APO seminář 5: OPTICKÉ METODY v APO Princip: fyzikální metody založené na interakci vzorku s elektromagnetickým zářením nebo na sledování vyzařování elektromagnetického záření vzorkem nespektrální metody sledujeme změny vlastností záření (změny rychlosti záření, otáčení roviny polarizovaného světla, rozptyl záření) např.: refraktometrie, interferometrie, polarimetrie, nefelometrie, turbidimetrie spektrální metody založeny na výměně energie mezi látkou a zářením (emisní a absorpční metody)
ELEKTROMAGNETICKÉ SPEKTRUM Frekvence [Hz] 1 Hz 1 khz 1 MHz 1 GHz Mikrovlny Rentgenové paprsky AM Rozhlasové vlny FM, TV Viditelné světlo IČ UV Gama paprsky 1 km 1 m 1 cm 1 µm 1 nm Vlnová délka [m]
ELEKTROMAGNETICKÉ SPEKTRUM 20 nm 20-200 nm 200-380 nm RTG + - záření vzdálená (vakuová) UV UV 380-780 nm VID 0,78-2,5 m Blízká IČ 2,5-25 m Střední IČ 25-50 m Dlouhovlnná IČ 0,05 mm Rádiové mikrovlny* přechody elektronů vibrace, rotace (funkční skupiny) Vakuová UV oblast - v oblasti pod 200 nm je záření absorbováno vzdušným kyslíkem - tato oblast je přístupná pouze ve vakuu *Užší dělení: Mikrovlny, ultrakrátké rádiové vlny, krátké rádiové vlny
POLARIMETRIE v APO Princip: metoda založená na měření úhlu otočení roviny polarizovaného světla opticky aktivními látkami a jejich roztoky opticky aktivní látky jejich molekuly nelze prostým otáčením ztotožnit s jejich zrcadlovým obrazem nejčastější příčina asymetrie: přítomnost asymetrického uhlíku opticky aktivní látky stáčí rovinu polarizovaného světla vpravo (po směru hod. ručiček) pravotočivé (+) vlevo (proti směru hod. ručiček) levotočivé (-)
POLARIZACE SVĚTLA Normální světelné vlnění (nepolarizované světlo) vektory elektrického pole a k němu kolmého magnetického pole ve všech rovinách protínajících se ve směru šíření Kruhově (cirkulárně) polarizované světlo kmitá tak, že elektrický a magnetický vektor koná rotační pohyb ve směru paprsku. (stejné amplitudy, 90 posun fází) Lineárně (rovinně) polarizované světlo kmitá v jedné rovině proložené paprskem (elektrická složka v jedné rovině, magnetická složka v druhé, na ni kolmé rovině) Elipticky polarizované světlo kmitá tak, že elektrický a magnetický vektor koná rotační pohyb ve směru paprsku. (rozdílné amplitudy, nebo jiný než 90 posun fází) 5
Praktická realizace polarizace světla pro měření Normální světelné vlnění (nepolarizované světlo) se po průchodu NICOLovým HRANOLem (Islandský dvojlomný vápenec) rozdělí na 2 polarizované paprsky: řádný: kolmý k polarizační rovině (odfiltruje se začerněným obalem hranolu) mimořádný: rovnoběžný s polarizační rovinou (používá se k měření) tj. získá se paprsek světla stejné vlnové délky, ale polarizovaný v jedné rovině 6
PRINCIP POLARIMETRU I Směr šíření světla Zdroj světla Normální (nepolarizované) světlo Polarizátor Polarizované světlo Trubice obsahující roztok s chirální sloučeninou Polarizované světlo (pootočené) Analyzátor Detektor (popř. oko) Otočí-li opticky aktivní látka v kyvetě rovinu polarizovaného světla o určitý úhel, na detektor začne dopadat světlo. Pokud otočíme o stejný úhel analyzátorem, opět bude intenzita světla prošlého k detektoru nulová. Signál z detektoru je vyhodnocován a servomotor otáčí analyzátorem, dokud není nalezeno minimum intenzity 7
PRINCIP POLARIMETRU II Část polarizovaného světla, která projde analyzátorem, je určena úhlem, který svírá polarizační rovina analyzátoru s polarizační rovinou polarizátoru rovnoběžné svírají úhel 0, 180, 360 - světlo projde analyzátorem v plné intenzitě kolmé svírají úhel 90, 270 - analyzátor nepropouští žádné světlo úhel < 90 analyzátor propouští část světla z polarizátoru 8
