Mendelova univerzita v Brně Institut celoživotního vzdělávání FUSARIÓZY KUKUŘICE ZÁVĚREČNÁ PRÁCE Studijní program: Rostlinolékařství

Mendelova univerzita v Brně Institut celoživotního vzdělávání FUSARIÓZY KUKUŘICE ZÁVĚREČNÁ PRÁCE Studijní program: Rostlinolékařství Vedoucí: doc. Ing. Ivana Šafránková, Ph.D. Autor: Ing. Josef Svoboda, Ph.D. Brno 2013 9

10

11

Prohlášení o původu práce Prohlašuji, že jsem závěrečnou práci na téma Fusariózy kukuřice vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém seznamu literatury. V Brně dne 29. května 2013 Podpis studenta 12

Poděkování Rád bych touto cestou poděkoval doc. Ing. Ivaně Šafránkové, Ph.D. za odborné vedení po dobu studia a za cenné rady a připomínky při řešení závěrečné práce. Velké díky patří i mojí rodině za podporu, kterou mi dávali po dobu celého mého studia a poděkování patří rovněž kolegům ze zaměstnání. 13

OBSAH ABSTRACT... 7 POUŽITÉ ZKRATKY... 8 1 ÚVOD... 10 2 CÍL PRÁCE... 11 3 LITERÁRNÍ PŘEHLED... 12 3.1 Kukuřice... 12 3.2 Rod Fusarium... 12 3.2.1 Historie r. Fusarium... 12 3.2.2 Charakteristika rodu Fusarium... 12 3.2.3 Výskyt druhů rodu Fusarium na kukuřici... 13 3.3 Mykotoxigenní druhy fusarií na kukuřici... 14 3.3.1 Gibberella avenacea... 14 3.3.2 Fusarium equiseti... 15 3.3.3 Fusarium graminearum... 16 3.3.4 Fusarium oxysporum... 17 3.3.5 Fusarium culmorum... 17 3.3.6 Fusarium poae... 18 3.3.7 Fusarium proliferatum... 19 3.3.7 Fusarium semitectum... 20 3.3.8 Fusarium solani... 20 3.3.9 Fusarium sporotrichioides... 21 3.3.10 Fusarium subglutinans... 22 3.4 Mykotoxiny... 23 3.5 Mykotoxiny produkované druhy r. Fusarium... 24 3.5.1 Trichotheceny... 24 3.5.1.1 Deoxynivalenol... 25 3.5.1.2 T-2 toxin... 27 3.5.2 Fumonisiny... 28 3.5.2.1 Fumonisin B1... 30 3.5.2.2 Fumonisin B2... 30 3.5.3 Zearalenony... 30 3.5.3.1 Zearalenon, F-2 toxin... 31 3.5.4 Emerging mykotoxiny... 32 3.5.5 Konjugované (maskované) mykotoxiny... 33 3.6 Vliv mykotoxinů na zdraví člověka a zvířat... 33 3.7 Faktory vzniku toxinů... 34 3.8 Monitoring výskytu mykotoxinů v České republice... 35 3.8.1 Monitoring mykotoxinů v potravinářských obilninách v ČR... 36 3.8.2 Monitoring mykotoxinů v krmivech v ČR... 37 14

3.9 Způsoby a metody stanovení mykotoxinů... 38 3.9.1 Odběr vzorků k laboratornímu stanovení... 38 3.9.2 Stanovení mykotoxinů... 39 3.9.2.1 Plynová chromatografie (GC)... 39 3.9.2.2 Chromatografie na tenké vrstvě (TLC)... 40 3.9.2.3 Vysokoúčinná tenkovrstvá chromatografie (HPTLC)... 40 3.10 Legislativa v oblasti mykotoxinů... 40 3.11 Ochrana kukuřice proti houbám rodu Fusarium... 42 3.11.1 Preventivní opatření při pěstování kukuřice... 42 3.11.1.1 Hybridní kukuřice... 42 3.11.1.2 Agrotechnika... 43 3.11.1.3 Sklizeň... 43 3.11.2 Preventivní opatření po sklizni kukuřice... 44 3.11.2.1 Skladování... 44 3.11.2.2 Silážování... 44 4 ZÁVĚR... 47 5 POUŽITÁ LITERATURA... 48 6 PŘÍLOHY... 54 6.1 Seznam tabulek... 54 6.2 Seznam obrázků... 55 15

ABSTRACT Phytopathogenic fungi of the genus Fusarium are important pathogens of maize, which negatively effect the yield and many of them are also among the secondary producers of mycotoxins. The aim was to describe the different species of the Fusarium that occur in the growing and processing corn. F. graminearum, F. culmorum, F. acuminatum, F. semitectum, F. verticillioides and others produce mycotoxins, especially trichothecenes, zearalenone and fumonisin contaminated and thus the overall production. The work also focuses on the description of mycotoxins and their effects on human and animal health. It also summarizes the valid legislation, which is controlled by the maximum amount of Fusarium toxins in raw materials intended for food and feed production. The final section is devoted to each measure, which should aim to minimize the infestation of plants fusariosis and by suppressing the production of mycotoxins. Key words: Fusarium, maize, mycotoxins, legislation ABSTRAKT Houby rodu Fusarium jsou významnými patogeny kukuřice, které negativně ovlivňují výnos a některé z nich se řadí mezi producenty mykotoxinů. Cílem práce bylo popsat jednotlivé druhy r. Fusarium, které se vyskytují při pěstování a zpracování kukuřice. F. graminearum, F. culmorum, F. acuminatum, F. semitectum, F. verticillioides a další produkují mykotoxiny, především trichotheceny, fumonisiny a zearalenon a kontaminují tak výsledné produkty. Uveden je přehled a charakteristika jednotlivých mykotoxinů a jejich vliv na zdraví lidí a zvířat. Stručně je sumarizována platná legislativa regulující maximální množství těchto fusariových toxinů v surovinách určených pro výrobu potravin a krmiv. Závěrečná část práce je věnována opatřením, která by měla směřovat k minimalizaci napadení rostlin fusarii a tím i výskyt mykotoxinů. Klíčová slova: Fusarium, kukuřice, mykotoxiny, legislativa 7

POUŽITÉ ZKRATKY BEA DAS DDGS DON DNA ENNs EU IARC IOR OTA RNA TDI VFZ WHO ZEA ZON beauvericin diacetoxyscirpenol sušené výpalky s rozpustným podílem deoxynivalenol deoxyribonukleová kyselina enniatiny Evropská unie Mezinárodní agentura pro výzkum rakoviny integrovaná ochrana rostlin ochratoxin A ribonukleová kyselina hladina tolerovatelného denního příjmu podíl fusariových zrn Světová zdravotnická organizace zearalenon zearalenon 8

