LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A POSTUPY

Chem. Listy, 495 53 (7) LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A POSTUPY STANOVENÍ CHEMICKÝCH FOREM RTUTI KAPALINOVOU CHROMATOGRAFIÍ S DETEKCÍ ATOMOVOU FLUORESCENČNÍ SPEKTROMETRIÍ TECHNIKOU GENERACE STUDENÝCH PAR PAVLÍNA HOUSEROVÁ, DAVID MATĚJÍČEK, VLASTIMIL KUBÁŇ, JANA PAVLÍČKOVÁ JOSEF KOMÁREK Ústv chemie iochemie, Mendelov zemědělská lesnická univerzit v Brně, Zemědělská, 63 Brno, Ktedr nlytické chemie, Msrykov Univerzit v Brně, Kotlářská, 6 37 Brno kun@mendelu.cz Došlo.8.5, přeprcováno.3.6, přijto.8.6. Klíčová slov: rtuť, methylrtuť, chemické formy rtuti, extrkce, seprce, stnovení, kplinová chromtogrfie, tomová fluorescenční spektrometrie Úvod Speciční nlýz je definován jko stnovení jednotlivých fyzikálně chemických forem prvku, přičemž součet jejich koncentrcí tvoří celkovou koncentrci prvku ve vzorku. Pro rozlišení jednotlivých forem prvku se využívjí rozdíly v chemických i fyzikálních vlstnostech těchto forem. Dříve se ke stnovení chemických forem rtuti používlo selektivní jednostupňové extrkce, selektivní redukce chemických forem rtuti roztokem NBH 4 o různé koncentrci, neo dvoustupňové redukce roztoky SnCl NBH 4 (cit. ) ve spojení s tomovou sorpční (CV-AAS) neo tomovou fluorescenční spektrometrií (CV-AFS). V součsné doě se prvková speciční nlýz provádí převážně kominovnými (tndemovými) technikmi, které spojují seprční metody (plynovou chromtogrfii GC, vysoce účinnou kplinovou chromtogrfii HPLC kpilární zónovou elektroforézu CZE) se selektivní detekcí prvků, v některých přípdech i isotopů. Tyto techniky tk umožňují selektivně většinou i velmi citlivě stnovit všechny přítomné fyzikálně chemické formy prvku (specie) 3. Nejčstěji se k rozdělení chemických forem rtuti používá plynové neo kplinové chromtogrfie, přičemž proztím nedoceněny zůstávjí možnosti seprce elektromigrčními technikmi (kpilární zónovou elektroforézou CZE). Podroný přehled vlstností, výskytu iotrnsformcí jednotlivých forem rtuti ve vodném ekosystému, jkož i přehled metod jejich stnovení je uveden v přehledné práci 4. V této práci yly optimlizovány vlidovány metody stnovení methylrtuti (methylhydrrgyrium-chloridu MeHgCl), ethylrtuti (ethylhydrrgyrium-chloridu EtHgCl) fenylrtuti (fenylhydrrgyrium-chloridu PhHgCl) vedle norgnických forem rtuti (Hg + ) kplinovou chromtogrfií s detekcí tomovou fluorescenční spektrometrií technikou generce studených pr (HPLC/ CV-AFS). Výsledky yly porovnány s výsledky stnovení methylhydrrgyrium-chloridu norgnických forem rtuti (Hg + ) plynovou chromtogrfií s detektorem se záchytem elektronů (GC/ECD) i s oshy celkové rtuti (T-Hg) MeHgCl v certifikovných referenčních mteriálech (CRM) i ve vzorcích ry. Experimentální část P ř ístroje Pro stnovení chemických forem rtuti yl použit kplinový chromtogrf LC- (tzv. ioverze, Perkin Elmer, Norwlk, USA) vyvený vysokotlkou pumpou Series LC, utosmplerem Series tomovým fluorescenčním detektorem PSA Millenium Merlin (PS Anlyticl Ltd., Orpington, UK). Chromtogrfický systém yl kontrolován chromtogrfickým softwrem TuroChrom přes 6 Series 9 Series propojení (PE Nelson, Norwlk, USA). Isokrtická eluce chemických forem rtuti yl prováděn n chromtogrfické koloně s reverzní fází Hypersil BDS C8 ( 5 mm, velikost částic 3 µm, Hewlett Pckrd, Plo Alto, USA) při průtokové rychlosti moilní fáze,5 ml min. Moilní fáze oshovl cetátový pufr (ph 5),,5 % -sulfnylethnol 7 % methnol s jeho skokovou změnou n % MeOH v 5. minutě seprce. Před zčátkem n konci měření yl chromtogrfický systém promyt methnolem po dou min. Automtickým dávkovčem ylo do toku moilní fáze dávkováno µl vzorku. Automtický dávkovč yl před kždým dlším dávkováním vzorku utomticky promyt směsí H O methnolu (: v/v). Eluent z chromtogrfické kolony přecházel po smísení s oxidčním činidlem (, mol l KBr +,4 mol l KBrO 3 v 5% HCl) přes UV rektor (teflonová kpilární truičk,5 mm m, výkon UV lmpy W, vlnová délk 53,6 nm), který zjišťovl převedení všech chemických forem rtuti fotooxidcí n Hg +. Přeytečný Br yl následně odstrňován vodným roztokem hydroxylmin- 495