Stupnice polarimetru kruhové stupně sacharimetrické stupně ( S) stupně Ventzkeho ( V) 1 = 2,8885 S = 2,8854 V 1 V = 0,3466 = 1,001 S 1 S = 0,3462 = 0,999 V 9
Optická otáčivost parametry měření Faktory ovlivňující optickou otáčivost: asymetrie struktury molekuly vlnová délka světla teplota (roztoku) počet molekul s nimiž polarizované světlo vstupuje do interakce - koncentrace roztoku - tloušťka vrstvy (délka kyvety) chemická povaha rozpouštědla ph a čas (změny) 10
Zajištění potřebné optické kvality vzorku eliminace rušivých látek ČIŘENÍ A ODBARVOVÁNÍ (CUKERNÝCH EXTRAKTŮ) Zákal roztoků zvyšuje chyby Zabarvení roztoku zcela znemožňuje měření Neutrální octan olovnatý čiření neutrálních roztoků odstranění opticky aktivních organických kyselin (odstranění bílkovin není dokonalé) Zásaditý octan olovnatý čiření neutrálních a mírně alkalických roztoků odstranění opticky aktivních organických kyselin a bílkovin Čiření podle Carreze síran zinečnatý a kyanoželeznatan draselný čiření v kyselém prostředí odstranění bílkovin, méně slizových látek 11
POLARIMETRIE Úhel stočení vyjadřuje optickou otáčivost roztoku opticky aktivní látky Měrná otáčivost (specifická rotace) úhel stočení pro = 1 dm, c w = 1 g.ml 1, t = 20 C, = vlnová délka dubletu spektrálních čar sodíku (D: 589,0 a 589,6 nm) 12
POLARIMETRIE Pravidlo o aditivitě roztok dvou opticky aktivních látek A a B o hmotnostní koncentraci c wa a c wb vykazuje otáčivost, která je dána součtem příspěvků obou opticky aktivních složek 20 D ( A) wa 20 D ( B) c c wb využití: stanovení sacharózy vedle jiné opticky aktivní látky dvojím měřením (před a po hydrolýze sacharózy, která je doprovázena změnou optické otáčivosti inverzí) 13
POLARIMETRIE Specifická rotace vybraných sacharidů Látka 20 D Látka 20 D dextrin + 194,8 maltóza 137,5 D-fruktóza 93,78 rafinóza + 123,01 D-galaktóza + 80,47 sacharóza + 66,53 D-glukóza + 52,74 škrob + 196,4 invertní cukr 20,59 xylóza + 196,4 laktóza + 55,3 1 g/ml FRU -93,78 1 g/ml GLU +52,74 (2 g/ml) -41,04 : 2 (1 g/ml) = -20,52 INVERT
APLIKACE POLARIMETRIE Stanovení koncentrace jedné opticky aktivní látky jediným měřením optické otáčivosti roztoku lze určit koncentraci c w 20 D 20 D 15
Příklad č. 1: Polarimetrické stanovení sacharózy Určete koncentraci roztoku sacharózy, u kterého byla měřením ve 2 dm kyvetě zjištěna otáčivost 17,31 (= 50 S).
APLIKACE POLARIMETRIE V ANALÝZE POTRAVIN Stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem měří se optická otáčivost roztoku před a po inverzi sacharózy kyselinou chlorovodíkovou. hydrolýza sacharózy probíhá dle rovnice H C12H 22O11H2O C6H 12O6(glukóza) C6H 12O6(fruktóza) M r 342 18 180 180 +66,53 +52,74 93,78 20 D 20 D 360 invertní cukr 20,59 M r
APLIKACE POLARIMETRIE V ANALÝZE POTRAVIN Stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem pro hodnotu otáčivosti před inverzí platí 1 20 D ( S) ws 20 D ( M) c c wm pro hodnotu otáčivosti po inverzi (hydrolýze) sacharózy platí: 2 c wi 360 c 342 20 D ( I) ws c wi 20 D ( M) c wm S sacharóza M monosacharid I invertní cukr
APLIKACE POLARIMETRIE V ANALÝZE POTRAVIN Stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem získáme soustavu dvou rovnic 1 20 D ( S) c ws 20 D ( M) c wm 2 20 20 c c D ( I) 360 342 S sacharóza M monosacharid I invertní cukr ws D ( M) wm
Příklad č. 2: Polarimetrické stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem 20 ml vzorku (S, G) 100 ml, α 1 = 11,1 20 ml vzorku inverze (I, G) 100 ml, α 2 = 4,1
Příklad č. 2: Polarimetrické stanovení sacharózy ve směsi s monosacharidem c ws a dosadit do α 2