1 ÚVOD V současné době je celosvětově kukuřice významně zastoupena ve struktuře pěstovaných plodin. V nedávné době považována za plodinu, která není ve velké míře napadána škodlivými patogeny a škůdci. V důsledku stále se rozšiřujících ploch, pěstování v monokulturách, minimálnímu zpracování půdy, používání úzkých osevních sledů a klimatickým změnám se začaly u kukuřice vyskytovat nezanedbatelné problémy. Za významné patogeny kukuřice jsou v poslední době považovány i fytopatogenní houby, které způsobují 10 30% snížení výnosu a tím značné ekonomické ztráty. Mezi houbové patogeny s vysokým potenciálem škodlivosti patří i houby z rodu Fusarium, které jsou rozšířeny ve všech oblastech pěstování kukuřice. Výskyt a rozvoj houbových chorob podstatným způsobem podporuje poškození kukuřice živočišnými škůdci, především zavíječem kukuřičným. Vedle snížení výnosů je daleko významnějším rizikem z pohledu bezpečnosti potravního řetězce kontaminace sklizňových produktů mykotoxiny. Tyto toxické sekundární metabolity jsou produkovány více druhy mikroskopických vláknitých hub, mezi které patří i houby r. Fusarium. Mykotoxinová kontaminace zemědělských komodit určených pro potravinářské zpracování a pro krmné účely, je závažným celosvětovým problémem. Dokládají to i opakované žádosti dozorčí organizace nad bezpečností potravin (EFSA) o nová data k této problematice. S minimalizací mykotoxinové kontaminace potravin a krmiv je potřeba začít už od prvovýroby, tj. dodržováním správných agrotechnických postupů. I když snaha o produkci kvalitních zemědělských surovin v souladu se zásadami správné zemědělské praxe je značná, přítomnost fusarií v obilninách úplně eliminovat nelze. Během technologického zpracování cereálií koncentrace fusarií sice klesá, ale k významnější degradaci vzhledem k jejich tepelné a chemické stabilitě nedochází. Přítomnost určité hladiny mykotoxinů v cereálních produktech dostupných v obchodní síti nebo v krmivech pro hospodářská i zájmová zvířata je tedy běžná. 10

2 CÍL PRÁCE Cílem závěrečné práce bylo vypracovat literární přehled nejzávažnějších fusarióz kukuřice, charakterizovat jednotlivé mykotoxigenní druhy r. Fusarium a jejich produkty, mykotoxiny. Popsat účinky mykotoxinů na živočišné organismy a člověka a doporučit vhodná opatření pro pěstování kukuřice směřující ke snížení napadení houbami rodu Fusarium. 11

3 LITERÁRNÍ PŘEHLED 3.1 Kukuřice Kukuřice setá (Zea mays L.) je rostlinou, která společně s hustě setými obilninami a řepkou představuje nezastupitelné místo ve struktuře pěstovaných plodin v České republice. Plochy oseté kukuřicí se ve světě, ale i v České republice, rozšiřují, a to i přesto, že za posledních dvacet let došlo k významnému snížení počtu chovaných hospodářských zvířat, která byla významnými konzumenty kukuřičné siláže. Kukuřičná siláž se ale stala stěžejním zdrojem biomasy pro bioplynové stanice a lze konstatovat, že kukuřice je dnes velmi žádanou komoditou se zajištěným odbytem. 3.2 Rod Fusarium Taxonomické zařazení rodu Fusarium: říše Fungi, oddělení Ascomycota, řád Hypocreales, čeleď Hypocreaceae, rod Fusarium (Malíř et al., 2003). 3.2.1 Historie r. Fusarium Rod Fusarium byl popsán Linkem v roce 1809 jako druh s vřetenovitými nedělitelnými konidiemi (Booth, 1971). S mikroskopickými houbami, pouhým okem nerozlišitelnými, se mohl člověk seznámit až s objevem mikroskopu a rozvojem mikroskopických metod (Ostrý, 2002). 3.2.2 Charakteristika rodu Fusarium Druhy tohoto rodu patří mezi nejvíce prostudované patogeny způsobující onemocnění nejen polních plodin (kukuřice, pšenice, ječmene), zeleniny a okrasných rostlin, ale i potravin a krmiv, snižující kvalitu pěstovaných plodin a způsobující značné ekonomické ztráty (Booth 1971, Glenn 2007). Některé druhy r. Fusarium produkují chemicky rozmanité mykotoxiny, např. diacetoxyscirpenol, deoxynivalenol, nivalenol, T-2 toxin, zearalenon, fumonisiny, fusarin C, beauvericin, moniliformin a fusaproliferin (Glenn 2007, Covarelli et al., 2012). Fusaria vytvářejí dobře vyvinuté vegetativní mycelium s konidiálním stadiem tvořícím buď volné jednotlivé konidiofory, na nichž se vyskytují mikrokonidie, nebo se konidiofory shlukují do makroskopicky viditelných, drobných polštářovitých útvarů, tzv. sporodochií. Makrokonidie jsou dvoubuněčné až vícebuněčné spory a mají typický srpovitý tvar. Mikrokonidie jsou jednobuněčné, elipsoidní, oválné nebo široce vejčité. 12

Na konci konidiogenní buňky tvoří řetězce nebo shluky. Pro určení druhu jsou charakteristické makrokonidie, u nichž se sleduje počet buněk, velikost, tvar zahnutí, velikost a způsob vzniku v řetízku nebo ve slizovém shluku (Malíř et al., 2003). Dle Bootha (1971) některé druhy vytvářejí v hojné míře chlamydospory, které jsou různého tvaru i velikosti, s různým počtem buněk, často se zbarvenou buněčnou stěnou. Fusaria mohou tvořit také tuhé kulovité útvary, tzv. sklerocia (Malíř et al., 2003). Některé druhy hub rodu Fusarium tvoří teleomorfní stadium, tj. perithecia s asky a askosporami (Širučková, Kroutil, 2007). 3.2.3 Výskyt druhů rodu Fusarium na kukuřici Malíř et al. (2003) řadí druhy rodu Fusarium k významným patogenům kořenového systému a báze stébla rostlin. Rostliny mohou napadat v každé fázi vývoje (Lepschy et al., 1992), ale hlavním obdobím, kdy dochází k napadení kukuřice, je fáze vzcházení. Riziko napadení kukuřice fusarii narůstá při častém zařazování kukuřice do osevního sledu, riziko napadení palic i zpracováním půdy s vynecháním orby. Rozvoj hub podporuje vysoká půdní a vzdušná vlhkost, nesprávná výživa (především dusíkem) a malý podíl organické hmoty (hlavně živočišného původu) v půdě (Hrudová et al., 2006). Podstatným faktorem je také napadení osiva během mokré sklizně či skladování vlhkého osiva (Kazda et al., 2010). Zrna kukuřice bývají osídlena mikroskopickými houbami, které mohou snižovat klíčivost a vzcházivosti rostlin. Jedná se především o zástupce rodu Penicilium, Aspergillus a Fusarium (Kazda et al., 2010). Infekci klasu kukuřice způsobují především druhy F. graminearum, F. verticillioides a F. proliferatum, zatímco stonku nejčastěji druhy F. equiseti, F. proliferatum a F. verticillioides (Dornem et al., 2011). Nejvyšší koncentrace fumonisinů ve stoncích i v klasu byla zjištěna ve fázi plné zralosti Uegaki et al. (2012). Přibližně od fáze časné mléčné zralosti (BBCH 73) začínají být patrné příznaky napadení palic fusarii tzv. bílorůžová hniloba zrn. Příznakem napadení je nepravidelné vyzrávání, deformace, hnědavé až červenofialové zabarvení zrn. Při vyšší vlhkosti se na palici objevují bělavé, popřípadě narůžovělé povlaky mycelia. Fusaria mohou být příčinou i růžové hniloby stébel kukuřice. Produkty z kukuřice bývají často kontaminovány toxiny produkovanými fusarii ve větší míře, než povolují normy. Napadené palice a sláma by proto neměly být používány jako surovina pro výrobu potravin ani krmiv (Kazda et al., 2010). 13

