UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE 2. LÉKAŘSKÁ FAKULTA Ústav klinické biochemie a patobiochemie FN v Motole Michaela Daňková Význam stanovení SAA a porovnání s CRP a prokalcitoninem Bakalářská práce Praha 2012

Autor práce: Michaela Daňková Vedoucí práce: RNDr. Jiří Zadina, CSc. Oponent práce: Prof. MUDr. Richard Průša, CSc. Datum obhajoby: 2012

Bibliografický záznam DAŇKOVÁ, Michaela. Význam stanovení SAA a porovnání s CRP a prokalcitoninem. Praha: Univerzita Karlova, 2. lékařská fakulta, Ústav klinické biochemie a patobiochemie, 2012. 60 s. Vedoucí bakalářské práce RNDr. Jiří Zadina, CSc. Anotace Bakalářská práce se zabývá významem stanovení sérového amyloidu A (SAA) u vybraných skupin pacientů a porovnání s C-reaktivním proteinem (CRP) a prokalcitoninem (PCT). SAA, CRP a PCT jsou proteiny akutní fáze, které vykazují významný vzestup koncentrace v krvi během několika hodin po zánětovém stimulu. Syntéza probíhá v játrech a je vyvolána prozánětlivými cytokiny. CRP je nejstarší a v rutinní praxi nejpoužívanější reaktant akutní fáze. SAA a hlavně prokalcitonin patří mezi novější ukazatele zánětu. SAA není tak často využívaný v diagnostice, přestože je stejně senzitivním reaktantem akutní fáze jako CRP, protože teprve v nedávné době byla vyvinuta metoda vhodná k rutinnímu stanovení. Teoretická část práce stručně popisuje proteiny akutní fáze a podrobněji se soustředí na charakteristiku a srovnání SAA, CRP a PCT. V další části jsou popsány metody stanovení jednotlivých analytů. Experimentální část je zaměřena na charakteristiku vybraného souboru pacientů a metodiku měření SAA imunonefelometrickou metodou na biochemickém analyzátoru Immage 800. Získaná data u tří vybraných skupin pacientů byla statisticky vyhodnocena. Cílem práce bylo zhodnotit korelaci zánětlivých markerů u dvou vybraných skupin a u třetí skupiny porovnat hladiny CRP a SAA u obézních pacientek a zdravé kontrolní skupiny. Klíčová slova proteiny akutní fáze, sérový amyloid A, C-reaktivní protein, prokalcitonin, imunonefelometrie

Annotation The purpose of the bachelor thesis is to evaluate serum amyloid (SAA) as a diagnostic marker in selected patient groups and to compare the results of SAA with those of C-reactive protein (CRP) and procalcitonin (PCT). SAA, CRP and PCT are acute-phase proteins, whose blood concentration significantly increases within a few hours after an inflammatory stimulus. The synthesis, caused by proinflammatory cytokines, takes place in the liver. CRP is the most and longest used acute-phase reactant in routine practice. As indicators of inflammation, SAA and especially procalcitonin have been used more lately. Although SAA is an acute-phase reactant as sensitive as CRP, it is not employed so often in the diagnosis since a method suitable for routine diagnosis was not developed until recently. Briefly describing the acute-phase proteins, the theoretical part elaborates on the characterization and comparison of SAA, CRP and PCT. It further outlines methods for the determination of individual analytes. The experimental part focuses on defining selected patient groups and the immunonephelometric method for measuring SAA by the Immage 800 biochemical analyzer. The data obtained in three selected patient groups have been statistically evaluated. The aim of the thesis has been to evaluate the correlation of inflammatory markers in two selected groups and to compare the CRP and SAA levels in the third group consisting of obese female patients and a healthy control group. Keywords acute phase proteins, serum amyloid A, C-reactive protein, procalcitonin, imunonephelometry

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci zpracovala samostatně pod vedením RNDr. Jiřího Zadiny, CSc., uvedla všechny použité literární a odborné zdroje a dodržovala zásady vědecké etiky. Dále prohlašuji, že stejná práce nebyla použita k získání jiného nebo stejného akademického titulu. V Praze dne 23. 4. 2012 Michaela Daňková

Poděkování Ráda bych poděkovala svému školiteli RNDr. Jiřímu Zadinovi, CSc. z Ústavu klinické biochemie a patobiochemie 2. lékařské fakulty UK a FN Motol za odborné vedení mé práce. Dále děkuji Ing. Martě Pechové, také z Ústavu klinické biochemie a patobiochemie, za pomoc při sběru vzorků a MUDr. Tomáši Fraňkovi z téhož ústavu za bližší seznámení s analyzátorem Immage a pomoc při stanovení SAA. Také děkuji Lubomíru Štěpánkovi za cenné rady a pomoc při statistickém vyhodnocení.

Obsah Obsah ÚVOD... 9 1 TEORETICKÁ ČÁST... 10 1.1 PROTEINY AKUTNÍ FÁZE (APP)... 10 1.1.1 Reakce akutní fáze... 10 1.1.2 Význam a biochemická charakteristika APP... 11 1.1.3 Rozdělení APP... 12 1.1.4 Cytokiny... 14 1.2 SÉROVÝ AMYLOID A (SAA)... 15 1.2.1 Genetická a biochemická charakteristika... 15 1.2.2 Funkce a význam... 16 1.3 C-REAKTIVNÍ PROTEIN (CRP)... 17 1.3.1 Pentraxiny... 18 1.3.2 Genetická a biochemická charakteristika... 18 1.3.3 Funkce a význam... 19 1.4 PROKALCITONIN (PCT)... 20 1.4.1 Genetická a biochemická charakteristika... 21 1.4.2 Uplatnění v diagnostice a interpretace nálezů... 22 1.4.3 Kalcitonin... 25 1.5 SROVNÁNÍ SAA, CRP A PCT... 25 1.6 METODY STANOVENÍ... 26 1.6.1 Turbidimetrie a nefelometrie... 27 1.6.2 Stanovení SAA... 28 1.6.3 Stanovení CRP... 28 1.6.4 Stanovení PCT... 29 2 CÍLE PRÁCE... 31 3 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST... 32 3.1 SOUBOR PACIENTŮ... 32 3.1.1 Skupiny pacientů... 32 3.1.2 Metodika sběru a přechovávání vzorků... 33 3.2 METODA STANOVENÍ SAA... 34 3.2.1 Princip metody... 34

Obsah 3.2.2 Immage 800... 34 3.2.3 Reagencie... 35 3.2.4 Přístrojové vybavení a spotřební materiál... 36 3.2.5 Pracovní postup... 36 3.3 STATISTICKÉ VYHODNOCENÍ... 38 3.3.1 Skupina obézních a kontrolní skupina... 38 3.3.2 Skupina kojenců a dětí a skupina prokalcitoninu... 39 4 VÝSLEDKY... 42 4.1 SKUPINA OBÉZNÍCH A KONTROLNÍ SKUPINA... 42 4.1.1 Naměřené hodnoty... 42 4.1.2 Statistické vyhodnocení... 43 4.2 SKUPINA KOJENCŮ A DĚTÍ... 45 4.2.1 Naměřené hodnoty... 45 4.2.2 Statistické vyhodnocení... 46 4.3 SKUPINA PROKALCITONINU... 47 4.3.1 Naměřené hodnoty... 47 4.3.2 Statistické vyhodnocení... 50 5 DISKUZE... 53 5.1 SKUPINA OBÉZNÍCH A KONTROLNÍ SKUPINA... 53 5.2 SKUPINA KOJENCŮ A DĚTÍ... 54 5.3 SKUPINA PROKALCITONINU... 54 ZÁVĚR... 56 SEZNAM LITERATURY... 57

