COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative Test, version 2.0

COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative Test, version 2.0 PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV HCVQTV2 72 Tests P/N: 05532264 190 Quantitative Test, v2.0 COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR 5.1 Liters P/N: 03587797 190 Wash Reagent Obsah ÚČEL POUŽITÍ... 1 SOUHRN A VÝKLAD TESTU... 2 PRINCIPY POSTUPU... 2 ČINIDLA... 5 VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ... 8 POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI... 9 DODÁVANÝ MATERIÁL... 9 POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY... 10 ODBĚR, PŘEPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ... 11 NÁVOD K POUŽITÍ... 11 KONTROLA KVALITY... 14 VÝSLEDKY... 14 PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ... 16 INTERFERUJÍCÍ LÁTKY... 17 VYHODNOCENÍ LABORATORNÍCH VÝSLEDKŮ... 18 LITERATURA... 25 ÚČEL POUŽITÍ Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je in vitro amplifikační test nukleové kyseliny pro kvantifikaci RNA viru hepatitidy typu C (HCV) genotypu 1 až 6 v lidské EDTA plazmě nebo séru za použití zařízení COBAS AmpliPrep pro automatizované zpracování vzorku a analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 pro automatizovanou amplifikaci a detekci. Test se používá k řízení terapie pacientů s chronickou HCV s klinickými a laboratorními markery infekce. Test může být použit pro předpověď pravděpodobnosti trvavé virové odpovědi (SVR) časně v průběhu antivirové terapie a pro zhodnocení virové odpovědi na antivirovou terapii (léčba podle odpovědi) měřené změnami hladin HCV RNA v séru nebo EDTA plazmě. Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 není určen k plošnému vyšetřování krve či krevních derivátů na přítomnost HCV, ani jako diagnostický test k potvrzení infekce virem HCV. Oddíl s informacemi o revizi dokumentu se nachází na konci tohoto dokumentu. 05902754001-01CS 1 Doc Rev. 1.0

SOUHRN A VÝKLAD TESTU Virus hepatitidy C je považován z 90-95 % za hlavního původce potransfúzní hepatitidy 1-4. HCV je virus s jednořetězcovou pozitivně orientovanou RNA s genomem obsahujícím zhruba 9 500 nukleotidů kódujících 3 000 aminokyselin. HCV se vyskytuje v krvi, a proto se může krví a krevními deriváty přenášet. Rozsáhlým plošným vyšetřováním krve na přítomnost viru HCV se nebezpečí onemocnění hepatitidou spojené s krevní transfuzí výrazně snížilo. Incidence infekce virem HCV je nejvyšší v souvislosti s nitrožilním zneužíváním drog a v menší míře i s ostatními perkutánními aplikacemi 4. Globální prevalence infekce virem HCV, stanovená imunosérologickými testy, se pohybuje v rozmezí od 0,6 % v Kanadě až po 1,5 % v Japonsku 3. Hodnoty spontánní clearance viru u exponovaných jedinců se značně liší; byly nahlášeny hodnoty mezi 10 a 60 % dle klinického testování po normalizaci jaterních enzymů a clearance HCV RNA v plazmě 5. Virové částice HCV nelze kultivovat z infikovaných vzorků krve, takže přítomnost anti-hcv protilátek v organismu pacientů infikovaných virem HCV vedla k vývoji imunosérologických testů, které jsou pro tyto protilátky specifické. Přítomnost protilátek anti-hcv je sice ukazatelem předchozí expozice infekci virem HCV, nelze ji však považovat za marker současné infekce. Hladina alaninaminotransferázy (ALT) se sice považuje za hrubý indikátor infekce virem HCV, není však přímou mírou virémie. Kvantifikace HCV RNA kvůli měření výchozích hladin virové nálože a kvůli sledování během léčby byla naopak dobře stanovena při demonstraci účinnosti antivirové odpovědi na léčbu peginterferonem