V tropických oblastech je převládajícím druhem napadajícím kukuřici Fusarium graminearum, které produkuje mykotoxiny deoxynivalenol a zearalenon. Vzhledem k předpokládaným změnám v klimatu se předpokládá, že bude ovlivněn výskyt hub rodu Fusarium a tím i jejich druhotných metabolitů (Van Asselt et al., 2012). Scauflaire (2012) z kukuřice izoloval v 2012 v Belgii nový druh fusaria, Fusarium temperatum, který je morfologicky podobný a úzce souvisí s F. subglutinans. 3.3 Mykotoxigenní druhy fusarií na kukuřici Vláknité houby rodu Fusarium se vyskytují především v půdě (Fassatiová, 1979), přezimují na poli na rostlinných zbytcích, převážně na zbytcích po pěstování kukuřice na zrno (Hýsek et al., 2003, Tvarůžek et al., 2000). Houby rodu Fusarium jsou producenty trichothecenů, fumonisinů a zearalenonu (Hajšlová et al., 2009). Jsou natolik adaptabilní, že mohou produkovat toxiny také v již sklizených obilninách, během skladování, a to v přímé závislosti na vlastnostech zrna a podmínkách prostředí (Polišenská, 2008). Zdrojem fusarií může být i napadené osivo (Leslie a Summerell, 2006). Tab. 1: Druhy rodu Fusarium v potravinách (Malíř et al., 2003) Druh F. acuminatum Ellis & Everh. F. avenaceum (Fr.) Sacc. F. culmorum (W. G. Smith) Sacc. F. equiseti (Corda) Sacc. F. graminearum Schwabe F. oxysporum Schltdl. F. poae (peck) Wollenw F. semitectum Berk. & Ravenel F. sporotrichioides Sherb. F. chlamydosporum Wollenw. & Reinking 3.3.1 Gibberella avenacea Anamorfa: Fusarium avenaceum (Fr., 1822) Teleomorfa: Gibberella avenacea (Sacc., 1886) F.avenaceum se vyskytuje v půdě mírného klimatického pásma, bylo však zjištěno i v poušti a v lesních půdách (Leslie a Summerell, 2006) a pro jeho šíření jsou ideální chladnější oblasti. Poprvé bylo popsáno v roce 1822 švédským profesorem Eliasem M. Friesem. F.avenaceum je patogenem mnoha druhů rostlin, u nichž 14

způsobuje různá onemocnění, např. suchá hnilobu bramborových hlíz, hniloba kořenů a klasů obilnin aj. F. avenaceum vytváří protáhlé makrokonidie, na konci prohnuté, se třemi až pěti septy. Mikrokonidie ani chlamydospory netvoří. Pohlavní stadium Gibberella avenacea bylo popsáno na klasu pšenice (Anne, 2006). V kultuře vytváří oranžové až světle hnědé porosty (Desjardins, 2006). Na umělé živné půdě dochází často k mutacím. F. avenaceum je nejčetnějším zástupcem rodu Fusarium, ale toxicita pro člověka a živočichy nebyla prokázána, ale půdní kultury jsou toxické pro myši a kuřata. F. avenaceum je odolné vůči fungicidům (Ostrý 2002, Anne 2006, Desjardins 2006). Obr. 1: Fusarium avenaceum (Fassatiová 1979) a konidiofory, b makrokonidie 3.3.2 Fusarium equiseti F. equiseti (Corda, 1838) Sacc. bylo Augustem C. J. Cordou původně pojmenováno Selenosporium equiseti a název publikován v Praze roku 1838. Dříve bylo považováno za patogena starších rostlin, nyní je jeho výskyt sledován u více než 240 druh rostlin a semen. F. equiseti zatím nebylo potvrzeno jako patogen vyvolávající toxikózy lidí a zvířat (Anne, 2006). F. equiseti tvoří ve velkém množství chlamydospory, ale netvoří mikrokonidie. 15

Obr. 2: Fusarium equiseti (Fungi of Great Britain and Ireland, 2013) 3.3.3 Fusarium graminearum Teleomorfa: Gibberella zeae (Schwein., 1838) Petch Anamorfa: Fusarium graminearum Schwabe F. graminearum bylo izolováno v roce 1838 z kukuřice a pojmenováno americkým mykologem Lewisem Davidem von Schweinitzem. Na glukosobramborovém agaru kultury tvoří bílý, nahnědlý, růžový až červený pigment (Anne 2006, Leslie a Summerell 2006), mycelium je bílé, vločkovité. Zbarvení kultury závisí na typu živné půdy a ph (Fassatiová, 1979). Konidiofory jsou jednoduché, popřípadě větvené a často se shlukují do sporodochií (Demeke, 2010). Makrokonidie mají 3 až 7 přehrádek a dle Leslie a Summerella (2006) vytváří, ve srovnání s ostatními druhy, méně makrokonidií. Zřídka se tvoří kulovité tlustostěnné chlamydospory (Anne, 2006). Makrokonidie a askospory jako zdroj infekce mohou přetrvávat na rostlinných zbytcích až po dobu tří let (Širučková, Kroutil, 2007). F. graminearum se vyskytuje na obilninách (kukuřice, pšenice, rýže, oves, ječmen) a dalších plodinách (rajčata, luštěniny) celého světa. Produkuje zejména DON, ZEA a nivalenol. V 80. letech v USA F. graminearum vyvolalo dietetické a zdravotní problémy chovaných prasat (Anne 2006, Polišenská 2008, Polišenská 2009). F. graminearum tvoří na infikovaných palicích a zbytcích rostlin ve sporodochiích makrokonidie, které jsou deštěm rozstřikovány na další stébla a listy a vyvolávají sekundární infekce. Zdrojem primární infekce je napadené osivo nebo rostlinné zbytky ponechané na pozemku (Širučková, Kroutil, 2007) 16

Obr. 3: Fusarium graminearum (Fassatiová 1979) a konidiofor s makrokonidiemi, a1 konidiofor s mikrokonidiemi, b makrokonidie, c chlamydospory 3.3.4 Fusarium oxysporum Anamorfa: Fusarium oxysporum (Schlechtend. Emend. Snyder & Hansen, 1824) F. oxysporum bylo poprvé popsáno německým botanikem D. F. L. von Schlechtendahlem v roce 1824. Napadá rostliny a osivo mnoha druhů plodin (Anne, 2006). Zabarvení kolonií je rozmanité, tvoří bílé, světle až tmavě fialové mycelium. Obr. 4: Fusarium oxysporum (Mycology online 2013) 3.3.5 Fusarium culmorum F. culmorum (W. G. Smith) Sacc. (1892) je významným zástupcem fusarií v oblastech mírného pásma, ale vyskytuje se i v chladnějších oblastech Evropy jako patogen především bramboru a obilnin (Leslie a Summerell 2006, Nicholson 1998). Produkuje mykotoxiny moniliformin, deoxynivalenol a trichotheceny (Wagacha, 2007), jejichž negativní působení je spojováno s dermatitidou člověka. F. culmorum na sladinovém agaru tvoří bílé vločkovité mycelium, jehož barva se postupným stárnutím mění na žlutou až červenou (Osborne, 2007). Makrokonidie jsou krátké a silné a vzhledem ke své délce poměrně široké. Vyznačují se většinou 17

jednotným tvarem a velikostí (Nicholson, 1998). Tvorba mikrokonidií nebyla pozorována (Leslie a Summerell, 2006). Výrazným znakem F. culmorum v přirozeném prostředí jsou korálově zbarvená sporodochia (Wagacha, 2007), která jsou zpočátku světle oranžová a později přecházejí do hnědé barvy (Leslie a Summerell, 2006). Chlamydospory jsou kulovité nebo oválné, na povrchu hladké nebo drsné a vyznačují se poměrně rychlým a hojným růstem (Fassatiová, 1979). Obr. 5: Fusarium culmorum (Fassatiová, 1979) a interkalární chlamydospory, b konidiofor s makrokonidiemi, c makrokonidie s chlamydosporou 3.3.6 Fusarium poae Anamorfa: Fusarium poae (Peck, 1902) Wollenw. Anamorfa F. poae byla v roce 1902 popsána Charlesem H. Peckem jako Sporottrichum poae. Na sladinovém agaru tvoří bílé až červenohnědé rychle rostoucí mycelium, na substrátu žluté až karmínově červené (Glenn, 2007) s vřetenovitými makrokonidiemi. Mikrokonidie vznikající v řetízcích jsou mírně zakřivené, hruškovité až citrónovité (Fassatiová, 1979). F. poae tvoří chlamydospory (Anne,2006). Vyskytuje se na mnoha druzích plodin (rostliny i semena) a vyvolává nespecifikované humánní a zvířecí toxikózy (Anne, 2006). V ČR patří F. poae k dominantním patogenům ječmene. U tohoto druhu byla prokázána možnost koprodukce T2-toxinu a nivalenolu, mykotoxinů, které jsou mnohem toxičtější než např. DON. U ovsa spočívá hlavní problém v tom, že na rozdíl od pšenice, kukuřice a ječmene, kde jsou příznaky napadení zřejmé již za vegetace, nemusí být napadení lat fusarii pouhým okem pozorovatelné. (Polišenská 2008, Polišenská et al., 2009). Produkce mykotoxinu fusariogeninu, vyskytujícím se na přezimujících obilkách na poli, je zásadní ve vztahu ke zdraví lidí a zvířat (Ostrý, 2002). 18