Seznam zkratek Seznam zkratek AA amyloid A (amyloid associated) AACT α 1 -antichymotrypsin AAT α 1 -antitrypsin AGP α 1 -kyselý glykoprotein (orosomukoid) AM α 2 -makroglobulin AMK aminokyseliny APP proteiny akutní fáze (acute phase proteins) BMI index tělesné hmotnosti (body mass index) C3, C4 složky komplementu Cpl ceruloplazmin CRP C-reaktivní protein Fbg fibrinogen FN Fakultní nemocnice HDL vysoce denzní lipoproteiny (high-density lipoproteins) Hp haptoglobin Hpx hemopexin hs-crp vysoce senzitivní stanovení CRP (high-sensitivity C-reactive protein) IL-1 interleukin 1 IL-6 interleukin 6 LDL nízko denzní lipoproteiny (low-density lipoproteins) LPS lipopolysacharid, endotoxin MODS syndrom multiorgánového selhání (multiorgan distress syndrome) PAI-1 inhibitor aktivátoru plasminogenu 1 PCT prokalcitonin PEG polyethylenglykol POCT testování v místě péče o pacienta (point-of-care testing) SAA sérový amyloid A SAP sérový amyloid P SERPIN inhibitory serinových proteáz SIRS syndrom systémové zánětlivé odpovědi (systemic inflammatory response syndrome) TNF-α tumor nekrotizující faktor α UK Univerzita Karlova ÚKBP Ústav klinické biochemie a patobiochemie

Úvod ÚVOD Pro eukaryotické organizmy je charakteristická přítomnost obranných a adaptačních mechanizmů. Tyto fyziologické děje se označují jako reakce akutní fáze. Jejím hlavním úkolem je zajistit stabilitu vnitřního prostředí při narušení jeho integrity. Dochází k výrazným změnám jaterní proteosyntézy a tvorbě tzv. proteinů akutní fáze (APP). Tyto proteiny jsou důležitou složkou nespecifické imunity. Jsou uvolňovány z hepatocytů vlivem působení prozánětlivých cytokinů. V klidovém období jsou koncentrace těchto proteinů nízké nebo i neměřitelné, ale po zánětlivém stimulu mohou prudce stoupat, pak je označujeme jako pozitivní reaktanty nebo naopak jejich koncentrace klesá, tyto proteiny pak nazýváme negativní reaktanty [1, s. 10-27]. Od objevení prvního proteinu akutní fáze CRP v roce 1930 v laboratořích Rockefellerovy univerzity uběhlo již více než 80 let. Za tu dobu si bezesporu proteiny akutní fáze vysloužily nenahraditelnou úlohu v diagnostice a monitorování zánětlivých stavů. Jejich použití již dnes není omezeno pouze na diagnostiku zánětu, ale mají diagnostický význam např. i u kardiovaskulárních onemocnění, revmatických a nádorových onemocnění a u rejekce štěpu. Mnoho APP je stále předmětem intenzivního výzkumu a zdaleka dnes není prozkoumána fyziologická a patogenetická úloha všech APP [2]. Ve své práci se zaměřím na některé z proteinů akutní fáze, především sérový amyloid A, C-reaktivní protein a jeden z novějších ukazatelů zánětu prokalcitonin. U sérového amyloidu A se budu zabývat jeho stanovením u třech vybraných skupin pacientů imunonefelometrickou metodou na analyzátoru Immage 800. Na první skupině obézních pacientek a k ní náhodně vybrané zdravé kontrolní skupině se pokusím potvrdit stanovenou hypotézu, že koncentrace zánětlivých markerů (v tomto případě SAA a CRP) budou u obézních žen vyšší než u zdravé skupiny. U druhé skupiny složené z kojenců a dětí a třetí skupiny vybrané podle hladiny prokalcitoninu budu hodnotit korelaci mezi markery zánětu. Na skupině kojenců a dětí korelaci mezi CRP a SAA a u poslední skupiny prokalcitoninu budu porovnávat korelaci mezi PCT, CRP a SAA. 9

1 Teoretická část 1 TEORETICKÁ ČÁST 1.1 Proteiny akutní fáze (APP) Proteiny akutní fáze jsou sekreční proteiny jaterních buněk, jejichž tvorba a uvolnění do cirkulace jsou regulovány prozánětlivými cytokiny [1, s. 14]. Tato současná definice je zaměřena především na regulační mechanizmus syntézy proteinů. Podle starší definice jsou proteiny akutní fáze (APP) plazmatické bílkoviny, které se tvoří v játrech a jejichž koncentrace stoupá během prvních 7 dnů zánětu o 25 % a více. Regulaci syntézy a sekrece APP zajišťují prozánětlivé cytokiny, především interleukiny 1 a 6 (IL-1, IL-6) a tumor nektotizující faktor α (TNF-α). Tvorbu APP ovlivňuje i řada dalších faktorů, např. protizánětlivé cytokiny, hormony, růstové faktory, těžké kovy i faktory fyzikální povahy. Hlavním zdrojem APP jsou játra, ale nutno dodat, že prakticky žádný protein se netvoří pouze v hepatocytech. Produkce APP probíhá v menší míře i v extrahepatálních tkáních a regulována je také prozánětlivými cytokiny [1, s. 13-14; 3, s. 73]. 1.1.1 Reakce akutní fáze Reakce akutní fáze je nespecifická obranná reakce organizmu. Je založena na obranných a adaptačních systémech, které slouží k zajištění stability vnitřního prostředí při narušení jeho integrity. Rozvíjí se při lokálním nebo systémovém zánětu, při traumatickém poškození tkáně a při nádorovém bujení. Dochází ke kvantitativním a kvalitativním změnám v proteosyntéze. V játrech se zvyšuje exprese proteinů, které jsou potřebné pro průběh obranné reakce a pro udržení homeostázy. Stoupají hladiny plazmatických proteinů nezbytných pro obranu makroorganizmu a současně klesá syntéza strukturních proteinů [1, s. 13; 3, s. 73; 4, s. 549]. Zánětlivá reakce může mít řadu příčin, může být vyvolána jak imunologickým podnětem, tak neimunologickým. Imunologickým podnětem je nejčastěji bakteriální, virová nebo parazitární infekce. Naopak neimunologickým podnětem může být poranění způsobené chemickými a fyzikálními vlivy, jako je např. popálení, poleptání nebo ozáření, dále pak může jít o poškození nádorovým bujením nebo pooperační komplikace. Cílem zánětlivé reakce je však vždy lokalizovat poškození, zamezit dalšímu šíření a následně zajistit zhojení poškozené tkáně, aby mohla dále plnit svou fyziologickou funkci [5, s. 60; 6, s. 489]. 10