spolu s ribavirinem 6 10. Současné pokyny pro léčbu HCV doporučují kvantitativní testování na přítomnost HCV RNA před zahájením antivirové léčby, během léčby (léčba podle odpovědi) a obecně 12 až 24 týdnů po ukončení léčby. Absence detekovatelné HCV RNA pomocí citlivého testu 24 týdnů po ukončení léčby je cílem léčby a ukazuje na trvalou virologickou odezvu (SVR) 11. Během antivirové léčby lze často pozorovat časnou virologickou odezvu (EVR), definovanou jako 2 log nebo větší pokles HCV RNA po 12 týdnech léčby. Nedosažení EVR přináší velmi velkou pravděpodobnost nedosažení i SVR a bylo zařazeno mezi pravidla pro zastavení léčby pegylovaným interferonem a ribavirinem 11-13. Rychlá virová odezva (RVR) a nedetekovatelné hladiny HCV RNA po čtyřech týdnech léčby představují vysokou prediktivní hodnotu trvalé virologické odezvy 14. Pro další přizpůsobení délky léčby pomocí nových agens s přímým antivirovým účinkem pro léčbu chronických infekcí HCV bývá v poslední době používáno stanovení virové kinetiky 15,16. PRINCIPY POSTUPU Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je amplifikační test nukleové kyseliny pro kvantifikaci RNA viru hepatitidy C (HCV) v lidské EDTA plazmě nebo séru. Příprava vzorku je automatizována pomocí zařízení COBAS AmpliPrep s amplifikací a detekcí automatizovanou pomocí analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48. Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je založen na třech základních procesech: (1) přípravě vzorku pro izolaci HCV RNA; (2) reverzní transkripci cílové RNA pro vytvoření komplementární DNA (cdna), a (3) simultánní PCR amplifikaci cílové cdna a detekci rozštěpených, dvojitě značených oligonukleotidových detekčních sond specifických pro cíl. Příprava vzorku Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 využívá automatizovanou přípravu vzorku na zařízení COBAS AmpliPrep pomocí generické vychytávací technologie založené na křemičitém sklu. Vstupní objem vzorku je 650 µl a pracovní postup zpracovává 500 µl EDTA plazmy nebo séra. HCV virové částice jsou rozloženy inkubací při zvýšené teplotě s proteázou a chaotropním lytickým/vazebným pufrem, což uvolňuje nukleové kyseliny a chrání uvolněnou HCV RNA před působením RNáz v séru nebo EDTA plazmě. Proteáza a známý počet molekul HCV kvantifikačního standardu (QS) RNA jsou přidány do každého vzorku spolu s lytickým činidlem a magnetickými skleněnými částicemi. Následně je směs inkubována a HCV RNA a HCV QS RNA jsou navázány na povrch magnetických skleněných částic. Nenavázané substance, jako soli, bílkoviny a ostatní buněčné nečistoty, jsou odstraněny propláchnutím magnetických skleněných částic. Po separaci kuliček a dokončení oplachování jsou absorbované nukleové kyseliny eluovány při zvýšené teplotě pomocí vodného roztoku. Zpracovaný vzorek obsahující uvolněnou HCV RNA a HCV QS RNA je přidán do amplifikační směsi a přemístěn do analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48. 05902754001-01CS 2 Doc Rev. 1.0

Reverzní transkripce a PCR amplifikace Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 používá reverzní transkripci HCV RNA na komplementární DNA (cdna) a PCR amplifikaci cdna pomocí primerů, které definují sekvenci ve vysoce konzervované oblasti 5'-nepřeložené oblasti genomu HCV 17. Nukleotidové sekvence primerů byly optimalizovány pro umožnění srovnatelné amplifikace genotypů HCV 1 až 6. Reverzní transkripce a PCR amplifikace se provádí pomocí optimalizované směsi termostabilních rekombinantních enzymů: polymerázy DNA ZO5 a ZO5D. Za přítomnosti manganu (Mn 2+ ) a při vhodných pufrovacích podmínkách vykazuje ZO5 a