LABORATORNÍ PŘÍSTROJE A POSTUPY

Transkript

1 LABRATRNÍ PŘÍSTRJE A PSTUPY VYUŽITÍ METDY UHPLC-ESI/MS/MS PR STANVENÍ PLYFENLICKÝCH LÁTEK TYPU STILBENŮ LGA PŠENIČNAJA, ZRA KTÍKVÁ, ALENA HEJTMÁNKVÁ, JARMÍR LACHMAN, VLADIMÍR PIVEC, RADMÍRA STŘALKVÁ b MARTIN DĚDINA c Ktedr chemie, Česká zemědělská univerzit v Prze, Kmýcká 129, Prh 6, b Výzkumná stnice vinřská Krlštejn, Krlštejn 98, Krlštejn, c Výzkumný ústv zemědělské techniky, v.v.i., Drnovská 507/73, Prh 6 psenicnj@f.czu.cz Došlo , přeprcováno , přijto Klíčová slov: UHPLC-ESI/MS/MS, trns-resvertrol, cis-resvertrol, trns-piceid, cis-piceid, pokrutiny Úvod Polyfenoly jsou povžovány z jednu z nejvíce zstoupených skupin rostlinných metbolitů. Jsou to látky různého chrkteru, mono, oligo- či polymerní, mnohdy kombinovné s jinými látkmi biogenního původu. Polyfenoly jsou velmi sledovnou skupinou látek díky jejich fyziologické funkci. V rostlině mjí stvební strukturní funkce, zodpovídjí z chuť, vůni brvu. Kromě toho polyfenoly mjí v rostlině obrnnou funkci, chrání před škůdci, infekcemi, chldem, mechnickým poškozením jinými škodlivými vlivy 1. Společnou vlstností fenolických látek je jejich schopnost tvořit reltivně stbilní rdikály. Tto skutečnost je zpříčiněn interkcí hydroxylové skupiny π-elektronů benzenového kruhu. V důsledku toho působí jko ntioxidnty zčleňují se do různých oxidčních procesů zprostředkovných rdikály. Polyfenoly mjí v orgnismu význmnou biologickou roli 2. Rostlinné fenoly polyfenoly v potrvinách jsou předmětem pokrčujícího výzkumu. Ten v posledních letech umožnil zpřesnit znlosti o chemické struktuře koncentrci těchto látek v potrvě potvrdil jejich, to nikoliv pouze ntioxidční, účinky. Některé z nich, zejmén díky jejich možnému blokování iniciční progresní fáze krcinogeneze, jsou využívány ve výzkumu rkoviny slibují využití nejen v prevenci, le i v terpii této choroby 3. V součsné době je velká pozornost věnován resvertrolu, jeho isomerům derivátům (trns- cisresvertrol, trns- cis-piceid, j., obr. 1) jejich biologickým účinkům. Resvertrol je triviální název pro polyfenolickou látku 3,4,5-trihydroxystilben. Z jeho struktury je zřejmé, že mohou existovt dv geometrické isomery, trns- (I) cis- (Ib) resvertrol. V rostlinném mteriálu se obvykle vyskytuje směs obou isomerů, většinou převžuje trnsisomer. Resvertrol se vyskytuje rovněž ve formě glukosidů, β-glukosyloxy-skupin je vázán buď v poloze 3- (triviální název piceid) (II), nebo v poloze 4 - (resvertrolosid), od obou látek je znám trns- i cisisomer. Kromě toho jsou v rostlinném mteriálu přítomny oligomery (konkrétně dehydrooligomery) resvertrolu, tzv. konstitutivní stilbeny, ε-viniferin (Ic) tj. dimer resvertrolu α-viniferin (Id) tj. trimer resvertrolu. Uvedené oligomery resvertrolu nejsou jediné, v poslední době byl popsán řd nlogických oligomerů