Chem. Listy, 495 53 (7) HPLC pump injektor kolon oxidční činidlo UV rektor rgon sušící truice počítč redukční činidlo Hg pár AFS detektor plyn-kplin seprátor (vše Altec s.r.o., Prh). Homogenizovné tuhé vzorky ( mg, ±, mg) yly nvžovány do předčištěných vypálených niklových lodiček, vysušeny při C (9 s) spáleny při 55 C (8 s) v proudu kyslíku ( ml min ). Páry rtuti yly po fokusci v mlgmátoru uvolněny tepelným pulzem trnsportovány do měřících cel přístroje AMA 54 (poměr 5:). Asorpce Hg yl měřen při 53,6 nm (do měření 6 s). Použité chemikálie Or.. Schémtické uspořádání HPLC/CV-AFS systému pro stnovení chemických forem rtuti hydrochloridu (,4%). Rtuťnté ionty yly dále redukovány % roztokem SnCl v % HCl n elementární rtuť. Z roztoku yl elementární rtuť uvolněn proudem rgonu (,5 l min ) oddělen v seprátoru fází g/l. Směs yl vysušen v memránové jednotce PermPure detegován CV-AFS v křemenné cele při vlnové délce 53,6 nm. Výsledná dt yl zprcován chromtogrfickým softwrem Clrity (verze., Dt Apex, Prh, ČR). Schémtické uspořádání HPLC/CV-AFS systému pro stnovení chemických forem rtuti je znázorněno n or.. Pro stnovení celkového oshu rtuti (T-Hg) yl použit jednoúčelový tomový sorpční spektrofotometr AMA 54 s utomtickým dávkovčem tuhých vzorků ASS 54. Celé zřízení ylo řízeno WinAMA softwrem Ethylrtuť (ethylhydrrgyrium-chlorid EtHgCl, C H 5 HgCl, Supelco, Německo), methylrtuť (methylhydrrgyrium-chlorid MeHgCl, CH 3 HgCl) fenylrtuť (fenylhydrrgyrium-chlorid PhHgCl C 6 H 5 HgCl) -sulfnylethnol (vše Sigm-Aldrich Chem. Comp., USA), octová kyselin, octn monný, SnCl, KBr, KBrO 3, NCl, K Cr O 7, HCl, HNO 3, L-cystein, tetrutylmonium-chlorid, tetrethylmonium-romid, thiomočovin, kyselin sulfoslicylová (vše Pliv-Lchem, Brno, ČR) yly čistoty p.. Methnol (čistoty pro HPLC) yl od firmy Merck (Drmstdt, Německo). Pro vlidci yly použity stndrdní referenční mteriál DORM- (dogfish, Institut pro mezinárodní stndrdy, Knd) s deklrovnými oshy celkové rtuti (T-Hg) 4,64±,6 mg kg, MeHgCl (jko Hg) = 4,47±,3 mg kg stndrdní referenční mteriál CRM 58 (sediment, dodvtel -Thet ASE, Český Těšín, ČR) s deklrovnými oshy celkové rtuti (T-Hg) 3±3 mg kg MeHgCl Tulk I Optimlizovné experimentální podmínky HPLC, CV-AFS, CV-AAS mikrovlnné extrkce HPLC Kolon Moilní fáze Průtoková rychlost Injektovný ojem µl Hypersil BDS C8, 5 mm, 3 µm (Hewlett Pckrd, Plo Alto, USA) 7% (v/v) CH 3 OH,,5% (v/v) -sulfnylethnol v cetátovém pufru ph 5, % MeOH od 5. minuty seprce 496,5 ml min Atomová fluorescenční spektrometrie s genercí studených pr (CV-AFS) Oxidční činidlo, mol l KBr +,4 mol l KBrO 3 v 5% HCl +,4% hydroxylmin-hydrochlorid, průtoková rychlost,5 ml min Redukční činidlo Mikrovlnná extrkce Do extrkce % SnCl v % HCl, průtoková rychlost,5 ml min min Teplot 55 C Výkon 4 W Extrkční činidlo ml roztoku 6 mol l HCl +, mol l NCl Atomová sorpční spektrometrie s genercí studených pr (AMA 54) Sušení 9 s při C Rozkld 8 s při 55 C Vlnová délk 53,6 nm

Chem. Listy, 495 53 (7) (jko CH 3 Hg + ) = 75,5±3,7 µg kg. Pro klirci yl použit zákldní stndrd o koncentrci,±, g l Hg v % HNO 3 (Český metrologický institut, Prh, ČR). Klirční roztoky pro stnovení celkové rtuti (T-Hg) yly připrveny v,% K Cr O 7,6% HNO 3. Stndrdní roztok Hg + (c = mg l ) pro speciční nlýzu yl připrven v % HCl. Stndrdní roztoky MeHgCl, PhHgCl EtHgCl (c = mg l ) yly připrveny v methnolu. Všechny prcovní roztoky yly připrveny ředěním zásoních roztoků deionizovnou vodou (Milli-Q RG, Millipore, Bedford, USA). Prcovní postupy Zprcování vzorků Oderné vzorky ry z