Obr. 6: Fusarium poae (Fassatiová 1979) a makrokonidie, b mikrokonidie 3.3.7 Fusarium proliferatum Fusarium proliferatum (Matsushima, 1971) Nirenberg ex Gerlach & Nirenberg. V roce 1971 popsal T. Matsushima F. proliferatum jako Cephalosporium proliferatum. Napadá kukuřici, rýži, sóju, asparágus, banány aj. a způsobuje značené ekonomické ztráty (Anne, 2006). Jednotlivé kmeny na substrátu vytvářejí rozmanité barevné variace od bílé, šedavé, po tmavě fialovou, popřípadě černou barvu. Obr. 7: Fusarium proliferatum (mycotoxinsinfo 2013) 19

3.3.7 Fusarium semitectum Fusarium semitectum (Berk. & Ravenel, 1875). Britský mykolog Miles J. Berkeley izoloval z řapíku banánového listu houbu, kterou roku 1875 popsal jako F. semitectum. Od té doby bylo zaznamenáno v různých druzích půd, rostlinných zbytích, tropických a subtropických rostlinách. Mycelium je zbarveno bíle, béžově až slabě růžově a podpovrchové vrstvy jsou tmavě hnědé. Mikrokonidie zpravidla chybí a produkce chlamydospor je variabilní (Anne, 2006). Obr. 8 Fusarium semitectum (Ecoport, 2013) 3.3.8 Fusarium solani Fusarium solani (Mart., 1842) Sacc. F. solani izoloval C. P. P. von Martius ze shnilých rajčat a popsal již v roce 1842 jako Fusisporium solani. Do rodu Fusarium byl zařazen v roce 1881 italským mykologem Piersem A. Saccardo. Tvoří řídké krémově bílé mycelium s podpovrchovou namodralou až světle hnědou barvou. Kmeny F. solani var. coeruleum mohou na živné půdě tvořit zářivě modrý pigment. Makrokonidie jsou v průměru tří až čtyř přehrádečné, mírně zakřivené. Četné jsou nepravidelné mikrokonidie i chlamydospory (Malíř et al. 2003, Anne, 2006). 20

Obr. 9: Fusarium solani (Life-Worldwide.org, 2013) 3.3.9 Fusarium sporotrichioides Fusarium sporotrichioides (Sherb., 1915). F. sporotrichioides bylo poprvé popsáno v roce 1915 rostlinným patologem Constantine D. Sherbakoffem v New Yorku, který ho izoloval z hnijících bramborových hlíz. Patogen je přítomen v různých druzích půd, rostlin (především obilnin) vyskytujících se a pěstovaných v mírném podnebném pásmu, kde způsobuje značné ekonomické ztráty (Anne, 2006). Obr. 10: Fusarium sporotrichoides (Schimmel-finden.de, 2013) 21

3.3.10 Fusarium subglutinans Fusarium subglutinans (Wollenw, & Reinking) P. E. Nelson, Toussoun & Marasas (1893). F. subglutinans bylo objeveno a popsáno jako F. moniliforme var. subglutinans. Mycelium je šedo-oranžové až tmavě fialové. Tenkostěnné makrokonidie jsou děleny třemi až pěti přepážkami, mikrokonidie jsou vřetenovité F. subglutinans napadá kukuřici, čirok, cukrovou řepu, banány a ananas aj. (Anne, 2006). Obr. 11: Fusarium subglutinans (Wiki.bugwood.org, 2013) Tab. 2: Výskyt hub r. Fusarium v potravinách (Malíř et al., 2003) Druh F. avenaceum F. equiseti F. graminearum F. longines F. moniliforme F. oxysporum F. poae Potravina kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, triticale, hrášek, jablka, hrušky, asparágus, rajčata, lilek, brambory, arašídy kukuřice, obiloviny, obilné zrno, pšenice, kukuřice, ječmen, žito, rýže, čirok, sójové boby, vikev, rajčata, banány, dýně, ovocný džus, paprika, arašídy, vlašské ořechy kukuřice, pšenice, ječmen, čirok, triticale, cukrová řepa, sójové boby, banány, sušené maso kukuřice, rýže, vikev, sója, sezamová semena, arašídy zrno kukuřice, rýže, čirok, ječmen, sladké brambory, květák, česnek, ananas, banány, asparágus, lískové a pekanové ořechy, arašídy, ořechy kola, koriandr, pískavice = řecké seno, kardamon, pepř, sušené maso, sýry kukuřice, obiloviny, rýže, čirok, ječmen, sladké brambory, květák, okurky, meloun, olej z datlové palmy, rajčata, hrách, sójové boby, vikev, banány, citrusové plody, jablka, ovocný džus, česnek, brambory, semena koriandru, kakaové boby, paprika, sýr kukuřice v chladnějších oblastech, pšenice, ječmen, oves, sójové boby 22

F. proliferatum kukuřice, čirok, rýže, sója, banány F. semitectum F. solani F. sporotrichioides kukuřice, čirok, rýže, nahnilé ovoce, banány, sójové boby, slunečnicové semeno, citrusové ovoce, rajčata, meloun, okurka, brambory, arašídy, koriandr kukuřice, čirok, rýže, sladké brambory, zelenina, meloun, nezralé ovoce, boby, fazole, sójové boby, hrách, banány, cukrová řepa, česnek, arašídy, paprika, koriandr, pepř kukuřice, obiloviny, pšenice, čirok, cukrová řepa, sójové boby, arašídy, černý pepř, paprika F. subglutinans kukuřice, čirok, cukrová řepa, banány, ananas 3.4 Mykotoxiny Mykotoxiny představují význačný fenomén, který se jako závažný problém objevil až ve druhé polovině minulého století (Polster,1984). Ovšem samotné důsledky kontaminace potravin mykotoxiny získala dle Waśkiewitze et al. (2012) celosvětovou pozornost v posledních deseti letech a OSN uvádí, že až čtvrtina světové produkce potravin je znehodnocena mykotoxiny. Mykotoxiny jsou toxické sekundární metabolity produkované mikroskopickými vláknitými houbami napadajícími drobnozrnné cereálie a kukuřici (Ostrý 2002, Malíř et al. 2003, Moretti et al. 2006, Schneiderová 2007, Hajšlová et al. 2009). Mykotoxiny jsou strukturně odlišné komplexní organické sloučeniny o nízké molekulové hmotnosti (do 700 g.mol -1 ). Jsou nebílkovinné povahy, toxické pro člověka a živé organismy. Pravděpodobnou příčinou produkce mykotoxinů je boj o potravu a přežití (Malíř et al., 2003). Způsobují závažná onemocnění akutního i chronického rázu, negativně ovlivňující život člověka i zvířat (Paříková, Kučerová 2001). Dle Hajšlové et al. 2009 se jedná především o druhy r. Alternaria, Aspergillus, Penicillium a Fusarium. Kromě značného snížení technologické kvality pěstovaných cereálií, závažným problémem v potravinářství je hlavně přenos mykotoxinů do potravin, případně další uvolňování jejich tzv. maskovaných forem, ke kterému běžně dochází při technologickém zpracování, zejména během sladařsko-pivovarské technologie. Přítomnost mykotoxinů v plodinách nebo v krmivech závisí na mnoha faktorech, např. klimatických podmínkách, druhu a citlivosti plodiny, typu plísně, poškození zrnin hmyzem nebo mechanicky, užití fungicidů při sklizni, podmínky skladování a následná manipulace (Schneiderová, 2007). 23