resvertrolu, npř. murensin H (Ie) 4. Resvertrol lze zřdit mezi fytolexiny, sekundární metbolity rostlin, které se zčínjí tvořit ve zvýšené míře jko odpověď n stres (mechnické poškození, UV záření, ozon) nebo po npdení rostliny neptogenními nebo virulentními bkteriemi, viry či houbmi. Některé fytolexiny mjí ntibkteriální nebo ntifungální účinnost, jiné jsou pro dnou infekci neúčinné; nejsou tedy ekvivlentní protilátkám, které vyšší orgnismy tvoří po infekci 4. Resvertrol působí proti srážlivosti krve potlčuje ktivitu cyklooxygensy-1 (CX-1) hyperoxids. V běžné potrvě jsou obsžen jen stopová množství resvertrolu, který v těchto dávkách k prevenci rkoviny nestčí. Při testech n lbortorních zvířtech byl zjištěn účinná denní dávk k prevenci rkoviny cc 500 μg. Pro člověk by to bylo zhrub 500 mg n den úměrně jeho hmotnosti 5. Resvertrol se běžně v mlém množství nchází v potrvinách denní potřeby, viz tb. I. Výzkum posledních několik let byl změřen též n stnovení resvertrolu nejen ve víně jko nápoji, le i v rostlinném mteriálu révy vinné (Vitis vinifer L.). V roce 2004 Lchmn spol. 6 nlyzovli 12 odrůd révy vinné ze sklizně ročníku Byl stnoven obsh trns-resvertrolu metodou HPLC/DAD. Průměrné roční obshy trns-resvertrolu v letech doshovly hodnot 0, mg kg 1 sušiny 4, mg kg 1 sušiny ve slupkách hroznů 52, mg kg 1 sušiny 4, mg kg 1 sušiny v semenech, v moštu byl obsh trns-resvertrolu znedbtelný. V obszích trnsresvertrolu byly nlezeny sttisticky význmné rozdíly mezi ročníky. Fitová spol. 7 ve stejném roce nlyzovli 76 vzorků bílého vín odrůdy Ryzlink rýnský vyrobeného v České republice z různých vinřských oblstí roků 381

2 -viniferin, Id murensin, Ie br. 1. Chemická struktur isomerů resvertrolu jeho derivátů 4 Tbulk I Koncentrce resvertrolu v běžných druzích potrvin 4 Rostlin Resvertrol [mg kg 1 suš.] Sušin [%] Resvertrol b [mg kg 1 č.p.] Množství [kg] obshující 1 mg resvertrolu Zelí čínské 9 5 0,5 2,2 Kpust hlávková ,0 1,0 Kpust růžičková ,6 0,4 Zelí červené ,4 0,4 Zelí bílé 8 7 0,6 1,8 Brokolice ,8 0,6 Čeknk ,0 1,0 Petržel nťová ,0 1,1 Mrkev krotk ,4 2,5 Červená řep ,8 0,6 Česnek ,6 1,7 Cibule žlutá ,5 0,7 Cibule červená ,1 0,9 Podzemnice olejná ,9 0,5 Čjovník čínský ,9 1,1 Resvertrol obsh resvertrolu v sušině, b Resvertrol obsh resvertrolu v čerstvé potrvině, sušin procento sušiny v potrvině 382

3 sklizně. Byl stnoven obsh trns-resvertrolu metodou HPLC/DAD. Hodnoty trns-resvertrolu v českém regionu byly stnoveny v rozmezí 0,033 0,421 mg l 1 (průměrný obsh 0,117 mg l 1 ), v morvském regionu od 0,033 do 0,875 mg l 1 (průměrný obsh 0,123 mg l 1 ). Ryne spol. 8 v roce 2008 odebrli k nlýze vzorky stébel odrůdy Pinot Noir. Mteriál byl po vysušení při teplotě 45 C extrhován směsí ethnol:vod (80:20). Extrkt byl podroben nlýze HPLC/DAD. Bylo stnoveno množství trns-resvertrolu 