loklity Sklk u Cheu 4 yly zmrženy n 8 C následně lyofilizovány při teplotě 5 C po dou 48 h v lyofilizátoru Christ Alf (B. Brun Biotech Interntionl, Švýcrsko). Homogenizce vzorků proíhl po dou 3 s při otáčkách/min v mlýnku Grindomix GM (Retch GmH & Co. KG, Německo). Extrkce Pro extrkci chemických forem rtuti z iologických mteriálů yl používán ultrzvuková lázeň K5 (Krintex, SR) neo desetimístný vysokotlký mikrovlnný extrktor Ethos SEL (Milestone, Itálie). Kždá extrkční sd oshovl referenční mteriál, slepý pokus 8 vzorků. Nvážk vzorku ( mg, ±, mg) yl zvolen podle celkového oshu rtuti ve vzorku souěžně stnoveného n přístroji AMA 54. Byl optimlizován do extrkce, teplot ojem extrkčního činidl. Teplot yl kontrolován termočlánkem umístěném v první rekční nádoě. Po extrkci yly vzorky zfiltrovány přes filtrční ppír (No. 389, průměr,5 cm). Superntnt yl ředěn cetátovým pufrem n ojem 5 neo 5 ml podle oshu rtuti ve vzorku. Optimlizovné experimentální podmínky jsou shrnuty v tulce I. Zprcování výsledků Klirční grfy nměřené chromtogrmy yly vyhodnoceny pomocí chromtogrfického softwru Clrity (verze., Dt Apex, Prh, ČR). Rozlišení seprovných chemických forem rtuti (R S ) kpcitní fktory (k) yly vypočítány n zákldě vzthů R S = (t R t R )/(w w ) k = (t R t )/t, kde t je mrtvý retenční čs v min, t R je retenční čs v min w je šířk píku při zákldně v minutách pro oě komponenty. Dále yl dt zprcován pomocí progrmu Microsoft Excel. Správnost výsledků, tj. sttistická význmnost rozdílu průměru od skutečné hodnoty, yl testován z použití směrodtné odchylky průměru Studentovým testem t (cit. 5 ). Shodnost výsledků získných dvěm různými nlytickými metodmi, tj. sttistická význmnost rozdílu středních hodnot (µ x µ y ), yl rovněž testován Studentovým testem t. Test shody středních hodnot yl prováděn s testovcím kritériem T i T. Byl testován hypotéz H (µ x = µ y ) proti lterntivní hypotéze H A (µ x µ y ). Při pltnosti hypotézy H má tto sttistik Studentovo rozdělení s v = n + n stupni volnosti. Pltí-li, že hodnot testovcího kritéri T () > t α/ (v), je hypotéz H o shodě středních hodnot n hldině význmnosti µ zmítnut. Testovcí kritérium T není roustní vůči heteroskedsticitě, tj. přípdu, kdy dt jsou ve výěrech měřen s různou přesností. V této situci je správnější využít testovcího kritéri T, které je vůči heteroskedsticitě roustnější. V přípdě stejných rozshů oou výěrů n = n 8, lze použít testovcí kritérium T, i když hodnoty rozptylů nejsou shodné 5. T = T = [ x y] ( n ) s + ( n ) Mez detekce (LOD) je definován jko nejmenší koncentrce neo množství nlytu ve vzorku, které vyvoljí signál rovný trojnásoku směrodtné odchylky signálu pozdí (slepého pokusu, tzv. 3.S/N kriterium). Výsledky diskuse x [ x y] x + s n y s n ( n + n ) Izolce chemických forem rtuti z iologických mteriálů s y nn n + n Optimlizce extrkčního postupu se skládl z voly vhodného extrkčního činidl podmínek extrkce (teplot, do extrkce, množství extrkčního činidl). Nejvhodnější extrkční činidlo ylo vyráno n zákldě extrkčních výtěžků, reprodukovtelnosti extrkce minimální vzájemné trnsformce jednotlivých chemických forem rtuti. Extrkční výtěžky yly vypočítány jko procentuální rozdíl mezi celkovým oshem rtuti v tuhém vzorku ve vzorku po extrkci. Měření ylo prováděno n přístroji AMA 54. Ultrzvuková i mikrovlnná extrkce chemických forem rtuti yl prováděn v přítomnosti řdy extrkčních činidel (kyselin thiooctová TAA, octová, citronová, chlorovodíková, L-cystein, -sulfnylethnol, HCl + NCl td.). Extrkční účinnosti jednotlivých extrkčních činidel yly testovány stndrdním referenčním mteriálem DORM. Vliv jednotlivých extrkčních činidel n extrkční výtěžky je znázorněn v or.. Nejvyšší extrkční výtěžky yly získány při použití směsných extrkčních činidel n ázi kyseliny chlorovodíkové 6 mol l HCl + mol l NCl neo 5,8% HCl + 5% thiooctová kyselin. Přítomnost kyseliny chlorovodíkové v extrkčním činidle výrzně zlepšuje extrkční výtěžky chemických forem rtuti. Zředěná kyselin chlorovodíková přítomná v extrkčním činidle umožňuje rychlé dokonlé rozití vze chemických forem rtuti s proteiny () 497