Do těla se mykotoxiny dostávají se sporami při jejich vdechnutí a mají cytotoxické účinky na organismus (Paříková, Kučerová 2001). I když je obtížné charakterizovat nebezpečnost mykotoxinů komplexně, některé základní charakteristiky jsou společné. Kromě toho, že mykotoxiny jsou produktem houbových organismů, které jsou produkovány jako prostředky pro přežití v boji s konkurenčními organismy a látky, napomáhající houbovým patogenům kolonizovat hostitelské rostliny, mají celou škálu nepříjemných vlastností pro teplokrevné živočichy. Mykotoxiny totiž působí na většinu orgánů v těle konzumenta (Nedělník, 2012). 3.5 Mykotoxiny produkované druhy r. Fusarium Zástupci rodu Fusarium jsou součástí půdního ekosystému, kde se podílí na rozkladu organické hmoty. Řada druhů se během evoluce přizpůsobila k parazitismu rostlin, část za určitých podmínek může být patogenní i pro živočichy, včetně člověka (Malíř et al., 2003). Mezi houby s významným potenciálem škodlivosti patří mj. i fusaria. Škodlivost klasových fusarií spočívá zejména v redukci výnosu a kontaminace sklizně mykotoxiny. Maximální obsahy některých fusariových mykotoxinů v obilninách určených pro produkci potravin jsou v EU limitovány (Polišenská et al., 2009). 3.5.1 Trichotheceny Dosud bylo identifikováno a popsáno více než 150 trichothecenových mykotoxinů, které tvoří nejpočetnější skupinu fusariových mykotoxinů (Paříková, Kučerová 2001). Jde o tricyklické seskviterpeny charakterizované dvojnou vazbou mezi uhlíkem 9 a 10 a jedním epoxy kruhem mezi uhlíkem 12 a 13 a jsou klasifikovány jako 12, 13-epoxytrichotheceny (Gutleb et al., 2002). Jednotlivé trichotheceny jsou odlišné kvůli různým substituentům na uhlíku 3,4,7,8 a 15 (Hussein, Brasel 2001). Dle Hajšlové et al. (2009) je kontaminace sledována u cereálií, především u pšenice a kukuřice. Trichotheceny byly prokázány i u sójových bobů, banánů, manga, ale i v pivu, kam přechází z kontaminovaného ječmene. Podle charakteristických vlastností, počtu funkčních a substitučních skupin se rozlišují čtyři základní skupiny trichothecenů. Trichotheceny typu A (T-2 a HT-2 toxiny, NEO, DAS) mají vyšší akutní toxicitu než trichotheceny typu B (deoxynivalenol DON, nivalenol NIV, acetyldeoxynivalenol 3-ADON, 15-acetyldeoxynivalenol 15-ADON, fusarenon-x FUS- 24

X), které vykazují toxicitu chronickou (Hajšlová et al. 2009, Hajšlová et al. 2010). Dle Hajšlové et al. (2010) se intoxikace trichotheceny projevuje krvácením sliznic trávicího ústrojí a zánětlivými projevy v organismu. Akutní intoxikaci provází zvracení, u chovaných hospodářských zvířat odmítáním potravy (Gutleb et al., 2002, Kushiro 2009). Ztrátou hmotnosti, poruchami imunologického systému se projevuje chronické působení trichothecenů (Larsen et al., 2004). Trichotheceny způsobují inhibici mitochondriálních funkcí, proteosyntézy a syntézy DNA a RNA in vitro a in vivo. Studiemi bylo prokázáno, že trichotheceny typu A i B mají imunosupresivní účinky (Gutleb et al., 2002, He et al., 2009). Autoři Gutleb et al., (2002) a He et al. (2009) uvádějí, že nejnižší akutní toxicitu ve skupině trichothecenů vykazuje DON, naopak nejvíce toxický je trichothecen T-2 toxin, jenž ovlivňuje funkci mnohobuněčných membrán a způsobuje apoptózu, tzv. řízenou buněčnou smrt (Hajšlová et al., 2010). Na základě Doporučení komise č. 2013/165/EU byly k T2 a HT2 toxinům doplněny limity, pro kukuřičné zrno k lidské výživě je maximální hodnota stanovena na 100 µg.kg -1. Pro výrobky z kukuřice pro výrobu krmiv je hodnota stanovena na 500 µg.kg -1 a pro výrobu krmných směsí pro kočky je tato dávka poloviční (250 µg.kg -1 ), (Doporučení Komise 2013/165/EU). 3.5.1.1 Deoxynivalenol Deoxynivalenol (DON, Rd toxin, vomitoxin), C 15 H 20 O 6, Číslo CAS: 51481-10-8 Název: Trichothec-9-en-8-one, 12, 13-epoxy-3,7,15-trihydroxy- (3a, 7a). Deoxynivalenol patří mezi významné zástupce mykotoxinů trichotecenové skupiny B (Lepschy et al., 1992). Z hlediska způsobu biosyntézy patří mezi seskviterpeny, je dobře rozpustný v acetronitrilu, chloroformu, směsi octan etylnatý + acetonitril (4:1), ve směsi chlorofrom+metanol (9:1) a nerozpustný v hexanu a petroléteru (Malíř et al., 2003, Hajšlová et al., 2009). Producenti deoxynivalenolu Producenty DON jsou toxinogenní kmeny F. culmorum, F. graminearum, F. poae a F. sporotrichioides (Malíř et al., 2003, Hajšlová et al., 2009). Působení deoxynivalenolu Akutní toxicita, způsobená DON, se projevuje zvracením a střevními potížemi (Hajšlová et al., 2009). Schneiderová (2007) uvádí, že tyto projevy byly shledány 25

především u prasat. Přítomnost DON vyšší než 1 mg.kg -1 omezuje použitelnost krmiva pro prasata a z tohoto důvodu se akutní otravy u prasat vyskytují velmi zřídka. Canibe et al. (2010) sledovali u prasat přítomnost DON v podávaném zkvašeném krmivu. Organické kyseliny ve zkvašeném krmivu snižovaly ph krmiva a tím došlo ke snížení obsahu DON. Změna v poměru organických kyselin negativně ovlivňovala i přítomnost tohoto mykotoxinu. Naproti tomu u kuřat a slepic intoxikace DON zhoršuje kvalitu vajec a snižuje jejich hmotnost, i když v mase nebo vejcích nebyla rezidua DON zjištěna (Malíř et al., 2003, Schneiderová 2007). Schneiderová 2007 poukazuje, že krůty nejsou vůči působení DON příliš citlivé, pouze po podání vysokých dávek DON došlo k redukci jejich růstu a k poškození zobáku. U skotu snižuje příjem krmiva, negativně ovlivňuje reprodukci a nádoj mléka. Kromě toho byly u zvířat navíc prokázány i kožní změny, poruchy zažívání, hematologické, imunosupresivní změny či teratogenní účinky (Malíř et al., 2003, Schneiderová 2007). Výskyt DON v potravinách DON je pravděpodobně nejčastěji se vyskytující a nejznámější mykotoxin v potravinách a výrobcích z obilnin. DON byl nalezen v obilninách, kukuřici, ječmeni, triticale, prosu, čiroku a výrobků z nich, v otrubách, pivu, koření (koriandr, zázvor) a zelenině (sójové boby, česnek, brambory). DON je z hlediska distribuce v zrnu primárně nalézán na místech růstu mycelia mikromycetů, pouze malé množství je nalézáno uvnitř zrna. Při nízkých koncentracích vláknitých mikromycetů a mykotoxinové kontaminace (0,05 1,0 mg.kg -1 ) dochází k akumulaci DON blízko vnějšího povrchu zrna a s největší pravděpodobností existuje korelace mezi distribucí DON a stupněm napadení zrna (Malíř et al., 2003). Výskyt DON v krmivech V krmivu se nachází poměrně vysoké koncentrace DON, což je způsobeno obsahem lepku a vlhkosti zrna. Přenos DON na skot přes krmivo je možný, ale v samotném mléce jsou nálezy extrémně nízké. Rychlé vylučování nízkých a středně vysokých koncentrací DON u krmiv pro prasata má za následek, že rezidua DON nejsou akumulována. Přechod reziduí do mléka, masa, vajec je zanedbatelný (Malíř et al., 2003). Výše uvedené potvrzuje i Hajšlová et al. (2009), která uvádí, že polygastři jsou na DON méně citliví než monogastři, protože v bachoru se DON konvertuje na méně toxickou formu deepoxydeonivalenolu. 26

