2) OA 97,8 (95,9, 99,3) (129092-002) P03914CZ_02/SK00521-2/2016.04 p. 14/17