Chem. Listy, 495 53 (7) 8 R,% 6 4 -,5% cystein +,5% -sulfnylethnol ultrzvuk - 5% kyselin citronová ultrzvuk 3-5% kyselin octová ultrzvuk 4-5% kyselin thiooctová ultrzvuk 5-5% HCl ultrzvuk 6-5% HCl mikrovlny 7-5% HCl +,5 % cystein ultrzvuk 8-5% HCl +,5 % cystein mikrovlny 9-5% kyselin thiooctová + 5,8% HCl ultrzvuk - 5% kyselin thiooctová + 5,8% HCl mikrovlny - 6M HCl + M NCl ultrzvuk - 6M HCl + M NCl mikrovlny 3 4 5 6 7 8 9 3 4 5 6 7 8 9 Extrk ce extrkce Vzhledem ke konstrukci vysokotlkého mikrovlnného extrktoru Ethos SEL neylo možné extrkci provádět s méně než ml extrkčního činidl. Větší ojem extrkčního činidl neovlivňovl extrkční výtěžky rtuti, proto ylo používáno toto minimální množství i v dlších experimentech. Reltivní směrodtná odchylk (RSD) mikrovlnné extrkce yl 3,3 %, RSD extrkce v ultrzvuku yl 7,5 %. Extrkční výtěžky mikrovlnné extrkce yly nejméně o % vyšší než výtěžky extrkce prováděné v ultrzvukové lázni. Mezi hlvní výhody mikrovlnné extrkce extrkčním činidlem n ázi kyseliny chlorovodíkové (6 mol l HCl +, mol l NCl) ptří krátký extrkční čs, možnost simultánní extrkce ž vzorků, extrkce ez použití orgnického rozpouštědl, stilit extrktu v tmvě hnědých skleněných lhvích v ledničce nejméně 3 dnů především vyšší přesnost správnost stnovení v porovnání s extrkcí v ultrzvukové lázni. Or.. Vliv jednotlivých extrkčních činidel n extrkční výtěžky R;,5% cystein +,5% -sulfnylethnol ultrzvuk, 5% kyselin citronová ultrzvuk, 3 5% kyselin octová ultrzvuk, 4 5% kyselin thiooctová ultrzvuk, 5 5% HCl ultrzvuk, 6 5% HCl mikrovlny, 7 5% HCl +,5% cystein ultrzvuk, 8 5% HCl +,5% cystein mikrovlny, 9 5% kyselin thiooctová + 5,8% HCl ultrzvuk, 5% kyselin thiooctová + 5,8% HCl mikrovlny, 6M HCl + M NCl ultrzvuk, 6M HCl + M NCl mikrovlny zároveň při nízkých extrkčních teplotách nezpůsouje žádné trnsformce chemických forem rtuti. Kyselin thiooctová negtivně ovlivňuje nlytický signál tomově fluorescenčního (AFS) detektoru zdvojením píku 6. Jko nejvhodnější extrkční činidlo yl zvolen směs 6 mol l HCl, mol l NCl. Směs oshující 6 mol l HCl mol l NCl sice poskytovl si o % vyšší extrkční výtěžky, le pro dávkování do chromtogrfického systému yl preferován menší osh chloridů. Stilit chemických forem rtuti v tomto extrkčním činidle yl ověřen nlýzou referenčních mteriálů DORM- CRM 58. Při ultrzvukové i mikrovlnné extrkci referenčních mteriálů nedocházelo k žádným trnsformcím chemických forem rtuti. Při ultrzvukové i mikrovlnné extrkci yl optimlizován extrkční čs, teplot množství extrkčního činidl. N zákldě výsledků (or. 3) yl stnoven optimální extrkční čs pro mikrovlnnou extrkci iologického mteriálu n min pro extrkci v ultrzvukové lázni n 45 min. Při extrkci sedimentů yl optimální extrkční čs zkrácen při mikrovlnné extrkci n 7 min při extrkci v ultrzvukové lázni n 3 min. Zkrácení extrkčního čsu u sedimentů je způsoeno slšími vzmi chemických forem rtuti v sedimentech. Extrkční teplot v rozmezí 4 ž C neměl význmný vliv n extrkční výtěžky chemických forem rtuti (or. 3). Stejný efekt yl zznmenán i Vázquezem 7. 8 6 4 extrkce v ultrzvuku-iologický mteriál mikrovlnná extrkce-iologický mteriál extrkce v ultrzvuku-sediment mikrovlnná extrkce-sediment 3 4 5 6 7 3 4 5 6 7 t, min 8 6 4 t, min extrkce v ultrzvuku mikrovlnná extrkce 4 6 8 4 6 8 T, C T, C Or. 3. Vliv doy extrkce () (T = 6 C),! extrkce v ultrzvuku iologický mteriál, " mikrovlnná extrkce iologický mteriál,! extrkce v ultrzvuku sediment, mikrovlnná extrkce; extrkční teploty () (t mikrovln = min, t ultrzv = 45 min) n extrkční výtěžek R rtuti při mikrovlnné extrkci i extrkci v ultrzvukové lázni,! extrkce v ultrzvuku, " mikrovlnná extrkce (6 mol l HCl +, mol l NCl ( ml), DORM-, CRM 58) 498