1 Teoretická část Podle rozsahu a délky trvání se rozlišují dva typy zánětlivé reakce, lokální a systémová reakce. Dále se rozlišuje akutní a chronický zánět. Akutní zánět je považován za fyziologický proces, protože většinou odezní bez následků a poškozená tkáň se kompletně zhojí. Naopak chronický zánět je vždy patologický, dochází k destrukci tkáně, částečnému nahrazení vazivem a trvalému poškození [5, s. 57]. Lokální zánětlivá reakce má své typické příznaky, mezi které patří zčervenání, otok, bolest a zvýšení teploty [5, s. 57]. Pokud je však zánět dostatečně intenzivní, projeví se systémovou reakcí. Pro celkovou reakci organizmu jsou charakteristické tyto projevy: horečka, buněčná odpověď (leukocytóza), hormonální odpověď a změna koncentrace proteinů akutní fáze [3, s. 73]. V roce 1992 byla přijata společností Critical Care Society definice syndromu systémové zánětlivé odpovědi (SIRS). SIRS je systémová odezva organizmu na infekční i neinfekční podněty. Jako sepse se označuje SIRS vyvolaný infekčním podnětem. Vždy jde o akutní a život ohrožující stav. SIRS může vyústit až do stavu, kdy orgánové funkce nejsou schopny udržet homeostázu a dochází k multiorgánové dysfunkci, která se označuje jako syndrom multiorgánového selhání (MODS) [4, s. 549]. 1.1.2 Význam a biochemická charakteristika APP Společnou vlastností proteinů akutní fáze je regulace jejich syntézy prozánětlivými cytokiny a zásadní význam v průběhu zánětlivé odpovědi. APP mají některé společné biochemické charakteristiky. Oligomerické uspořádání má vliv na biologické funkce APP, ovlivňuje biologický poločas a afinitu k cílovým strukturám. Typická je skupina pentraxinů s pentamerickým uspořádáním. Dalším společným znakem je významná genetická variabilita většiny APP, která má vliv na plazmatické hladiny v klidovém i zánětlivém období. Poločas APP v cirkulaci závisí na jejich funkci. APP jsou z oběhu odstraněny degradací volnými proteolytickými enzymy nebo mohou být po vazbě na specifické receptory odstraněny endocytózou [1, s. 19-21]. Proteiny akutní fáze mají své specifické funkce, většina APP má však polyfunkční charakter, jak je vidět v tabulce 1 a 2. APP působí jako regulátory zánětlivých reakcí, slouží k opsonizaci bakteriálních membrán a buněčných složek. Dále se uplatňují jako inhibitory, inaktivují proteolytické enzymy a tím chrání tkáně před proteolýzou. Mají úlohu scavengerů neboli zametačů, kteří zajišťují ochranu před oxidačním stresem. Důležitou funkcí je i imunomodulační aktivita, kdy dochází k ovlivnění tvorby cytokinů a leukocytů pomocí specifických receptorů pro APP. APP 11

1 Teoretická část mají transportní funkci, také se uplatňují při adhezi a agregaci trombocytů, aktivují komplement, dále ovlivňují koagulační kaskádu a inhibují fibrinolýzu. V neposlední řadě napomáhají v reparačních procesech, regulují buněčnou proliferaci a stimulují angiogenezi [1, s. 22-26; 6, s. 491]. 1.1.3 Rozdělení APP Do rodiny proteinů akutní fáze patří asi 30 plazmatických bílkovin jaterního původu s pozitivním, negativním nebo neutrálním chováním během systémové reakce [7, s. 5]. Podle toho APP dělíme: Pozitivní APP Díky stimulaci IL-1, TNF-α, IL-6 nebo jejich kombinaci dochází ke zvýšení plazmatické hladiny pozitivních APP [1, s. 15]. V tabulce 1 je přehled nejčastěji využívaných pozitivních APP, jejich hlavních funkcí a referenčních mezí. Tabulka 1. Přehled pozitivních APP Název Zkratka Referenční meze C-reaktivní protein CRP 0 5 mg/l Sérový amyloid A SAA 0-10 mg/l Prokalcitonin PCT 0 0,5 μg/l Ceruloplazmin Cpl 0,2 0,6 g/l Haptoglobin Hp 0,3 2,0 g/l Hemopexin Hpx 1,0 1,9 g/l Fibrinogen Fbg 2 4 g/l α 1 -antitrypsin AAT 1,2 2,4 g/l Hlavní funkce opsonizace, aktivace komplementu, modulace fagocytózy, indukce apoptózy, antioxidační aktivita vazba HDL3, chemoatraktant monocytů, adheze trombocytů, baktericidní efekt prekurzor kalcitoninu, modulace cytokinové sítě transport mědi, ochrana před oxidačním stresem, stimulace angiogeneze vazba volného hemoglobinu při hemolýze, inhibice lyzozomálních enzymů vazba volného hemu při hemolýze, ochrana před oxidačním stresem faktor koagulační kaskády, agregace trombocytů ochrana před proteolýzou, imunomodulační aktivita, SERPIN 12

1 Teoretická část α 1 -antichymotrypsin Inhibitor aktivátoru plasminogenu 1 α 1 -kyselý glykoprotein (orosomukoid) AACT PAI-1 AGP 0,18 0,26 g/l 0,11 0,69 g/l 0,5 1,2 g/l α 2 -makroglobulin AM 1,2 2,4 g/l Složky komplementu C3 a C4 C3, C4 C3 0,75-1,4 C4 0,1-0,34 g/l Upraveno dle [1, s. 16-26 ], doplněno [4, s. 832-863]. ochrana před proteolýzou, imunomodulační aktivita, SERPIN inhibice fibrinolýzy, ovlivnění koagulační kaskády, SERPIN inhibice T-lymfocytů, stimulace fibroblastů, vazba APP a hormonů zasahuje do buněčné proliferace, inhibice NK buněk, fibrinolýzy, tvorby volných radikálů Lýza bakterií, buněk Negativní APP Mezi negativní APP patří albumin, prealbumin a transferin (tabulka 2). Během reakce akutní fáze dochází k poklesu plazmatické hladiny těchto bílkovin. Prozánětlivé cytokiny inhibují jejich tvorbu v játrech. Negativní APP jsou důležité transportní a strukturní proteiny, které se uplatňují především v klidovém období. Příčinou snížení je jejich urychlený katabolizmus a omezení proteosyntetické kapacity jater. Játra tvoří přednostně pozitivní APP, což jsou proteiny imunitních, zánětlivých a reparačních dějů, které jsou nezbytné pro překonání akutní fáze zánětu [1, s. 15; 3, s. 73]. Tabulka 2. Přehled negativních APP Název Referenční meze Hlavní funkce Albumin 35 50 g/l transportní protein, udržuje onkotický tlak Prealbumin 0,19 0,39 g/l transportní protein Transferin 2,2 3,6 g/l transport a metabolismus železa, baktericidní účinky, stimulace buněčné proliferace Převzato a upraveno dle [1, s. 23]. Neutrální APP Jsou to proteiny, jejichž koncentrace se během zánětu nemění. Zda bude hodnota proteinu neutrální, vždy záleží na konkrétní situaci. Neutralita APP je způsobena odlišným efektem IL-6 na jedné straně a IL-1 a TNF-α na straně druhé. Příkladem je 13

1 Teoretická část sérový amyloid P (SAP). IL-6 stimuluje expresi a sekreci SAP, zatímco IL-1 expresi v jaterních buňkách inhibuje. IL-1 tedy blokuje IL-6 a plazmatická hladina se nemění [1, s. 15]. Proteiny akutní fáze se dále mohou dělit do 3 skupin podle rychlosti změn plazmatické koncentrace: Časné APP Pro časné APP je typická velmi rychlá odpověď, nárůst koncentrace je patrný již za 6 až 10 hodin. Patří sem bílkoviny s velmi krátkým biologickým poločasem. Jejich vzestup vrcholí během druhého a třetího dne. Nárůst plazmatické koncentrace může být až 1000násobný oproti fyziologické hodnotě. Patří sem především C-reaktivní protein, sérový amyloid A a prokalcitonin. Středně rychle reagující APP Nástup těchto proteinů je o něco pozvolnější než u časných APP. Koncentrace stoupá za 12 až 16 hodin od počátku zánětu a maxima dosahují 72 až 96 hodin od začátku zánětu. Patří sem např. α 1 -kyselý glykoprotein, α 1 -antitrypsin, haptoglobin a fibrinogen. Vzestup koncentrace je maximálně 2-4násobný. Pozdní APP Plazmatická koncentrace stoupá velmi pozvolna za 48 až 72 hodin, maximální vzestup hladiny je nejčastěji 50 až 100 %. Hlavními zástupci jsou ceruloplazmin a složky komplementu C3 a C4 [8; 6, s. 492]. 1.1.4 Cytokiny Cytokiny jsou zánětlivé mediátory, tvoří velkou skupinu informačních molekul, které mají polypeptidovou strukturu. Jejich působení je převážně autokrinní a parakrinní, ale některé cytokiny s velkou prozánětlivou aktivitou, hlavně IL-1, IL-6 a TNF-α, někdy mohou mít i endokrinní účinek podobně jako hormony. Cytokiny se vážou na specifické buněčné membránové receptory. Zdrojem cytokinů jsou především všechny buňky imunitního systému, ale schopnost tvořit cytokiny mají i somatické buňky, tím je zajištěna meziorgánová komunikace a homeostáza. Jejich účinky se prostřednictvím jednoduchých i složitých zpětných vazeb vzájemně ovlivňují, 14