DON byl dříve považován za marker mykotoxinové kontaminace, protože bývá detekován s největší frekvencí. Ovšem s rozvojem moderních analytických metod bylo prokázáno, že jej stále častěji doprovázejí další, nejenom trichothecenové toxiny. V některých letech bývá dokonce DON zjišťován spíše minoritně a převládají toxiny, jako jsou NIV, nebo trichotheceny skupiny A-HT-2 a T-2. Další nezodpovězenou otázkou jsou jejich potenciální synergické toxické účinky (Hajšlová et al., 2010). Stanovení DON v potravinách je stanovován metodou TLC, HPTLC, HPTLC, HPLC, GC a imunochemickým metodami ELISA (Malíř et al., 2003). 3.5.1.2 T-2 toxin T-2 toxin, C 24 H 34 O 9, Číslo CAS: 21259-20-1 Název: {3-Hydroxy-4, 15-diacetoxy-8-[3-methyl-butyryloxy]-12, 13-epoxytrichothec 9- ene}. T-2 toxin je dobře rozpustný v acetonitrilu, chloroformu, směsi octan etylnatý+acetonitril, ve směsi chloroform + metanol (9:1) a nerozpustný v hexanu a petroléteru (Malíř et al., 2003). T-2 toxiny jsou řazeny mezi významné zástupce mykotoxinů trichotecenové skupiny A. Z hlediska způsobu biosyntézy patří mezi seskviterpeny (Malíř et al., 2003, Hajšlová et al., 2009). Dle Hajšlové et al. (2009) je pro obilniny běžný souběžný výskyt T-2 a HT-2 toxinu, jelikož jeden přechází v druhý (HT-2 je deacetylová forma T-2 toxinu). Producenti T-2 toxinu Producenty T-2 toxinu jsou toxinogenní kmeny F. acuminatum, F. culmorum, F. oxysporum, F. poae, F. chlamydosporum, F. semitectum, Fusarium equiseti, F. sporotrichioides, F. graminearum a F. avenaceum (Malíř, Ostrý et al., 2003). Působení T-2 toxinu T-2 toxin způsobuje nekrózy kůže, po požití nutí ke zvracení, snižuje imunitu, zvyšuje vnímavost vůči kandidózám, listeriózám, salmonelózám aj. Během toxikologického testování byly u krav a prasat prokázány záněty a hemoragie trávicího traktu, edémy, leukopenie, degradace kostní dřeně. Navíc bylo prokázáno, že T-2 toxin snižuje iniciaci proteinové syntézy na polyribozomech a u hlodavců způsobuje poškození DNA spolu s chromozoálními aberacemi. Toxikologické studie T-2 toxinu na zvířatech prokázaly, že toxin byl u prasat rozsáhle metabolizován a z tkání rychle eliminován. V játrech se akumulují rezidua T-2 toxin. V rámci experimentů in vivo 27

bylo u pokusných zvířat prokázáno, že T-2 toxin a jeho metabolity pronikají rychleji do masa kuřat než do masa prasat. Přestup do mléka je nižší než 1%. Otázka možného zesílení účinků T-2 toxinu s deoxynivalenolu je stále dostatečně neprobádaná (Malíř et al., 2013). 3.5.2 Fumonisiny Hudec (2007) spojuje fumonisiny s výskytem hub Fusarium verticillioides, Fusarium globosum, Fusarium thapsinum, Fusarium nygamai, Fusarium proliferatum, Fusarium antophilum, Fusarium dlamini a Fusarium napiforme. Významným mezníkem v objevu mykotoxinů fumonisinů byla roku 1988 izolace Fusarium moniliforme MRC 826 z kukuřice a jeho využití v toxikologických produkčních stanicích v Jihoafrické republice (Malíř et al., 2003). Nacházejí se především v kukuřici, kukuřičné siláži, ale i v rýži a prosu. Chemicky je možné fumonisiny charakterizovat jako složité alifatické sloučeniny, které jsou relativně termostabilní, účinně je lze z povrchu kukuřice odstranit omytím, zejména v alkalických roztocích (Hajšlová et al., 2009). Působení fumonisinů Fumonisiny v organismu degradují buňky, poškozují endocytózu, negativně ovlivňují metabolismus tuků nebo jejich vlivem dochází k poškození sfingamin N acetyltranferázy (Schneiderová 2007). Toxické účinky fumonisinů byly experimentálně ověřeny u hospodářských a laboratorních zvířat. Fumonisiny B 1 a B 2 v dávce 10 mg.kg -1 živé váhy vyvolaly u testovaných koní leukoencefalomalacii, u prasat plicní edémy (100 mg.kg -1 tělesné hmotnosti) a u potkanů fumonisiny B 1 a B 2 vyvolaly nádorové změny v játrech (dávka cca 15 mg.kg -1 ). Z těchto důvodů v USA Food and Drug Administration (FDA) doporučilo, aby koně, prasata a drůbež nebyli krmeni krmivy obsahujícími více než 50 mg fumonisinů na kg (Malíř et al., 2003, Schneiderová 2007, Waśkiewicz et al., 2012). Toxický vliv fumonisinu B 1 na prasata (plicní patologické změny) ve své studii potvrdili i Delegado a Wolt (2010). Přestože jsou fumonisiny (B 1 ) pro přežvýkavce méně toxické než pro monogastry, někteří autoři uvádějí jeho toxické účinky na ovce a býčky. Při příjmu krmiva s vyšší koncentrací B 1 (nad 148 ppm) byl zaznamenán nižší příjem krmiva a menší přírůstek hmotnosti. Testované dojnice vykazovaly o šest litrů nižší nádoj mléka a nižší příjem krmiva. Uvádí se, že mléčný skot je vůči působení fumonisinů citlivější než skot chovaný bez tržní produkce mléka (Schneiderová, 2007). Emadem et al. (2012) 28