3,45 ± 0,04 mg v 1 g sušiny. Anlýzy rozmnitých vedlejších produktů vinohrdnictví pokrčují i ndále. Npříkld pokrutiny jsou velmi důležitým vedlejším produktem výroby oleje z hroznových semínek tké obshují určité množství resvertrolu. Vedle běžně používné metody HPLC/DAD lze ke stnovení stilbenů využít kombinci kplinové chromtogrfie s tndemovou hmotnostní spektrometrií (LC/MS/ MS nebo LC/TMS), která nbývá v posledních letech stále většího význmu. Je to rychlá vysoce citlivá metod, pomocí níž lze stnovit i velmi nízké koncentrce nlytů ve vzorcích. V tndemovém hmotnostním spektrometru jsou umístěny dv hmotnostní spektrometry, mezi nimi dochází k rozbití nlyzovného molekulárního iontu n frgmenty (kolizní cel). Podle spektr frgmentů lze pk potvrdit identitu dné látky. Cílem práce bylo stnovení trns-/cis-resvertrolu trns-/cis-piceidu v pokrutinách, což jsou pevné zbytky po vylisování oleje ze semínek hroznů. Jedná se o odpdní produkt ve vinohrdnictví, ztím bez většího využití, který by mohl být využit pro extrkci (izolci) resvertrolu, přípdně jko krmivo pro hospodářská zvířt. Experimentální část Rostlinný mteriál Vzorky pokrutin byly odebrány ze dvou vinřských oblstí České republiky Mělník Prhy-Grébovky, ze sklizně v letech K produkci oleje zisku pokrutin lisováním semen bylo zvoleno 7 odrůd, čtyři modré tři bílé odrůdy: Rulndské modré, Svtovvřinecké, Zweigeltrebe, Dornfelder, Rulndské šedé, Hibernl Ryzlink rýnský. Použité chemikálie Pro extrkci chromtogrfickou seprci vzorků byly použity následující chemikálie: ethylcetát p.. (99,7%, Lch-Ner s.r.o. Česká republik), methnol p.. (99,5%, Lch-Ner s.r.o. Česká republik), methnol HPLC Grdient grde (99,9%, Fisher Scientific, Velká Británie), cetonitril HPLC Super grdient (99,9%, PCH S.A. Polsko), ledová kyselin octová (99,5 100,5%, Sigm- Aldrich, USA), resvertrol: 3,4,5-trihydroxy-trns-stilben, HPLC (99,7%, Sigm-Aldrich, USA), piceid: 3,4,5-trihydroxystilben-3--β-D-glukopyrnosid, HPLC (95%, Extrsynthese, Frncie), deionizovná vod (Millipore Simplicity UV, Frncie). Zvolený postup extrkce rostlinného mteriálu vychází z publikovné metody Liu spol. 9 Bylo nváženo 0,2 g suchého rozemletého vzorku do plstových uzvírtelných kyvet, ke kždému vzorku bylo přidáno 10 ml extrkční směsi methnol:ethylcetát (1:1). Vzorky byly ponechány v extrkční směsi k smovolné extrkci do druhého dne. Následovně byly vzorky umístě- Tbulk II Podmínky HPLC nlýzy Prmetr Kplinový chromtogrf Anlytická kolon Mobilní fáze Eluce Hodnot UltiMte 3000 RS (Thermo Fisher Scientific, Sunnyvle, USA) Pinncle DB C18 (50 2,1mm, 1,9 µm; RESTEK, USA) cetonitril (A), 0,1% kyselin octová (B) grdientová 0,0 0,2 min 5 % A, 95 % B (isokrt.) 0,2 5,0 min 65 % A, 35 % B (lin.gr.) 5,0 5,2 min 90% A, 10 % B (lin.gr.) 5,2 6,5 min 90% A, 10 % B (isokrt.) 6,5 7,0 min 5% A, 95 % B (lin.gr.) 7,0 9,0 min 5% A, 95 % B (isokrt.) Průtok 0,35 ml min 1 Teplot kolony 30 C Teplot utosmpleru 20 C bjem nástřiku 1 μl Dob nlýzy 9 min 383