1 Teoretická část překrývají a doplňují. V současné době je popsáno přes 130 cytokinů, ale jejich celkový počet se odhaduje na 300 [4, s. 550]. Podle své funkce se cytokiny dělí na zánětlivé, protizánětlivé, uplatňující se v buněčné imunitě, v humorální imunitě a dále na interferony a hematopoetické cytokiny [3, s. 159]. Zánětlivé cytokiny jsou hlavním podnětem k syntéze proteinů akutní fáze. IL-6 je hlavním induktorem syntézy pozitivních APP a zároveň inhibitorem negativních APP. IL-1 a TNF-α mají také přímou stimulační aktivitu na játra, ale většinou působí zprostředkovaně indukcí IL-6. Vzájemný vztah cytokinů a proteinů akutní fáze je oboustranný a ovlivňují ho jednoduché nebo složité zpětné vazby. Pro hladký průběh zánětlivé odpovědi je také důležitá přítomnost glukokortikoidů. Glukokortikoidy jsou důležité pro optimální tvorbu APP, mají komplexní charakter a nelze je označit jako inhibiční nebo stimulační [1, s. 41-42]. 1.2 Sérový amyloid A (SAA) Sérový amyloid A je společný název pro rodinu polymorfních apolipoproteinů. SAA patří mezi hlavní APP, je syntetizován především v játrech a jeho koncentrace stoupá působením zánětlivých cytokinů. Je to vazebný protein HDL. Do skupiny SAA řadíme několik strukturně podobných proteinů, které jsou kódovány v multigenním komplexu na chromozomu 11. Exprese proteinů může být jak konstitutivní, tak indukovaná zánětlivými faktory. SAA je stejně senzitivní APP jako CRP, ale přesto není zdaleka tak často využíván v diagnostice neboť jeho úloha byla zjištěna později a teprve nedávno byly vyvinuty metody stanovení pro rutinní praxi [1, s. 61-62; 9]. 1.2.1 Genetická a biochemická charakteristika SAA je skupina proteinů, kódovaných různými geny, které se nacházejí na 11. chromozomu. Na krátkém raménku 11. chromozomu byly identifikovány 4 geny, označené SAA-1 4. Všechny geny mají shodnou strukturu, skládají se ze 4 exonů a 3 intronů, což je typické pro geny apolipoproteinů. SAA-1 a SAA-2 mají stejnou sekvenci nukleotidů a kódují identický protein. Exprese je indukovaná zánětlivými cytokiny a jejich produkt má vlastnosti APP. Produkt SAA-1 a SAA-2 se označuje jako A-SAA. SAA-1 má 3 alelické varianty SAA-1-alfa, -beta, -gama a SAA-2 má 2 alely SAA-2- alfa, -beta. SAA-3 je pseudogen. SAA-4 je zánětlivými stimuly regulován jen 15

1 Teoretická část minimálně. Produktem SAA-4 je konstitutivní SAA označený C-SAA, jeho exprese se velmi liší od A-SAA. Primární struktura C-SAA má jen 55 % homologii s A-SAA [1, s. 62; 9, s. 381-382]. Biochemická struktura není zatím dostatečně prozkoumána. Uspořádání SAA v cirkulaci je monomerické i hexametrické a obě formy jsou v rovnováze. Sekundární struktura je tvořena α-helixy a β-strukturou. Molekulová hmotnost je 11 až 15 kda [1, s. 62-63]. Předpokládaný biologický poločas SAA je asi 1 hodina, ale není úplně přesně znám. SAA je časný marker zánětu, jeho koncentrace stoupá během 6 až 9 hodin od zánětlivého stimulu. Normální plazmatické hladiny jsou 0 až 10 mg/l. Koncentrace SAA v klidovém stadiu nepřesáhne 20 mg/l, ale po výrazném stimulu, jako je např. operace nebo infekce mohou hodnoty stoupat k 400 až 500 mg/l nebo i výše. Syntéza SAA je indukována prozánětlivými cytokiny, hlavně IL-1 a IL-6 [10, s. 81; 1, s. 63]. 1.2.2 Funkce a význam SAA jsou malé apolipoproteiny, které během reakce akutní fáze rychle asociují s třetí frakcí vysoce denzních lipoproteinů (HDL3). Význam vazby mezi SAA a HDL3 není zatím zcela jasný. SAA chrání před oxidačním stresem v místě zánětu, protože inhibuje tvorbu kyslíkových radikálů. Dále působí jako chemoatraktant a regulátor migrace monocytů, neutrofilů a lymfocytů skrz endoteliální stěnu. Na membráně monocytů se nacházejí specifická vazebná místa pro SAA. Dalšími funkcemi SAA jsou adheze trombocytů a přímý baktericidní efekt [1, s. 64-65]. Při akutním zánětu přináší produkce SAA organizmu výhody. U chronického zánětu má kvůli dlouhodobé nadprodukci nepříznivé důsledky. V zánětlivém ložisku dochází k uvolňování IL-1, IL-6 a TNF-α z buněk zánětlivého infiltrátu. Uvolněné cytokiny stimulují játra k produkci SAA. SAA je prekurzor amyloidu A (AA). V lyzozomech dochází k proteolytickému štěpení a degradaci SAA na amyloid A. Amyloid A se ukládá v orgánech a vzniká sekundární amyloidóza. Amyloidóza je onemocnění, které se projevuje hromaděním látek proteinové povahy v extracelulárním prostoru. Sekundární amyloidóza navazuje na chronická zánětlivá onemocnění infekčního i neinfekčního původu. Postihuje především ledviny, játra, slezinu, nadledviny, lymfatické uzliny a střevo. Poškození orgánů může být různé, závažné je především u ledvin, kde hrozí selhání [1, s. 66; 11, s. 59]. Autoři Ryšavá et al. hodnotili vliv SAA na vznik a progresi sekundární amyloidózy ledvin. Bylo vyšetřeno 22 nemocných s histologicky prokázanou 16