Chem. Listy, 495 53 (7) Stilit vzorků extrktů Oderné vzorky ry yly ihned po oděru zmrženy ( 8 C). Vzorky yly uchovávány ztvené v polyethylenové folii hermeticky uzvřené v plstikové přeprvce. Během sledovné doy (6 měsíců) nedocházelo u testovných iologických mteriálů (svlovin, játr, žáry, ledviny, kůže, střev) ke ztrátě rtuti ni k trnsformci jejich jednotlivých chemických forem. Trnsformce chemických forem rtuti (methylce Hg + ) yl pozorován ve vzorcích sedimentů. Dlouhodoým skldováním vzorků sedimentů docházelo k mírnému vzrůstu oshu MeHgCl, přičemž celkový osh rtuti zůstávl ve vzorku zchován. Stilit odeírných sedimentů yl prodlužován lyofilizcí vzorku následným uchováváním při 8 C (or. 4). Stilit referenčního mteriálu je zjišťován ozářením sedimentu γ-zářením. Stilit extrktů yl sledován v rozmezí měsíců. Přefiltrovný extrkt (6 mol l HCl +, mol l NCl) referenčního mteriálu DORM- i CRM 58 zředěný n koncentrci 46,4 µg l Hg yl uchováván ve skleněných c, % 9 8 7 c, % 8 T-Hg ez lyofilizce T-Hg s lyofilizcí MeHgCl ez lyofilizce MeHgCl s lyofilizcí 6 3 4 5 6 7 9 7 3 4 5 6 7 t, dny DORM- (T-Hg) DORM- (MeHgCl) CRM 58 (T-Hg) CRM 58 (MeHgCl) 6 3 4 5 6 7 t, dny t, dny 3 4 5 6 7 t, dny Or. 4. Stilit sedimentů () (celkový osh (T-Hg) = 89 µg kg -, MeHgCl = µg kg - );! T-Hg ez lyofilizce, " T-Hg s lyofilizcí,! MeHgCl ez lyofilizce, MeHgCl s lyofilizcí; extrktů (),! DORM- (T-Hg), " DORM- (MeHgCl),! CRM 58 (T-Hg), CRM 58 (MeHgCl) vilkách z hnědého skl v ledničce. Extrkty referenčních mteriálů DORM- i CRM 58 yly stilní po dou 3 dnů. Během této doy neyly pozorovány žádné kvntittivní ni trnsformční změny stnovovných chemických forem rtuti. Stilit chemických forem rtuti yl prodlužován extrkčním činidlem (HCl + NCl), které zjišťovlo vznik komplexů HgCl 4 RHgCl. Dosttečná kyselost extrktu jeho vhodné skldování snižovly riziko dsorpce neo degrdce chemických forem rtuti n minimum. Po 3 dnech se postupně snižovl koncentrce jk celkové rtuti, tk i MeHgCl (or. 4). Byl tké sledován stilit difenylrtuti (Ph Hg). Ph Hg se v kyselém prostředí ihned rozkládl n PhHgCl. Pro stnovení R Hg y ylo zpotřeí provádět lklickou hydrolýzu vzorku. Vzhledem k tomu, že sloučeniny R Hg se ve studovných mtricích i většině iologických mteriálů nevyskytují, neyl tto vrint dále ověřován. Seprce chemických forem rtuti HPLC Chromtogrfická seprce chemických forem rtuti (MeHgCl, Hg +, EtHgCl, PhHgCl) yl prováděn n chromtogrfické koloně Hypersil BDS C8 s reverzní fází. Při optimlizci seprčních podmínek ylo sledováno složení moilní fáze (vliv různých modifikátorů, ph), průtoková rychlost moilní fáze teplot seprce. Detekce seprovných chemických forem rtuti yl prováděn tomovou fluorescenční spektrometrií metodou generování studených pr rtuti (CV-AFS). Optimlizce experimentálních podmínek detekční metody je uveden v dřívější práci 6. Jko moilní fáze yl použit směs methnolu modifikátorů (L-cystein, -sulfnylethnol, thiomočovin, kyselin sulfoslicylová, diethyldithiokrmát sodný DDTC) v cetátovém pufru (ph 5). Modifikátory vytvářejí stilní komplexy se sloučeninmi rtuti pomáhjí tk překont význmné rozdíly v chemických i fyzikálních vlstnostech jednotlivých chemických forem rtuti tím umožňují stnovit dimetrálně odlišné sloučeniny v jednom seprčním stupni. Vliv jednotlivých modifikátorů n chromtogrfickou seprci Hg + MeHgCl je znázorněn v tulce II. Dále yl tké testován seprce chemických forem rtuti v přítomnosti tetrutylmoniumchloridu neo tetrethylmonium-romidu v kominci s NCl. V přítomnosti L-cysteinu thiomočoviny se nezdržovl v dném chromtogrfickém systému Hg + ni MeHgCl. Velmi silná retence chemických forem rtuti yl zznmenán, pokud moilní fáze oshovl jko modifikátor diethyldithiokrmát sodný neo kyselinu sulfoslicylovou. Seprce chemických forem rtuti v přítomnosti tetrutylmonium-chloridu neo tetrethylmoniumromidu v kominci s NCl yl výrzně omezován nízkou citlivostí stnovení (pětkrát nižší než v přítomnosti modifikátorů oshujících síru). Pro chromtogrfickou seprci chemických forem rtuti yl jko nejvhodnější modifikátor zvolen -sulfnylethnol. Vzrůstjící koncentrce -sulfnylethnolu 499