uvádějí rozdíly ve vnímavosti toxických účinků u drůbeže, kdy u kachen byla prokázána velká citlivost vůči fumonisinů, zatímco krůty byly méně vnímavé. Při inhibici biosyntézy sfingolipidů dochází k útlumu ceramide syntetázy, což bylo prokázáno u poníků, prasat, potkanů, opic. Nejvíce postiženými orgány byly játra, plíce, ledviny. Účinek fumonisinů na ledviny byl prověřován na základě sledování poměru sfinganinu a sfingosinu v moči a v ledvinách. Stanovení fumonisinů v krevní plazmě a moči může být markerem pouze krátké expozice těmto toxinům, neboť je známo, že fumonisiny jsou u všech živočišných druhů jen nepatrně biodostupné. Ve východní a jižní Africe byly fumonisiny prokázány dokonce v 92,5 % analyzovaných vzorků kukuřice (Malíř et al., 2003). Shodné výsledky byly získány i v České Republice, kdy v letech 1995 a 1996 bylo analyzováno celkem 210 vzorků potravin vyrobených z kukuřice (výrobky z kukuřičné mouky, cornflakes apod.) a 89 % vzorků bylo pozitivních na obsah fumonisinů v rozsahu 9 4 594 µg.kg -1 (průměrně 180 µg.kg -1 ). U 4 % vzorků byla hodnota fumonisinů vyšší než 1 000 µg.kg -1, u 10 % vzorků byla hodnota stanovena na více než 500 µg.kg -1 a většina vzorků spadala do kategorie do 100 µg.kg -1. Kukuřičný křehký chléb, extrudované kukuřičné výrobky a polenta patří k potravinám s nejvyšší koncentrací fumonisinů. U 27 výrobků z kukuřice pěstované v ČR, určených pro bezlepkovou dietu, bylo 88 % vzorků pozitivních na obsah fumonisinů (FB 1, FB 2, FB 3 ). Diskutován je i možný vznik reziduí fumonisinů v potravinách živočišného původu (mléko aj.) po předchozí konzumaci krmiv na bázi kukuřice s vysokými hodnotami fumonisinů zvířaty (Malíř et al., 2003). Fumonisiny jsou také dalšími fusariovými mykotoxiny, jejichž maximální přípustná množství jsou limitována legislativou. Pro B1 je tato hodnota stanovena na 2 000 ng.kg -1 t.hm/den (Malíř et al., 2003, Hajšlová et al., 2010). Tab. 3: Producenti fumonisinů (Malířet al., 2003) Druh F. moniliforme J. Scheldon F. proliferatum (T. Matsushima) Nirenberg F. anthophilum (A. Braun) Wollenw F. oxysporum Schlecht. var. Redolens (Wollenw.) Gordon F. dlaminii Marasas, P. E. Nelson & T. A. Toussoun, Trimboli F. nygamai Burgess a Trimboli F. napiforme Marasas, P. E. Nelson & Rabie, Trimboli 29

Fumonisiny lze chemicky definovat jako složité alifatické sloučeniny a z hlediska způsobů biosyntézy patří mezi nonaketidy. Doposud byla izolována řada fumonisinů a jejich metabolitů (A 1, A 2, B 1 až B 4, C 1 až C 4, P 1, P 2, P 3 ). Významné jsou zejména fumonisiny skupiny B (B 1, B 2, B 3 ), běžně se vyskytující v přírodě. Fumonisiny se v potravinách dle Malíře et al. (2003) a Ostrého (1995) stanovují laboratorními metodami TLC, HPTLC, HPLC, GC-MS a i biochemickými metodami. 3.5.2.1 Fumonisin B1 Fumonisin B1 (macrofusin), C3 4 H 59 NO 15, Číslo CAS: 116355-83-0 Název: diestery propan-1, 2, 3-tricarboxylic and 2-amino-12, 16-dimethyl-3,5,15- pentahydroxyicosanu Fumonisin B1 je amorfní pevná látka, rozpustná ve vodě, více rozpustná ve směsi acetonitril-voda, dobře rozpustná v metanolu a nerozpustná v nepolárních rozpouštědlech (Malíř et al., 2003). 3.5.2.2 Fumonisin B2 Fumonisin B2 C34H59NO14 Fumonisin B2 je amorfní pevná látka s bodem tání 103 až 105 ⁰C a molekulovou hmotností 705,8 g.mol -1. Rozpustný ve vodě, více rozpustný ve směsi acetonitril-voda, dobře rozpustný v metanolu, nerozpustný v nepolárních rozpouštědlech (Malíř et al., 2003). 3.5.3 Zearalenony Producenty zearalenonu jsou zejména toxigenní kmeny fusarií, z nichž nejvýznamnější jsou F. graminaerum s F. semitectum (Hajšlová et al., 2009, Atoui et al., 2012). Mykotoxin byl poprvé izolován Stobem v roce 1964 z kultury Gibberella zeae (anamorfa F. graminearum). Tab. 4: Významní producenti zearalenonu (Malíř et al., 2003) Druh F. culmorum (W. G. Smith) Sacc. F. equiseti (Corda) Sacc. F. graminearum Schwabe F. moniliforme Sheld. F. oxysporum Schltdl. F. sambucinum F. semitectum Berk. & Ravenel F. sporotrichioides Sherb. 30

3.5.3.1 Zearalenon, F-2 toxin Zearalenon, F-2 toxin (C 18 H 22 O 5 ), Číslo CAS: 17924-92-4 Název: {6[10 Hydroxy-6-oxo-trans-1-undecenyl] 2,4-hydroxybenzoic acid lactone}. Bílá krystalická látka bez zápachu, rozpustná v organických rozpouštědlech (éter, etanol, metanol), v alkalických vodných roztocích, nerozpustná ve vodě, chemicky charakterizována jako lakton kyseliny β-resocylové. Producenti zearalenonu Mezi významné producenty zearalenonu patří toxinogenní kmeny F. graminearum, F. culmorum, F. equiseti, F. moniliforme, F. sambucinum, F. semitectum, F. sporotrichioides a F. oxysporum (Malíř et al., 2003, Ostrý et al., 2003). Působení zearalenonu Při orálním podání je zearalenon zvířaty rychle absorbován a redukován na metabolity 7α a 7β-zearalenol. V bachoru přežvýkavců je zearalenol převáděn na zeranol derivát, jenž netvoří dvojnou vazbu v poloze 1 a 2. Zearalenon byl dle Malíře et al. (2003) objeven i ve žluči, kdy po jednorázovém podání 100 mg zearalenonu dospělému člověku byly v moči prokázány jeho metabolity 7α a 7βzearalenol. V tenkém střevě je zearalenon krevním řečištěm distribuován do různých částí těla, kde se spojuje s globulinem, na který jsou navázány lidské pohlavní hormony. U myší se zearalenon koncentruje v uteru, intersticiálních buňkách varlat a ovariálních folikulech, naproti tomu u potkanů je deponován do tukové tkáně. U prasat byl zearalenon prokázán v játrech po příjmu takto znehodnoceného krmiva. U krav a ovcí byl tento mykotoxin detekován v mléce. Navíc bylo potvrzeno vylučování metabolitů zearalenonu močí a stolicí u potkana, psa, opice, prasete. U přežvýkavců se jeví přechod zearalenonu do bachoru z hlediska jeho kontaminace jako nevýznamný. Ze všech zvířat jsou prasata nejvnímavějším druhem, kdy jednorázovou deponací zearalenonu (> 3,5 mg.kg -1 tělesné hmotnosti) byly u mladé prasnice vyvolán zánět a otok vulvy. U skotu může zearalenon způsobit problémy v koncentraci 0,5 1,0 mg.kg -1 krmiva. Problémy s říjí (hyperestrogenismus) jsou u krav pozorovatelné už po čtyřech až sedmi dnech po podání kontaminovaného krmiva a odezní až po třech až čtyřech týdnech po ukončení příjmu krmiva. Hyperestrogenní syndrom byl zjištěn po aplikaci dávky zearalenonu od 25 do 100 mg.kg -1 živé váhy zvířete. I když zearalenová intoxikace nemá fatální následky, k úhynu zvířat dochází obvykle po napadení 31