1 Teoretická část amyloidózou ledvin a 23 zdravých dobrovolníků. Hladiny SAA dobře korelují s ostatními markery zánětu. SAA je přeměněn na amyloid A působením leukocytárních proteáz a za přispění glykosaminoglykanů. Cílem bylo najít souvislost mezi SAA a rozsahem amyloidových depozit. Mimo jiné byla prokázána jednoznačná korelace mezi SAA a CRP. Hladiny SAA byly výrazně zvýšeny u skupiny pacientů s amyloidózou, nejvyšší hodnoty byly u jedinců s pokročilým onemocněním. Nebyla prokázána přímá souvislost mezi SAA a hladinami TNF-α a IL-6. Je zřejmé, že pro další progresi amyloidózy je potřeba dlouhodobé zvýšení SAA a ne jednorázový výkyv k vysokým hodnotám [12, s. 151-154]. SAA představuje podobně jako CRP rizikový faktor rozvoje aterosklerózy. Ateroskleróza hrozí hlavně jedincům s chronickým zánětem, tedy se zvýšenou koncentrací A-SAA [1, s. 187]. 1.3 C-reaktivní protein (CRP) Název proteinu je odvozen od jeho schopnosti reagovat s C-polysacharidem Streptococcus pneumoniae. Byl objeven v roce 1930 Williamem Tilletem a Thomasem Francesem z Rockefellerovy univerzity. Patří mezi pentraxiny. Je to nejdéle známý a klinicky nejvýznamnější APP. U zdravého člověka je jeho koncentrace velmi nízká, během zánětlivého stimulu však stoupá až na několikanásobek původní hladiny. Během velmi intenzivní zánětlivé reakce může hladina dosáhnout až tisícinásobku. Koncentrace v séru roste za 6 až 9 hodin po začátku zánětu a vrcholí za 1 až 3 dny. Syntéza probíhá v hepatocytech a je vyvolána cytokiny, především interleukinem 6. Nárůst koncentrace vyvolá především bakteriální zánět, u virových zánětů je zvýšení minimální. Stanovení CRP se uplatňuje například pro včasnou diagnostiku a sledování průběhu bakteriální infekce, k odlišení bakteriální a virové infekce, záchyt hnisavých komplikací po operacích, sledování akutního infarktu myokardu, revmatických chorob a maligních onemocnění [1, s. 43-48; 3, s. 71]. CRP je velmi citlivý parametr, ale nespecifický. Neinformuje o tíži onemocnění, ale pouze o přítomnosti infekce. Ke stimulaci sekrece stačí malá zánětlivá reakce, zvyšuje se hlavně při lokalizované infekci, ale i při sepsi, při rejekci štěpu a po operaci [4, s. 535]. 17

1 Teoretická část 1.3.1 Pentraxiny Pentraxiny jsou proteiny s multimerickým a pentagonálním uspořádáním. Můžeme je rozdělit na dvě skupiny. Klasické, tzv. krátké pentraxiny, mezi které se řadí nejdéle známý představitel pentraxinů CRP a sérový amyloid P (SAP). Druhá skupina jsou dlouhé pentraxiny, byly objeveny počínaje rokem 1993 a jejich počet pravděpodobně není definitivní. Zatím je známo 5 dlouhých pentraxinů pentraxin 3 (PTX3), neuronální pentraxin 1 (NP1), neuronální pentraxin 2 (NP2), neuronální pentraxinový receptor (NPR) a polydom. Ve srovnání s krátkými pentraxiny mají molekulovou hmotnost podjednotek přibližně dvojnásobnou, proto byla skupina označena jako dlouhé pentraxiny. Většina dlouhých pentraxinů nepatří mezi APP, jejich syntéza není přísně vázána na játra. Regulace a lokalizace syntézy je variabilní. Název celé skupiny pentraxinů je odvozen od hlavního zástupce CRP, který má pentagonální tvar molekuly. Lidský CRP je pentamer, tvoří ho 5 identických globulárních podjednotek o hmotnosti 25 kda spojených nekovalentní vazbou do jednoho pentamerického cyklu. Další zástupce skupiny krátkých pentraxinů je SAP, který je dekamer. Tvoří ho tedy 10 podjednotek uspořádaných do dvou nekovalentně navázaných pentamerických cyklů. Oba krátké pentraxiny jsou reaktanty akutní fáze, ale jejich koncentrace je závislá na živočišném druhu. CRP je hlavní reaktant akutní fáze u člověka a SAP je hlavní APP u hlodavců. U člověka se SAP při reakci akutní fáze chová jako neutrální APP. CRP a SAP jsou součástí nespecifické obranné reakce organizmu, váží se na fragmenty nukleárních struktur, které se uvolňují z poškozených buněk při zánětu. Každá z podjednotek CRP může vázat 2 atomy Ca 2+. CRP za přítomnosti kalciových iontů váže široké spektrum ligandů, jako např. DNA a chromatin, imunokomplexy, různé sacharidy a složky komplementu [1, s. 17-61; 13, s. 100-101]. 1.3.2 Genetická a biochemická charakteristika Gen pro CPR je uložen na 1. chromozomu v regionu q2.1. Gen je v těsné vazbě s genem pro SAP a ve stejném regionu se nachází i pseudogen CRP (CRPP1). Gen CRP je tvořen dvěma exony, které jsou odděleny intronem. První exon kóduje úvodní sekvenci a první 2 aminokyseliny proteinu. Druhý exon kóduje dalších 204 aminokyselin [1, s. 45-46]. Jak již bylo řečeno CRP je pentamer s molekulovou hmotností 120 kda. Biologický poločas CRP je kolem 19 hodin [10, s. 79]. 18

1 Teoretická část 1.3.3 Funkce a význam CRP působí jako opsonizující faktor pro fagocytózu bakterii, parazitů a imunokomplexů. Aktivuje klasickou kaskádu komplementu. Navíc CRP váže chromatin, histony a malé částice jaderných nukleoproteinů [1, s. 48-49]. Úplný rozsah všech biologických funkcí CRP není dosud objasněn. V následujících bodech jsou shrnuty a popsány hlavní známé funkce CRP: Opsonizace bakterií a buněčných složek CPR je schopen vázat poškozené a nekrotické části buněk. CRP se váže na fosfatidylcholin v bakteriální stěně a na buněčných membránách kalcium-dependentní vazbou. Na každou podjednotku CRP se naváží 2 atomy Ca 2+ a dojde ke změně alosterické konfigurace CRP. V této podobě může dojít k vazbě na cílové struktury, nejčastěji na nukleární chromatin a membrány poškozených buněk. Nedochází však k vazbě na zdravé buňky [1, s. 49]. Aktivace komplementu Komplement je asi 30 sérových a membránových proteinů, z nichž hlavní složkou je 9 sérových proteinů, které označujeme C1 C9. Po reakci na různé podněty dochází ke kaskádovité aktivaci jednotlivých složek. Komplement se aktivuje třemi cestami alternativní, lektinovou a klasickou cestou. CRP je aktivátor klasické cesty komplementové kaskády. CRP se váže na některé mikroorganizmy a poté je schopen vázat a aktivovat protein C1 [5, s. 49-52]. Přímá imunomodulační aktivita Na membráně neutrofilů, monocytů a NK buněk (přirozených zabíječů) jsou specifické receptory pro CRP. Spolu s dalšími faktory dochází k stimulaci nebo inhibici jejich fagocytární aktivity a dalších funkcí [1, s. 50]. CRP také přes aktivaci svých receptorů moduluje efekty prozánětlivých cytokinů [13, s. 102]. Další funkce Účinky CRP na funkci trombocytů a lymfocytů nejsou zatím zcela objasněny. CRP se však uplatňuje při adhezi a agregaci trombocytů. Podle některých studií má CRP také přímou antioxidační aktivitu. Přesto však hlavní funkcí CRP zůstává eliminace exogenních a endogenních patologických struktur a následná aktivace komplementu [13, s. 102]. CRP je v séru zdravých lidí přítomen v nízkých koncentracích, což je do 5 mg/l. Během zánětlivého procesu koncentrace mnohonásobně stoupají. CRP má velmi krátký 19