Chem. Listy, 495 53 (7) Tulk II Vliv modifikátorů n chromtogrfickou seprci Hg + MeHgCl Modifikátor Retenční čsy t R [min] Rozlišení Moilní fáze R S L-Cystein MeHgCl 6,, 7% MeOH +,5% L-cystein v cetátovém pufru Hg + 5,7 -Sulfnylethnol MeHgCl 3,6 Hg + 7, Thiomočovin MeHgCl 7, Hg + 7,6 Diethyldithiokrmát sodný MeHgCl 7,3 Hg + 5, Sulfoslicylová kyselin MeHgCl 7,3 Hg + 4,, 7% MeOH +,5% -sulfnylethnol v cetátovém pufru, 7% MeOH +,5% thiomočovin v cetátovém pufru,8 8% MeOH +,5% diethyldithiokrmát sodný v cetátovém pufru, 8% MeOH +,5% sulfoslicylová kyselin v cetátovém pufru ovlivňovl citlivost stnovení MeHgCl i Hg +, le neměl vliv n stnovení EtHgCl ni PhHgCl. Citlivost stnovení MeHgCl vzrostl čtyřikrát Hg + jeden půlkrát 55 A, mvs A, mv.s 5 5,5 R s, Anorg. Hg MeHgCl,,5,,5,,5 v prostředí,5% -sulfnylethnolu v porovnání s,% -sulfnylethnolem (or. 5). Vzrůstjící koncentrce -sulfnylethnolu způsoovl tké pokles rozlišení (R s ) MeHgCl Hg + (or. 5). Pro chromtogrfickou seprci yl zvolen moilní fáze oshující,5% -sulfnylethnol. Koncentrce methnolu v moilní fázi yl měněn v rozmezí 5 45 %. Nejlepší účinnosti seprce MeHgCl Hg + ylo dosženo, pokud moilní fáze oshovl 5 ž 7 % MeOH (or. 6). Vzhledem k silně nepolárnímu chrkteru mjí EtHgCl PhHgCl v dném chromtogrfickém systému velmi dlouhé retenční čsy (delší než 6 min). Stnovení EtHgCl PhHgCl v rozumném retenčním čse je umožněno skokovým vzrůstem koncentrce methnolu v moilní fázi n % od 5. minuty seprce. Acidit moilní fáze (ph nstveno kyselinou octovou octnem monným) neměl v rozmezí ph od,8 do 5,9 vliv n účinnost seprce chemických forem rtuti. Změn průtokové rychlosti moilní fáze ovlivňovl rozlišení (R s ) MeHgCl Hg +. S rostoucí průtokovou rychlostí kleslo rozlišení těchto dvou chemických forem rtuti; při průtokové rychlosti,5 ml min již ylo nižší než,. Rozlišení dvojic Hg + EtHgCl EtHgCl PhHgCl, Rs,5,,,5,,5,,5 Or. 5. Závislost nlytického signálu (plochy píku) n koncentrci -sulfnylethnolu () vliv koncentrce -sulfnylethnolu [%] n rozlišení MeHgCl Hg + (),! norg. Hg, " MeHgCl (c = µg l (MeHgCl, Hg + ), průtok,5 ml min, m.f. 7% methnol + -sulfnylethnol v cetátovém pufru) k k 4 3 MeHgCl Anorg.Hg 3 4 5 Or. 6. Závislost kpcitního fktoru MeHgCl Hg + (3 µg l ) n oshu methnolu [%] v moilní fázi (methnol +,5 % -sulfnylethnol v cetátovém pufru, průtok,5 ml min ) 5

Chem. Listy, 495 53 (7) 3, R s, Rs,,,,5,,5,,5,3 v, ml.min - v, ml min R s,3,,9,7,5,3 7 7 3 37 37 Rs T, o C T, C Or. 7. Vliv průtokové rychlosti moilní fáze () její teploty () n rozlišení MeHgCl Hg + (3 µg l Hg, 7 % methnol +,5 % -sulfnylethnol v cetátovém pufru) neylo změnou průtokové rychlosti moilní fáze význmněji ovlivňováno. Pro vlstní chromtogrfickou seprci yl zvolen průtoková rychlost,5 ml min (or. 7) Vzrůstjící teplot seprce ovlivňovl rozlišení (R s ) MeHgCl Hg +. S rostoucí teplotou docházelo k nevýrznému poklesu rozlišení těchto dvou chemických forem rtuti (or. 7). HPLC/CV-AFS systém yl prvidelně klirován stndrdními roztoky oshujícími, 5,, 5, 3 6 µg l jednotlivých chemických forem rtuti. Klirční roztoky yly připrvovány denně v prostředí, mol l HCl,, mol l NCl cetátového pufru (ph 5). Klirční křivky yly ve sledovném koncentrčním rozshu pro všechny stnovovné chemické formy rtuti lineární (r >,9998). Vzorové chromtogrmy stndrdů všech čtyř seprovných chemických forem rtuti referenčního mteriálu DORM- jsou