4 ny n 10 min do ultrzvukové lázně (Notus Powersonic s.r.o., Vrble, Slovensko) k podpoře rozpouštění látek, dále byly odstředěny po dobu 5 min v centrifuze Eppendorf 5810R (Eppendorf AG, Hmburg, Německo), (G = 11,5). Superntnt byl převeden do 50ml odprných bněk celý postup extrkce byl dvkrát opkován s 5 ml směsi methnol:ethylcetát (1:1). Spojené extrkty byly odpřeny do such n vkuové rotční odprce při 40 C (Buchi, Švýcrsko) odprek byl rozpuštěn v 5 ml methnolu. Extrkt byl přefiltrován přes mikrofiltr PVDF 0,22 µm do tmvých vilek byl podroben UHPLC-ESI/ MS/MS nlýze dle podmínek uvedených v tb. II. Detekce Byl použit hybridní trojitý kvdrupól s lineární iontovou pstí (3200 QTRAP; AB Sciex, Foster City, USA), zdroj ESI (electro-spry ionistion). Podmínky ve zdroji jsou uvedeny v tb. III. Prmetry metody viz tb. IV. Vyhodnocení dt bylo provedeno progrmem Anlyst 1.4 Softwre. Výsledky diskuse Identifikce kvntifikce Identifikce nlytů ve vzorcích byl proveden porovnáním retenčního čsu nlytů retenčních čsů stndrdů. Potvrzení identity bylo provedeno srovnáním kvntifikčního konfirmčního přechodu seprovných nlytů stndrdů. Kvntifikce nlytů byl proveden metodou externí klibrce. Do 10ml odměrné bňky byl připrven klibrční roztok směsného stndrdu trns-piceidu trnsresvertrolu o koncentrci 2 μg ml 1. Z části klibrčního roztoku byl vytvořen klibrční sd pro trns-formy o koncentrcích 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0 2,0 μg ml 1. Zbylá část klibrčního roztoku byl umístěn n 90 min pod UV lmpu (λ=365 nm). Po 90 min expozice bylo 85 ž 88 % trns-forem převedeno n cis-formy, dlší expozicí UV záření se již koncentrce cis-forem v roztoku nezvyšovl. Z tohoto roztoku byl vytvořen lterntivní klibrční sd pro cis-formy piceidu resvertrolu. Přesná koncentrce cis-forem byl vypočítán z poklesu ploch chromtogrfických píků příslušných trns-forem obou nlytů. Určení limitů detekce (LD) kvntifikce (LQ) Tbulk III Podmínky ve zdroji Prmetr Hodnot chrnný plyn 30 psi Kolizní plyn střední Npětí zdroje 4500 V Teplot 600 C Zmlžovcí plyn 50 psi Turboplyn 30 psi Detekční (LD) kvntifikční limity (LQ) byly určeny n zákldě postupu, který byl popsán v rámci mezinárodní konference o hrmonizci 10. Metod je zložen n stnovení třech různých koncentrcí, ncházejících se blízko k limitu detekce (koncentrce trns- cis-piceidu cis-resvertrolu 0,005 µg ml 1 ; 0,0025 µg ml 1 ; 0,001 µg ml 1 ; trns-resvertrolu 0,01 µg ml 1 ; 0,005 µg ml 1 ; 0,0025 µg ml 1 ). Kždá koncentrce stndrdního roztoku byl dávkován do HPLC pětkrát z účelem získání pěti klibrčních přímek. Z pěti průměrných hodnot směrnic přímek (S) směrodtných odchylek průsečíků n ose Y (σ) byly vypočteny příslušné hodnoty LD LQ limitů pomocí vzorců 3,3.