1 Teoretická část biologický poločas, proto koncentrace klesají rychle, asi 50 % za den. Tu skutečnost je možné využít při monitorování antibiotické léčby. Hladina CRP se může zvyšovat i fyziologicky, např. u novorozenců (3. den až 15 mg/l) a kojenců (do 10 mg/l), dále v těhotenství (do 20 mg/l). Zvýšení je možné i u kuřáků a po nadměrné fyzické zátěži. CRP má významnou cirkadiánní variabilitu. Koncentrace může stoupat s věkem, dále hladina souvisí s vysokým krevním tlakem, konzumací alkoholu a kávy, nízkou fyzickou aktivitou, únavou, zvýšenou hladinou triacylglycerolů, inzulinovou rezistencí a diabetem [10, s. 79]. V současné době se o CRP hovoří v souvislosti s aterosklerózou a cévními komplikacemi. V kardiovaskulární medicíně se stanovuje vysoce senzitivní CRP (hs- CRP). Stanovení CRP vysoce senzitivní metodou má nižší detekční limit a umožňuje přesné stanovení v nižších koncentracích. U jedinců s hodnotami v horní části normy (nad 2,4 mg/l) je vyšší riziko koronární příhody, cévní mozkové příhody a ischemické choroby dolních končetin než u zdravých jedinců s hodnotami pod 1 mg/l. CRP může být proteinem sledovaným v rámci prevence aterosklerózy. Není jisté, zda je CRP jen markerem aterosklerózy nebo jestli se také podílí na vzniku aterosklerózy a aterosklerotických komplikací [14, s. 329-331]. 1.4 Prokalcitonin (PCT) Prokalcitonin patří mezi nové ukazatele zánětu. Mnoho let byl považován jen za prekurzor hormonu kalcitoninu, až v roce 1993 byl prokázán jeho význam jako zánětlivého mediátoru. Na prokalcitonin bylo po roce 1993 a samozřejmě i dnes zaměřeno mnoho experimentálních a klinických studií, ale přesto je stále mnoho nejasností ohledně jeho metabolizmu a fyziologického významu. U zdravého člověka je produkován C-buňkami štítné žlázy a následně přeměněn na aktivní hormon kalcitonin. Při zánětu se produkce PCT přesouvá hlavně do jater. Byly prokázány vysoké plazmatické hladiny především u bakteriální a mykotické infekce. U lokálních bakteriálních infekcí a u virových infekcí se PCT významně nezvyšuje. Vysoké koncentrace najdeme u akutních bakteriálních infekcí a při sepsi. Prokalcitonin se v diagnostice uplatňuje jako senzitivní a specifický ukazatel bakteriální infekce. Plazmatická hladina PCT stoupá podle typu a rozsahu zánětu [1, s. 241; 3, s. 73]. Syntéza prokalcitoninu během zánětu není soustředěna v C-buňkách štítné žlázy, protože při zánětu se hladina zvyšuje i u jedinců s tyreoidektomií. Řadu let nebylo jasné, 20

1 Teoretická část kde dochází k syntéze zánětlivého prokalcitoninu. Dnes už víme, že hlavním zdrojem zánětlivého prokalcitoninu jsou játra, ale i další tkáně. Tvorba PCT byla prokázána v neuroendokrinních buňkách střeva a plic, v monocytech a makrofázích. Dále bylo potvrzeno, že k syntéze dochází i v řadě dalších buněčných typů. Regulace syntézy zánětlivého prokalcitoninu je zcela odlišná od regulace tyreoidálního PCT. Zásadní vliv na syntézu zánětlivého PCT má bakteriální endotoxin (LPS) a prozánětlivé cytokiny, hlavně TNF-α a IL-1. Bakteriální endotoxin je lipopolysacharid, je součástí buněčné stěny bakterií a uvolňuje se do okolí po rozpadu bakterie. LPS je hlavním stimulem pro syntézu PCT [15, s. 23-29]. V tabulce 3 jsou fyziologické vlastnosti zánětlivého PCT a pro srovnání jsou uvedeny vlastnosti PCT tvořeného C-buňkami štítné žlázy a hormonu kalcitoninu. Tabulka 3. Vlastnosti zánětlivého PCT a srovnání s PCT tvořeným C-buňkami štítné žlázy a kalcitoninem Zánětlivý PCT PCT tvořený C-buňkami Kalcitonin Gen CALC-I? CALC-I Zdroj hepatocyty aj. C buňky štítné žlázy Dominantní regulace LPS, TNF-α, IL-1 hypokalcémie M r 13 000 13 000 3500 Délka řetězce 116 (114) AMK 116 AMK 32 AMK Poločas v cirkulaci 25 30 hodin není uvolňován do oběhu 4 5 minut Fyziologický modulace hormonální kalciotropní význam cytokinové sítě? prekurzor hormon Převzato z [15, s. 30]. 1.4.1 Genetická a biochemická charakteristika Prokalcitonin vytvořený v C-buňkách štítné žlázy je tvořen peptidovým řetězcem o 116 aminokyselinách, ale zánětlivý PCT cirkulující v krvi obsahuje jen 114 aminokyselin. Dochází totiž k odštěpení dvou AMK. Prokalcitonin má molekulovou hmotnost 13 kda. Prekurzorem prokalcitoninu je pre-prokalcitonin o 141 aminokyselinách, po odštěpení signálního peptidu o 25 AMK vzniká prokalcitonin. 21

1 Teoretická část Z prokalcitoninu intracelulárním štěpením vznikají 3 molekuly. Dojde k odstranění N- terminálního úseku (N-prokalcitonin) o 57 AMK a C-terminálního fragmentu (katakalcinu) o 21 AMK za vzniku hormonu kalcitoninu. Kalcitonin má 32 AMK a sekvence odpovídá 60. až 91. pozici řetězce PCT. Struktura zánětlivého prokalcitoninu a PCT tvořeného C-buňkami je identická. Za normálních okolností se prokalcitonin tvoří v C-buňkách štítné žlázy a skoro všechen je přeměněn v endoplazmatickém retikulu C-buněk na funkční hormon kalcitonin. Proto je jeho koncentrace u zdravého člověka neměřitelná nebo velmi nízká. Nedochází totiž k uvolnění ze štítné žlázy do oběhu [15, s. 17-19; 10, s. 81]. Gen zodpovědný za syntézu zánětlivého PCT nebyl zatím jasně definován a dosavadní úvahy jsou pouze spekulativní. Většina vědců se nicméně domnívá, že zánětlivý PCT je kódován stejným genem jako prekurzor kalcitoninu v C-buňkách štítné žlázy [15, s. 20]. Gen se nachází na krátkém raménku 11. chromozomu a označuje se jako CALC-I. V sousedství tohoto genu je další trojice genů (CALC-II, CALC-III a CALC-IV). Je možné, že mají společný evoluční původ a uvažuje se i o existenci dalších neznámých genů této skupiny, které by mohli vyvolávat syntézu PCT během zánětu [15, s. 20-22]. 1.4.2 Uplatnění v diagnostice a interpretace nálezů PCT se již řadu let využívá k diagnostice zánětlivých stavů a porovnává se s dalšími užívanými zánětlivými markery. Vyšetření PCT se uplatňuje v diferenciální diagnostice zánětlivých onemocnění. Slouží k odlišení bakteriální a nebakteriální infekce. Uplatnění má také u monitorování kriticky nemocných pacientů. Vysoké a dále rostoucí hladiny PCT svědčí pro bakteriální komplikace a špatnou prognózu pro pacienta. Pokles hladiny PCT naopak znamená ústup infekce a příznivou prognózu. Dále se používá při sledování léčby a průběhu bakteriální infekce a v diagnostice bakteriálních infekcí u imunosuprimovaných pacientů [15, s. 84-88]. U zdravého jedince je koncentrace v plazmě pod 0,5 µg/l. Mírně zvýšené hodnoty jsou od 0,5 až 2 µg/l, od 3 µg/l se jedná o vysoké hodnoty a velmi vysoké jsou, pokud dosáhnou 30 až 300 µg/l. U velmi těžkých bakteriálních infekcí mohou hladiny PCT dosáhnout až na 1000 µg/l. Podle plazmatické hladiny PCT můžeme rozeznat systémové a lokalizované infekce. Pokud se infekce týká jen jednoho orgánu a nejde o systémový zánět, pak by hladina PCT neměla přesáhnout 5 µg/l. Při sepsi bývají 22