uvedeny n or. 8,. Retenční čsy seprovných chemických forem rtuti yly 3,6 min pro MeHgCl, 7, min pro Hg +, 3, min pro EtHgCl 4,7 min pro PhHgCl. Mrtvý retenční čs yl 5 min. Správnost stnovení MeHgCl yl kontrolován nlýzou stndrdního referenčního mteriálu svloviny máčky skvrnité DORM- s oshem MeHgCl (jko Hg) = 4,47±,3 mg kg nlýzou stndrdního referenčního mteriálu sedimentu CRM 58 s oshem MeHgCl (jko CH 3 Hg + ) = 75,5±3,7 µg kg. V referenčním mteriálu DORM- ylo stnoveno 4,38±,6 mg kg MeHgCl (jko Hg) v referenčním mteriálu CRM 58 ylo stnoveno 75,±,9 µg kg MeHgCl (jko CH 3 Hg + ). N zákldě testu správnosti s použitím vysoce spolehlivého referenčního mteriálu ylo zjištěno, že stnovená hodnot je shodná s hodnotou certifikovnou metod tedy poskytuje správné výsledky (DORM-: t =,39; t krit =,6, CRM 58: t =,49; t krit =,6). Správnost stnovení osttních chemických forem rtuti nemohl ýt určen z důvodu nedostupnosti referenčních mteriálů. Meze detekce (při nvážce mg ±, mg desetinásoném ředění, 3.S/N kritérium) RSD uvedené v závorkách (při 5 µg l, n = ) pro jednotlivé chemické formy rtuti doshovly, µg kg (3, %) pro MeHgCl,,7 µg kg (5,3 %) pro Hg +,,6 µg kg (3,4 %) pro PhHgCl, µg kg (4,4 %) pro EtHgCl. 4 mv 6 7 mv 55 4 5 norg. Hg tr = 7, min MeHgCl tr = 3,6 min 3 4 t, min MeHgCl EtHgCl tr = 3, min norg. Hg PhHgCl tr = 4,7 min 4 8 6 4 8 t, min Or. 8. Chromtogrm stndrdů MeHgCl, Hg +, EtHgCl, PhHgCl () referenčního mteriálu DORM- () (3 µg l v prostředí, mol l HCl,, mol l NCl cetátového pufru) při stnovení HPLC-CV-AFS 5

Chem. Listy, 495 53 (7) Porovnání HPLC-CV-AFS GC-ECD p ř i stnovení MeHgCl K porovnání HPLC-CV-AFS s GC-ECD (cit. 8 ) yly vyrány vzorky ryí svloviny (tulk III). Stnovení chemických forem rtuti HPLC/CV-AFS ylo prováděno při optimlizovných prmetrech stnovení zznmenných v tulce I. Osh celkové rtuti (T-Hg) yl stnoven jko součet všech chemických forem rtuti ověřen nlýzou n AMA 54. Kždý vzorek yl měřen čtyřikrát. Test shody středních hodnot yl prováděn s testovcím kritériem T i T. N zákldě testování hypotézy o rozdílu mezi středními hodnotmi dvou souorů dt ylo zjištěno, že oě testovné metody poskytují shodné výsledky při stnovení celkové rtuti i MeHgCl. Přestože oě metody poskytovly shodné výsledky, jko výhodnější se jevilo stnovení chemických forem rtuti HPLC/CV-AFS, která poskytovl větší přesnost stnovení (GC-ECD: %, HPLC/CV-AFS: 6 %), lepší mez detekce (GC-ECD: µg kg, HPLC/CV-AFS:, µg kg ) mnohem větší selektivitu stnovení chemických forem rtuti. Anlýz reálných vzorků Nvržená optimlizovná metod stnovení yl použit pro nlýzu jednotlivých forem rtuti (MeHgCl, Hg +, EtHgCl, PhHgCl) ve svlovině ry odlovených v loklitě Sklk u Cheu. Osh celkové rtuti (T-Hg) yl stnoven jko součet všech chemických forem rtuti ověřen nlýzou n AMA 54. Kždý vzorek yl měřen čtyřikrát. V nlyzovných vzorcích ryí svloviny se oshy celkové rtuti (T-Hg) pohyovly v rozmezí,5 9,7 mg kg v sušině procentuální oshy MeHgCl mezi 9 99 % (tulk III). Závěr Byl vyprcován metod pro vysoce citlivé, selektivní, správné přesné stnovení jednotlivých chemických forem (specií) rtuti (norgnické rtuti Hg +, methylhydrrgyrium-chloridu (MeHgCl), ethylhydrrgyriumchloridu (EtHgCl) fenylhydrrgyrium-chloridu (PhHgCl)) vysoce účinnou kplinovou chromtogrfií ve spojení s tomovou fluorescenční spektrometrií (HPLC/ CV-AFS). Pro seprci chemických forem rtuti yl používán reverzní chromtogrfická stcionární fáze Hypersil BDS C8 isokrtická eluce moilní fází oshující 7 % methnolu,5 % -sulfnylethnolu v cetátovém pufru (ph 5) při průtokové rychlosti,5 ml min. Extrkce chemických forem rtuti yl prováděn extrkčním činidlem oshujícím 6 mol l HCl +, mol l NCl v mikrovlnném extrktoru ( ml extrkčního činidl, min, 55 C, 4 W). Klirční křivky vykzovly vysokou lineritu (r >,9998) v koncentrčním rozmezí 6 µg l. Meze