σ/S resp. 10.σ/S (tb. V). Vyvinutá UHPLC-MS/MS metod stnovení polyfenolických látek typu stilbenů byl použit pro stnovení Tbulk IV Prmetry metody pro stnovení Anlyt cis-, trnspiceid cis-, trnsresvertrol přechod Q1 hmot [D] Q3 hmot [D] MRM negtivní iontový mód čs [ms] kvntifikční 389,0 227, konfirmční 389,0 185, kvntifikční 226,9 143, konfirmční 226,9 185, DP EP CEP CE CXP DP deklsterční potenciál; EP vstupní potenciál; CEP vstupní potenciál do cely; CE kolizní energie; CXP výstupní potenciál z cely 384

5 Tbulk V Meze detekce (LD) kvntifikce (LQ) stnovení studovných nlytů metodou UHPLC ESI/MS/MS Anlyt LD [µg ml 1 ] LQ [µg ml 1 ] LD [µg g 1 suš.] LQ [µg g 1 suš.] trns-piceid 0,001 0,003 0,025 0,075 cis-piceid 0,001 0,003 0,025 0,075 trns-resvertrol 0,003 0,009 0,075 0,225 cis-resvertrol 0,001 0,004 0,025 0,075 čs, min br. 2. Chromtogrm sledovných nlytů (trns-piceid, cis-piceid, trns-resvertrol, cis-resvertrol) v odrůdě Zweigeltrebe cis- trns-resvertrolu cis- trns-piceidu v pokrutinách získných po vylisování oleje ze semen různých odrůd révy vinné sklizené v letech Chromtogrm sledovných nlytů v odrůdě Zweigeltrebe je uveden n obr. 2. Jednotlivé vzorky byly nlyzovány ve třech prlelních opkováních (tb. VI VII) s průměrnou reltivní směrodtnou odchylkou trns-piceidu 5,74 %, trns-resvertrolu 8,20 %, cis-piceidu 4,30 % cis-resvertrolu 11,62 %. N zákldě provedených nlýz lze konsttovt, že největší zstoupení v pokrutinách všech odrůd má trnsresvertrol, následovný pro většinu odrůd trns-piceidem. cis-formy jsou ž n výjimky (Rulndské modré Svtovvřinecké) zstoupeny minoritně. V pokrutinách některých odrůd ze sklizně v roce 2012 byly obshy cis-forem dokonce pod mezí detekce. bsh jednotlivých nlytů je odrůdově závislý. Nejvyšší obshy cis- trnsresvertrolu byly stnoveny v pokrutinách odrůd Rulndské modré (trns-resvertrol 17,1 ± 1,68 μg g 1 resp. 24,4 ± 1,59 μg g 1 ; cis-resvertrol 3,28 ± 0,11 μg g 1 resp. 6,43 ± 0,29 μg g 1 ) Zweigeltrebe (trns-resvertrol 15,4 ± 0,21 μg g 1 resp. 14,8 ± 1,51 μg g 1 ; cis-resvertrol 2,14 ± 0,08 μg g 1 resp. 2,12 ± 0,24 μg g 1 ) pěstovných v Mělníku. Nejvyšší obsh trns-piceidu byl stnoven v pokrutinách odrůdy Hibernl (3,97 ± 0,17 μg g 1 ) ze sklizně v roce Nejvyšší obsh cis-piceidu byl stnoven v pokrutinách odrůdy Dornfelder (2,49 ± 0,06 μg g 1 ) pěstovné v Prze-Grébovce opět v roce Význmný vliv n obsh cis- trns-resvertrolu piceidu bude mít prvděpodobně i pěstební loklit. Pokrutiny z odrůdy Rulndské modré pěstovné v Mělníku i Prze-Grébovce mjí několiknásobně vyšší obsh cis trns-resvertrolu pokud jsou původem z vinné révy z loklity Mělník, obshy cis- trns-piceidu jsou všk srovntelné. N zákldě dosžených výsledků lze rovněž předpokládt, že i v jiných odrůdách pěstovných 385