1 Teoretická část hodnoty nad 10 µg/l, ale mohou být i několikanásobně vyšší [4, s. 535]. Nejčastější interpretace nálezů PCT je uvedena v tabulce 4. Tabulka 4. Interpretace nálezů PCT PCT (µg/l) Hodnocení Vybrané klinické stavy 0 0,5 normální hodnoty zdravé osoby 0,5-2 mírné zvýšení lokalizovaný infekční zánět, chronický zánět, virózy (hepatitis A, B) 2-10 vysoké hodnoty systémová bakteriální infekce, intenzivní SIRS nebakteriálního původu 10 a více velmi vysoké hodnoty těžká sepse, multiorgánové selhání Převzato a upraveno dle [15, s. 89]. V následující části je shrnuto chování PCT v různých patologických i fyziologických situacích a zvýšení PCT z infekčních a neinfekčních příčin. Sepse a infekce Hladina PCT stoupá u generalizované bakteriální, parazitární i plísňové infekce se systémovými projevy. K vzestupu hladiny naopak nedochází u virových infekcí a zánětlivých reakcí neinfekčního původu. Nejvyšší hodnoty nacházíme u těžké sepse. Mírně zvýšený je PCT u lokalizovaných bakteriálních infekcí, proto PCT není markerem lokalizované infekce. Vysoké hodnoty PCT jsou i u dětí s těžkými infekcemi a u novorozenců je PCT indikátorem časné i pozdní sepse. PCT se také uplatňuje při sledování léčby antibiotiky, pokud je léčba úspěšná, dojde k významnému poklesu PCT. Je třeba pamatovat na to, že nízké hladiny PCT nevylučují infekci a snížením hladiny u těžké infekce nedojde k úplnému potlačení infekce. U těchto stavů se nesmí zanedbat léčba antibiotiky [4, s. 535-536]. Pooperační období Prokalcitonin je součástí systémové imunitní odpovědi na operační trauma. Ke zvýšení hodnot PCT někdy dochází i u sterilních a mimobřišních výkonů, což dokazuje, že nejen bakteriální endotoxin vyvolává zvýšenou syntézu PCT. Přesné příčiny vzestupu hladiny PCT v pooperační době nejsou zatím jasné. Míra zvýšení hladiny PCT závisí na typu a rozsahu operace. Zvýšení PCT pozorujeme především u větších operací (např.: břišní a hrudní zákroky, operace v retroperitoneu a v mediastinu), hodnoty však 23

1 Teoretická část většinou nepřekročí 2 µg/l. Pokud je koncentrace vyšší, může jít o nástup infekčních komplikací. Přesáhnou-li hodnoty 10 µg/l, není to obvyklé a může se jednat o infekci. Hladiny se zvyšují nejčastěji 1. až 2. den po zákroku. U menších operací (např.: drobné extraabdominální výkony, laparoskopické zákroky) jsou hladiny PCT většinou v normálu. U pacientů s vysokým rizikem sepse je doporučeno denně stanovit koncentraci PCT, lze tím předejít infekčním komplikacím a vývoji sepse [4, s. 536; 15, s. 55-62]. Transplantace Infekční komplikace ohrožují život zhruba 25 % pacientů po transplantaci srdce, plic nebo jater. Ještě více (kolem 30 %) výkonů je komplikováno akutní rejekcí transplantovaného orgánu [15, s. 71]. Normální imunitní odpověď po podání štěpu je potlačena řadou léků (imunosupresivní léčba, kortikoidy, antibiotika). Infekce musí být včas odlišena od akutní rejekce štěpu. Plazmatická koncentrace PCT se mění podobně jako u rozsáhlé operace. Pokud nedojde ke komplikaci, plazmatické hladiny dosahují maxima 1. až 2. den po transplantaci. Akutní rejekce transplantovaného orgánu nemá žádný vliv na hladinu PCT, ale systémová bakteriální infekce vede k významnému vzestupu PCT i u imunosuprimovaných pacientů [15, s. 71-74]. U novorozenců Bezprostředně po narození a několik dní po porodu bývá hladina PCT zvýšená. 24 hodin po porodu dosáhne hladina maxima (0,5 21 µg/l), během 48 hodin klesne pod hodnotu normální pro dospělou populaci, což je 0,5 µg/l. Význam fyziologického vzestupu PCT po narození není zatím objasněn. Přesto i u novorozenců je prokalcitonin senzitivním markerem bakteriální infekce, je však potřeba přihlédnout k této odchylce od normálních hodnot. Pokud dojde k vzestupu nad fyziologické zvýšení, je třeba zvážit výskyt novorozenecké sepse [4, s. 536; 15, s. 78]. Popáleninové trauma Při popáleninách se zvyšuje hladina PCT a zvýšení je úměrné rozsahu popálení a stupni poškození tkáně. PCT se zvyšuje brzy po popáleninovém traumatu, již do 8 hodin a přetrvává několik dní [4, s. 536]. Nehematologické malignity Některá maligní onemocnění vedou ke zvýšení prokalcitoninu, jedná se hlavně o medulární karcinom štítné žlázy nebo malobuněčný karcinom plic. U obou onemocnění jsou výchozí buňky příbuzné a zachovávají si schopnost produkovat PCT. U zdravého člověka je hormonální prekurzor prokalcitonin přeměněn proteolytickým 24

1 Teoretická část štěpením. U malignit, které pocházejí z C-buněk štítné žlázy a z neuroendokrinních buněk plic je zachována produkce PCT, ale nedochází k proteolytické degradaci [15, s.75-76]. 1.4.3 Kalcitonin Jelikož je PCT prekurzorem hormonu kalcitoninu, je na místě shrnout pár základních informací o kalcitoninu. Kalcitonin je peptidový hormon produkovaný parafolikulárními C-buňkami štítné žlázy. Skládá se z 32 aminokyselin a má relativní molekulovou hmotnost 3500. Kalcitonin vzniká intracelulární proteolýzou prokalcitoninu v endoplazmatickém retikulu C-buněk štítné žlázy. Hlavní funkcí kalcitoninu je snižovat hladinu sérového kalcia. Je antagonistou parathormonu produkovaného příštítnými tělísky. Stimulem pro jeho sekreci je zvýšená koncentrace kalcia. Kalcitonin se využívá i jako tumorový marker k diagnostice a monitorování medulárního karcinomu štítné žlázy [3, s. 107; 4, s. 197]. 1.5 Srovnání SAA, CRP a PCT Společným znakem sérového amyloidu A, C-reaktivního proteinu i prokalcitoninu je velmi nízká nebo zanedbatelná plazmatická hladina v klidových stavech, ale při infekčním nebo neinfekčním zánětu dochází velmi rychle k výrazné indukci syntézy. Plazmatická koncentrace může stoupat 100x až 1000x [1, s. 224]. CRP a SAA jsou považovány za nejcitlivější reaktanty akutní fáze. Hladina SAA v séru se zvyšuje i u virových infekcí více než CRP. CRP a SAA však nejsou specifické parametry, naopak PCT je specifický ukazatel sepse, syndromu systémové zánětlivé odpovědi (SIRS) a také syndromu multiorgánového selhání (MODS). U virových infekcí, autoimunitních poruch a malignit se PCT zvyšuje jen minimálně nebo vůbec [16, s. 469-470]. Při stanovení zánětlivých markerů je nejdůležitější zvolit vhodný marker nebo jejich kombinaci, tak aby co nejvíce vypovídaly o stavu pacienta. V tabulce 5 jsou pro porovnání uvedeny některé vlastnosti zánětlivých markerů SAA, CRP a PCT. 25