detekce (3 S/N, při nvážce mg ±, mg desetinásoném ředění) RSD hodnoty uvedené v závorkách (při 5 µg l, n = ) yly, µg kg (3, %) pro MeHgCl,,7 µg kg (5,3 %) pro Hg +,,6 µg kg (3,4 %) pro PhHgCl, µg kg (4,4 %) pro EtHgCl. Stilit odeírných vzorků yl prodloužen n měsíce lyofilizcí vzorku následným uchováním při 8 C. Extrkty vzorků yly stilní po dou 3 dnů. Oproti metodě nvržené Rmlhosem 9, umožňuje námi nvržená metod stnovit ve vzorku součsně tké sloučeniny EtHgCl PhHgCl, snižuje retenční čsy MeHgCl Hg + velmi zjednodušuje urychluje extrkční postup. Tulk III Srovnání koncentrcí celkové rtuti (T-Hg) methylhydrrgyrium-chloridu (MeHgCl) ve vyrných druzích ry (mg kg v sušině, v závorkách jsou uvedeny RSD pro n=5 8) stnovených HPLC/CV-AFS GC-ECD technikmi Vzorek Koncentrce [mg kg ] Cejn velký (Armis rm) HPLC/CV-AFS GC-ECD Rozdíly T-Hg MeHgCl T-Hg MeHgCl T-Hg MeHgCl,55 (,),49 (4,5),53,47,, Bolen drvý 9,65 (,6) 9,55 (3,8) 9,68 9,5,3,3 (Aspius spius) Bolen drvý 9,56 (,6) 9,5 (4,) 9,5,9,5,59 (Aspius spius) Bolen drvý 9,6 (,6) 8,7 (4,) 9,7 8,8,8, (Aspius spius) Sumec velký (Silurus glnis) 4,68 (,8) 4,58 (4,6) 4,6 4,94,7,36 Testy shody středních hodnot ( testy shodnosti ) HPLC/CV-AFS vs. GC-ECD pro celkovou rtuť T-Hg (T T =,3, t krit =,3) MeHgCl (T T =, t krit =,3) střední hodnoty se shodují; vzorky oderány ve třech loklitách 5

Chem. Listy, 495 53 (7) Tto práce yl finncován z prostředků Grntové gentury ČR, projekt č. 55/3/367 55/6/P43. LITERATURA. Segde S. R., Tyson J. F.: Spectrochim. Act, Prt B 58, 797 (3).. Uillús F., Alegri A., Brerá R., Frré R., Lgrd M. J.: Food Chem. 7, 59 (). 3. Quevuviller P., Filippelli M., Horvt M.: Trends Anl. Chem. 9, 57 (). 4. Houserová P., Jnák K., Kuáň P., Pvlíčková J., Kuáň V.: Chem. Listy, 86 (6). 5. Meloun M., Militký J.: Sttistické zprcování experimentálních dt. Est Pulishing, Prh 998. 6. Houserová P., Hedávný J., Mtějíček D., Kráčmr S., Sitko J., Kuáň V.: Vet. Med. Czech 5, 6 (5). 7. Vázques M. J., Auín M., Crro A. M., Lorenzo R. A., Cel R.: Chemosphere 39, (999). 8. Mršálek P., Svoodová Z., Rndák T., Švehl J.: Act Vet. Brno 74, 47 (5). 9. Rmlhos E., Río Segde S., Pereir E., Vle C., Durte A.: Anl. Chim. Act 448, 35 (). P. Houserová, D. Mtějíček, V. Kuáň, J. Pvlíčková, nd J. Komárek ( Deprtment of Chemistry nd Biochemistry, Mendel University of Agriculture nd Forestry, Brno, Deprtment of Anlyticl Chemistry, Msryk University, Brno, Czech Repulic): Determintion of Chemicl Forms of Mercury Using High Performnce Liquid Chromtogrphy with Cold Vpour Atomic Fluorescence Spectrometric Detection (HPLC/ CV-AFS) Soniction nd microwve-ssisted extrctions with thiocetic cid, citric cid, cysteine, -sulfnylethnol, queous HCl, nd queous HCl NCl were tested for isoltion of mercury species. A mixture of 6M HCl nd.m NCl ws selected s the most suitle extrction gent. The extrction efficiency ws out % higher nd RSDs were elow 3.3 % when microwve-ssisted extrction ws used insted of soniction. The HPLC/CV- AFS method ws optimized nd used for seprtion nd determintion of inorgnic mercury nd methyl-, ethylnd phenylmercury chloride. Isocrtic elution with mixture contining.5 % of -sulfnylethnol, cette uffer (ph 5) nd 7 % of methnol, with methnol content incresing up to % MeOH, ws used for seprtion of mercury species on reverse phse Hypersil BDS C8 column. The limits of detection of the HPLC/CV-AFS system were estimted (in µg kg ):. (MeHgCl),.7 (Hg + ),.6 (PhHgCl) nd. (EtHgCl). The concentrtions (.5 9.7 mg kg in dry mtter) of totl mercury nd methylmercury chloride in selected fish otined y HPLC/CV-AFS were in good greement (ut more ccurte) with GC-ECD. The RSDs 3. 8. % nd 4. 9. % of the nlyticl procedures for the determintion of totl mercury (cold vpour AAS) nd methylmercury chloride (HPLC/CV-AFS) were determined, respectively. 53