vyhřeznutých orgánů a sekundární bakteriální infekci. Z těchto důvodů není vhodné krmit prasata krmivy s obsahem zearalenonu vyšší než 500 µg.kg -1 krmiva (Malíř et al., 2003). Chronická toxicita se promítá do problémů s reprodukčním cyklem zvířete, kdy u prasnic způsobuje atrofii vaječníků, přerušovanou říji, falešnou březost, neplodnost. Opakované dávky dospívajícím prasnicím způsobovaly sterilitu. U samců dochází k atrofii varlat s rozvojem prsních žláz. Markantní účinky toxinu na drůbež nebyly prokázány, protože koncentrace do 800 mg.kg -1 nevyvolaly žádné účinky. Při podání vyšších koncentrací byl u krocanů zjištěn pouze úbytek spermatu, bez vlivu na jeho kvalitu. Také přežvýkavci jsou odolnější než prasata, pravděpodobně díky bachoru, kde dochází k degradaci zearalenonu na zearalenol (Malíř et al., 2003, Schneiderová 2007). Zearalenon byl zjištěn nejen v kukuřici, ale i v dalších obilovinách, v senu a v siláži mnoha oblastí světa. Hromadění ZEA v kukuřici aktivuje vlhké počasí, které udržuje její vlhkost v rozmezí 22 až 25 % nebo oddálená prodloužená sklizeň (Schneiderová, 2007). Stanovení zearalenonu Zearalenon lze detekovat metodou HPLC ze vzorků kukuřice (Atoui et al., 2012). 3.5.4 Emerging mykotoxiny Předchozí skupiny fusariových mykotoxinů jsou studovány již několik desetiletí, a informace o jejich výskytu a toxickém působení těchto látek jsou dostupné. V současné době se však začaly objevovat také jiné skupiny fusariových mykotoxinů tzv. emerging mykotoxiny, o kterých není mnoho informací (Hajšlová et al., 2010). Dle Hajšlové et al. (2010) by měla být pozornost směřována především enniatinům (ENNs), beauvericinu (BEA), moniliforminu a fusaproliferinu jejichž producenty jsou F. subglutinans, F. proliferatum, F. avenaceum. F. tricinctum, F. acuminatum, F. oxysporum, F. sporotrichiodes a F. sambucinum (Jestoi et al., 2009). Nejvíce postiženou plodinou je kukuřice (Hajšlová et al., 2010). Toxické účinky těchto kontaminantů jsou přičítány jejich ionoformním vlastnostem, avšak jejich případná akutní ani chronická toxicita doposud nebyla potvrzena a toxické působení těchto látek je neustále zkoumáno (Munkvold et al., 1998). 32

3.5.5 Konjugované (maskované) mykotoxiny Vedle volných mykotoxinů se v krmivech mohou vyskytovat tzv. maskované (konjugované) mykotoxiny. První zmínky o těchto maskovaných mykotoxinech jsou známy z 80. let minulého století, kdy byly pozorovány mykotoxikózy zvířat, u kterých klinický obraz zvířete neodpovídal množství stanovenému ve zkrmovaném krmivu (Savard, 1991). Maskované formy vznikají pravděpodobně při detoxikačních procesech obilnin a z důvodu vyšší polarity jsou obtížně stanovitelné (Hajšlová et al., 2009). Konjugované mykotoxiny se vyskytují ve formě rozpustné (maskované mykotoxiny) nebo asociované v makromolekule jako vázané mykotoxiny. Působením enzymových systémů rostlin vznikají zejména konjugované formy mykotoxinů, které vznikají v těle savců jako konjugáty s krevními složkami (albuminy) nebo s aminokyselinami (lysin, cystein) (Berthiller et al., 2005). Tvorbou konjugátů se rostlina snaží snížit toxicitu mykotoxinu navázáním polární molekuly (např. ß-D-glukosy) a zvýšit rozpustnost mykotoxinu ve vodě a vyloučit vzniklý konjugátu do vakuoly (Berthiller et al., 2009). Zejména u deoxynivalenolu a zearalenonu může být až polovina mykotoxinů v maskované formě (Vendl et al., 2010, cit. Pavelková, Bořutová, 2012). Tyto formy mykotoxinů není možné analyzovat metodami ELISA, nebo HPLC, ovšem jsou uvolňovány z trávicího traktu a mohou se podílet na projevech mykotoxikóz. V současnosti je možné detekovat maskovaný deoxynivalenol-3β-dglucopyranoside (DON-3-Glc), odvozený od DON (Hajšlová et al., 2009, Vendl et al., 2010, cit. Pavelková, Bořutová, 2012). 3.6 Vliv mykotoxinů na zdraví člověka a zvířat Důsledky působení mykotoxinů na živočišný organismus jsou velmi různorodé v závislosti na typu toxinu, dávce a délce doby jeho působení, druhu, stáří, pohlaví a aktuálnímu zdravotnímu stavu (Nedělník, 2012). Malíř et al. (2003) uvádějí, že některé druhy mykotoxinů způsobují hyalohyfomykózy člověka. U relativně zdravých jedinců se jedná nejčastěji o mykotickou keratitidu po traumatické inokulaci, onychomykózu nebo tyto toxiny způsobují subkutánní mykózy manifestující se jako cysta nebo absces. Nejběžněji se 33

vyskytujícími se agens jsou F. solani, F. oxysporum, F. verticillioides. Případy systémových mykóz byly rovněž popsány u F. aquaeductum, F. chlamydosporum, F. incarnatum, F. napiforme, F. nygamai, F. proliferatum, F. sacchari a F. subglutinans. Intoxikace mykotoxiny u zvířat se projevuje např. snížením imunity, alergickými reakcemi, poruchami nervové, reprodukční soustavy, dýchacího ústrojí, snížením konverze a využitím podávaných krmiv, nebo zvýšenou mortalitou u chovaných zvířat. mykotoxiny poškozují střevní sliznici, čímž dochází k omezené adsorbci živin, působením toxinů je také zhoršena funkce jater, ledvin, reprodukčních orgánů či imunitního systému. Gastrointestinální absorbcí dochází k pronikání toxinů přes krevní řečiště do ostatních tkání (Nedělník, 2012). Hajšlová et al. (2010) zdůrazňuje, že kontaminace mykotoxiny je velice závažná hlavně v potravinách určených pro děti, které ještě nemají dokonale vyvinutý detoxikační potenciál. V souvislosti se vzrůstající poptávkou po zdravých a kvalitních potravinách živočišného původu začala být pozornost soustředěna také na nutriční složení a hygienicko-toxikologickou nezávadnost krmiv, která je obzvláště důležitá z hlediska transferu metabolitů mykotoxinů do živočišných produktů. Všechny poznatky o negativním působení mykotoxinů na zdraví lidí a zvířat potvrzují, že nejúčinnější (a také nejlevnější) je prevence a zabránění vzniku mykotoxinů v krmivech (Nedělník, 2012). 3.7 Faktory vzniku toxinů Pro výskyt fusariových mykotoxinů je jedním z nejdůležitějších faktorů průběh počasí v dané vegetační sezóně, především četnost a vydatnost srážek, denní teploty, vlhkost vzduchu a délka slunečního svitu. Pro úspěšnou infekci se musí v příznivých podmínkách prostředí setkat zralé inokulum patogena a rostlina v náchylné růstové fázi. Pokud k infekci klasů dojde, následující průběh počasí přímo ovlivňuje míru rozvinutí infekce i intenzitu tvorby mykotoxinů. Zastoupení jednotlivých druhů fusarií na obilninách je variabilní v závislosti na geografických podmínkách, ročníku i zvolené agrotechnice (Polišenská et al., 2009). Ke kontaminaci obilnin dochází v průběhu jejich růstu a dozrávání na poli, případně i po sklizni, v období skladování (Polišenská, 2008). Whitlow a Hagler (2007) uvádějí, že faktory ovlivňující růst hub na plodinách, tj. klimatické podmínky (dešťové srážky, teplota, vlhkost), stres rostlin vyvolaný suchem, napadení škůdci, aplikace fungicidů sice mohou redukovat růst hub, ale nemusí 34