1 Teoretická část Tabulka 5. Vlastnosti SAA, CRP a PCT Sérový amyloid C-reaktivní Jednotlivé parametry Prokalcitonin A protein Zkratka SAA CRP PCT Referenční meze 0-10 mg/l 0 5 mg/l 0 0,5 μg/l Relativní molekulová 11 15 kda 120 kda 13 kda hmotnost Biologický poločas 1 hodina 19 hodin 25 30 hodin Lokalizace genů Délka řetězce (AMK) 104-112 AMK 206 AMK 116 (114) AMK Vzestup hladiny za 6 9 hodin za 6 9 hodin za 6 8 hodin Dominantní regulace IL-1, IL-6 IL-6 LPS, TNF-α, IL-1 krátké raménko dlouhé raménko krátké raménko 11. chromozomu 1. chromozomu 11. chromozomu 1.6 Metody stanovení Stanovované zánětlivé markery by ideálně měly splňovat několik ekonomických i diagnostických požadavků. Markery vhodné pro rutinní stanovení by měly mít vysokou senzitivitu a specificitu, možnost statimového stanovení, dále snadnou interpretaci výsledků a v neposlední řadě by měly být cenově dostupné. Je velmi těžké splnit všechny požadované parametry. Proto metody stanovení zánětlivých markerů procházejí neustálým vývojem a vylepšují se stávající metody, aby markery splňovaly diagnostická i ekonomická kritéria a zároveň byla zajištěna co nejlepší péče pacientům [1, s. 245-248]. Proteiny akutní fáze jsou nejčastěji stanovovány pomocí turbidimetrie a nefelometrie. Jsou to optické zákalové metody založené na rozptylu záření heterogenními částicemi. Měříme stupeň zákalu neboli turbiditu. Na heterogenní částice dopadá záření o určité vlnové délce, dochází k odrazu a lomu záření a částečně k absorpci záření. Vzniklé sekundární záření vychází z roztoku všemi směry. Tento jev byl popsán J. Tyndallem, proto rozptyl záření označujeme jako Tyndallův efekt a rozptýlené světlo jako tzv. Tyndallovo světlo [17, s. 76]. 26

1 Teoretická část 1.6.1 Turbidimetrie a nefelometrie Imunochemické metody V klinické biochemii je mnoho metod, které jsou zaměřené na měření stupně zákalu turbidity. Nejvýznamnější z nich jsou imunochemické metody [18]. Imunoturbidimetrie a imunonefelometrie jsou běžné analytické metody, které jsou kombinací imunologických a biochemických metod. Základem je reakce antigenu se specifickou protilátkou za vzniku imunokomplexu. Sledujeme koncentraci příslušného antigenu, která je úměrná hustotě zákalu nebo rychlosti tvorby zákalu. V současnosti tyto metody ovládají stanovení sérových bílkovin v rutinních laboratořích [19, s. 45]. Turbidimetrie Turbidimetrie je optická metoda založená na měření procházejícího světla zeslabeného rozptylem na částicích. Při měření je obtížné získat dostatečně stálou reakční směs, proto se používají ochranné koloidy, nejčastěji polyethylenglykol (PEG). Absorbance primárního toku záření po průchodu rozptylujícím prostředím, což je koloidní roztok nebo roztok zakalený sraženinou se měří ve směru dopadajícího záření absorpčními fotometry nebo spektrofotometry [20, s. 167; 21, s. 272-273]. Fotometrická citlivost je nepřímo úměrná vlnové délce. Proto se např. specifické proteiny často stanovují při nejkratší vlnové délce dosažitelné standardním fotometrem, tj. při 340 nm v blízké UV oblasti. Do střední UV oblasti nelze dál postupovat, i kdyby to spektrofotometr technicky umožňoval, neboť se začne projevovat absorpce nezreagovaných bílkovin, která může hrubě zkreslit měření zákalu imunokomplexu [22, s. 7]. Nefelometrie Nefelometrie je metoda založená na měření intenzity difusně rozptýleného světla na dispergovaných částicích. Rozptýlené světlo, které vychází z roztoku všemi směry, měříme pod jiným úhlem než je úhel dopadu paprsků. Pro toto měření se používá buď nefelometrický nástavec k fotometru nebo speciální nefelometr, který bývá plně automatizován [21, s. 273]. Používají se laserové a konvenční nefelometry. Laserový nefelometr je zdrojem monochromatického záření, které je velmi intenzivní a má vysoký stupeň směrovosti. Pro měření se používají helium-neonové nebo argonové lasery. Světlo rozptýlené po průchodu laserového paprsku kyvetou je detekováno 27

1 Teoretická část detektorem, který je umístěn pod úhlem 5 až 35 nebo 70 až 90. Zdrojem záření u konvenčních nefelometrů je halogenová žárovka nebo xenonová výbojka. Tyto světelné zdroje vydávají polychromatické záření, proto se používají interferenční filtry. Stupeň směrovosti u konvenčních nefelometrů je nízký, proto je detektor nastaven pod úhlem 70 až 90 [18]. 1.6.2 Stanovení SAA CRP a SAA jsou nejcitlivější ukazatele pro hodnocení zánětu, ale přesto není SAA zdaleka tak často vyšetřován jako CRP. Je to způsobeno dlouho neexistující vhodnou metodou pro rutinní praxi a problematická je také produkce vhodné protilátky proti SAA. To může být způsobeno hydrofobní povahou SAA. Vývoj nových metod však stanovení SAA v klinických laboratořích usnadňuje. SAA lze stanovit pomocí různých metod, např. radioimunoanalýza, radiální imunodifúze a ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Všechny metody jsou však vhodné spíše pro výzkumné laboratoře a ne pro rutinní provoz. Pro stanovení SAA v rutinních laboratořích bylo nutné zavést automatizovanou a rychlou metodu, která by umožňovala i statimová vyšetření. Proto byla vyvinuta imunochemická metoda stanovení pomocí latexové aglutinace. Existuje i automatizovaná metoda ELISA pro stanovení SAA, která je velmi citlivá, ale nemá široké využití [9, s. 381-384]. Stanovení imunonefelometrickou metodou Tato metoda byla použita ke stanovení SAA u všech vzorků této bakalářské práce. Stanovení je založeno na principu imunonefelometrie. Přesný princip a podrobný popis metody viz experimentální část. 1.6.3 Stanovení CRP C-reaktivní protein je rutinně nejpoužívanější a nejčastěji stanovovaný protein akutní fáze. V naprosté většině případů se používá jako marker zánětu a slouží k posouzení odpovědi organismu na léčbu, i když význam a funkce CRP v lidském těle jsou širší [14, s. 330]. Následují příklady metod, kterými lze CRP stanovit. Stanovení imunoturbidimetrickou metodou Touto metodou na principu imunoturbidimetrie byla stanovana hladina CRP u všech vzorků v této bakalářské práci. Metoda je založena na reakci protilátky proti lidskému 28