6 Tbulk VI bsh nlytů ve vzorcích z roku Pokrutiny Rok t-pic b t-res c c-pic d c-res e Rulndské modré G ,14 ± 0,11 2,91 ± 0,37 0,59 ± 0,02 0,17 ± 0,01 Rulndské modré G ,48 ± 0,12 1,85 ± 0,45 0,62 ± 0,02 0,06 ± 0,03 Svtovvřinecké M ,64 ± 0,23 2,69 ± 0,01 0,57 ± 0,03 0,11 ± 0,02 Svtovvřinecké M ,66 ± 0,08 12,2 ± 0,41 2,45 ± 0,09 3,09 ± 0,14 Rulndské šedé G ,96 ± 0,11 1,04 ± 0,09 <LD <LD Rulndské šedé G ,74 ± 0,00 2,64 ± 0,06 1,48 ± 0,06 0,14 ± 0,01 Zweigeltrebe M ,16 ± 0,76 15,4 ± 0,21 1,08 ± 0,05 2,14 ± 0,08 Zweigeltrebe M ,51 ± 0,17 14,8 ± 1,51 1,90 ± 0,22 2,12 ± 0,24 Dornfelder G ,13 ± 0,06 3,96 ± 0,41 0,52 ± 0,02 0,32 ± 0,04 Dornfelder G ,86 ± 0,20 7,36 ± 0,84 2,49 ± 0,06 0,84 ± 0,03 Rulndské modré M ,80 ± 0,03 17,1 ± 1,68 0,83 ± 0,04 3,28 ± 0,11 Rulndské modré M ,53 ± 0,21 24,4 ± 1,59 1,25 ± 0,08 6,43 ± 0,29 Hibernl G ,03 ± 0,02 5,28 ± 0,13 <LD <LD Hibernl G ,97 ± 0,17 8,80 ± 0,35 1,44 ± 0,01 0,20 ± 0,03 Ryzlink Rynský M ,58 ± 0,01 3,51 ± 0,03 <LD <LD Ryzlink Rynský M ,98 ± 0,14 10,8 ± 2,44 0,60 ± 0,01 0,15 ± 0,03 G Prh-Grébovk, M Mělník; b t-pic trns-piceid, c t-res trns-resvertrol, d c-pic cis-piceid, e c-res cisresvertrol; LD v [μg ml 1 ]: t-pic=0,001, c-pic=0,001, t-res=0,003, c-res=0,001 Tbulk VII Specifikce výběrového souboru dt z tb. VI Pokrutiny Rok Min b Mx c Průměr d σ e t-pic ,58 3,16 1,93 0,82 42,7 t-pic ,98 3,97 2,97 0,69 23,3 t-res ,04 17,1 6,49 6,17 95,0 t-res ,85 24,4 10,36 7,21 69,6 c-pic ,00 1,08 0,45 0,41 91,8 c-pic ,60 2,49 1,53 0,73 47,5 c-res ,00 3,28 0,75 1, c-res ,06 6,43 1,63 2, t-pic trns-piceid, t-res trns-resvertrol, c-pic cis-piceid, c-res cis-resvertrol; b min minimální hodnot, c mx mximální hodnot, d průměr průměrná hodnot, e σ směrodtná odchylk, f s r reltivní směrodtná odchylk s r f [%] v Mělníku je možné očekávt vyšší obshy cis- trnsresvertrolu. bshy nlytů v pokrutinách většiny odrůd z roku 2013 jsou mírně vyšší ve srovnání s rokem 2012, což může souviset s vlivem počsí během pěstování, výskytem chorob škůdců v dném roce. Vinřský ročník 2012 byl extrémně suchý, n rozdíl od roku 2013, který ptřil k jednomu z nejlepších vinřských ročníků dle průběhu počsí. Závěr V této práci byl vyvinut testován metod UHPLC-ESI/MS/MS pro stnovení cis- trnsresvertrolu piceidu v pokrutinách ze semen révy vinné. Metod je vhodná pro stnovení těchto nlytů v koncentrci nejméně 0,009 µg ml 1 extrktu. Průměrná reltivní směrodtná odchylk 3 prlelních stnovení 386

7 nepřesáhl 12 %. Touto metodou byly stnoveny obshy cis- trns-resvertrolu piceidu v pokrutinách získných lisováním semen různých odrůd révy vinné pěstovné ve dvou různých loklitách. První výsledky nznčují, že obshy sledovných nlytů jsou odrůdově závislé zároveň jsou ovlivněny i ročníkem loklitou pěstování révy vinné. Poděkování MZe, 111B107 NAZV, Výzkum získávání využití biologicky ktivních látek (BAL) ze semen vinných hroznů pro zlepšení metbolismu hospodářských zvířt jko podkld pro návrh nejlepší dostupné techniky (BAT) MZe čj / , Národní progrm konzervce využívání genetických zdrojů rostlin grobiodiverzity. LITERATURA 1. Hrmth J.: Chem. Listy 99, 622 (2005). 2. Prr A. J., Bolwell G. P.: J. Sci. Food Agr. 80, 985 (2000). 3. Zloch Z.: Voj. Zdrv. Listy 5, 226 (2003). 4. Šmidrkl J., Filip V., Melzoch K., Hnzlíková I., Buckiová D., Křís B.: Chem. Listy 95, 602 (2001). 5. Melzoch K., Hnzlíková I., Filip V., Buckiová D., Šmidrkl J.: Agric. Conspec. Sci. 66, 53 (2001). 6. Lchmn J., Šulc M., Hejtmánková A., Pivec V., rsák M.: Hort. Sci. (Prgue) 31, 63 (2004). 7. Fitová K., Hejtmánková A., Lchmn J., Pivec V., Dudjk J.: Czech J. Food Sci. 22, 215 (2004). 8. Ryne S., Krcbey E., Mzz G.: Ind. Crops Prod. 2008, Liu C., Wng L., Wng J., Wu B., Liu W., Fn P., Ling Z., Li S.: Food Chem. 136, 643 (2013). 10. Interntionl Conference on Hrmoniztion (ICH): Guideline on the Vlidtion of Anlyticl Procedures: Methodology Q2B, Genev, 6 th November Pšeničnj, Z. Kotíková, A. Hejtmánková, J. Lchmn, V. Pivec, R. Střlková b, nd M. Dědin c ( Deprtment of Chemistry, Czech University of Life Sciences Prgue, b Viticulture Reserch Sttion, Krlštejn, c Reserch Institute of Agriculturl Engineering, Prgue): The Use of UHPLC-ESI/MS/MS Method for the Determintion of Stilbene Type Polyphenols This pper dels with the determintion of cis-/trnsresvertrol nd piceid in the cke formed from the grpe seeds by introducing nd testing of the UHPLC-ESI/MS/ MS method. The cke is solid residue remining fter pressing oil from grpe seeds. It is wste product in viticulture, which cn be used for the extrction (isoltion) of resvertrol, or s dietry supplement for cttle. Smples were selected from the hrvests of 2012 nd 2013 from two different loctions in the Czech Republic: Prgue- Grébovk nd Mělník. First results indicte tht the concentrtions of nlytes re vrietl dependent nd ffected lso by the loction nd the yer of the hrvest. The highest levels of cisnd trns-resvertrol were found in the cke of Pinot Noir nd Zweigeltrebe vriety. The vlues of trns-resvertrol obtined for 2012 nd 2013 in Pinot Noir vriety were 17.1 ± 1.7 μg g 1 nd 24.4 ± 1.6 μg g 1, respectively, in cisresvertrol 3.3 ± 0.1 μg g 1 nd 6.4 ± 0.3 μg g 1 respectively. The vlues of trns-resvertrol obtined for 2012 nd 2013 in Zweigeltrebe vriety were 15.4 ± 0.2 μg g 1 nd 14.8 ± 1.5 μg g 1, respectively, in cis-resvertrol 2.1 ± 0.1 μg g 1 nd 2.1 ± 0.2 μg g 1, respectively. Both vrieties hve grown in Mělník. The highest content of trns-piceid ws found in the cke of Hibernl vriety (3.9 ± 0.2 μg g 1 ) from the hrvest of The highest content of cis-piceid ws determined in the cke of Dornfelder vriety (2.5 ± 0.1 μg g 1 ) grown in Prgue-Grébovk in