ZO5D aktivitu jak reverzní transkriptázy, tak polymerázy DNA. To umožňuje reverzní transkripci a PCR amplifikaci spolu s detekcí amplikonu v reálném čase. Zpracované vzorky se přidávají do amplifikační směsi v amplifikačních zkumavkách (K-zkumavkách), kde probíhá jak reverzní transkripce, tak PCR amplifikace. Reakční směs se zahřívá, aby se downstream primer napojil specificky na cílovou HCV RNA a na kvantifikační standard HCV QS RNA. Za přítomnosti Mn 2+ a nadbytku deoxynukleotid-trifosfátů (dntp), mezi něž patří deoxyadenozin-, deoxyguanozin-, deoxycytidin- a deoxyuridin-trifosfáty, polymerizují polymerázy ZO5 a ZO5D hybridizované primery za vzniku vlákna DNA komplementárního k cílové RNA. Amplifikace cíle Po reverzní transkripci cílové HCV RNA a HCV QS RNA zahřeje termocykler v analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 reakční směs tak, aby došlo k denaturaci hybridů RNA:cDNA a expozici specifických primerových cílových sekvencí. Při chladnutí směsi se primery připojí k cílové cdna. Termostabilní polymeráza DNA (ZO5 a ZO5D) za přítomnosti Mn 2+ a nadbytku deoxynukleotid trifosfátů (dntp) prodlužuje napojené primery podél cílových templátů a vytváří molekulu dvouřetězcové DNA, která se nazývá amplikon. Analyzátor COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 opakuje automaticky tento proces po určený počet cyklů, kdy při každém cyklu dojde ke zdvojení množství amplikonové DNA. Požadovaný počet cyklů je předem naprogramován v analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48. Amplifikace probíhá pouze v oblasti genomu HCV mezi primery, celý genom HCV amplifikován není. Selektivní amplifikace Selektivní amplifikace cílové nukleové kyseliny z klinického vzorku se dosahuje ve kvantitativním testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 použitím enzymu AmpErase (uracil-n-glykosylázy) a deoxyuridin-trifosfátu (dutp). Enzym AmpErase rozpoznává a katalyzuje destrukci vláken DNA obsahujících deoxyuridin 18, ale přitom vynechává DNA obsahující deoxythymidin. Deoxyuridin se v přirozené DNA nevyskytuje, je však vždy přítomen v amplikonu, díky použití deoxyuridin-trifosfátu jako jednoho z dntp v činidle Master Mix, takže deoxyuridin obsahuje pouze amplikon. V důsledku přítomnosti deoxyuridinu je kontaminovaný amplikon citlivý vůči destrukci enzymem AmpErase před amplifikací cílové DNA. Nespecifický produkt vytvořený po iniciální aktivaci Master Mix manganem je rovněž zničen enzymem AmpErase. Enzym AmpErase, který je obsažen v činidle Master Mix, katalyzuje rozštěpení DNA obsahující deoxyuridin v místě deoxyuridinového zbytku rozevřením deoxyribozového řetězce v pozici C1. Když je řetězec amplikonové DNA v prvním tepelně cyklizačním kroku zahříván, štěpí se v poloze deoxyuridinu, čímž se DNA stává neamplifikovatelnou. Enzym AmpErase zůstává neaktivní po delší dobu, jakmile je vystaven teplotám nad 55 C, tzn. v průběhu tepelně cyklizačního kroku, a proto nerozkládá cílový amplikon vzniklý během PCR reakce. Detekce rozštěpených, dvojitě značených sond a kvantifikace HCV RNA Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV v2.0 využívá v reálném čase běžící 16,17 PCR technologii. Použití dvojitě značených fluorescenčních sond umožňuje detekci akumulace PCR produktů v reálném čase monitorováním intenzity emise fluorescenčního barviva uvolněného během amplifikačního procesu. Sondy se skládají z HCV a HCV QS-specifických oligonukleotidových sond s oznamovacím a tlumícím barvivem. Ve kvantitativním testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0, jsou HCV a HCV QS sondy značeny různými fluorescenčními oznamovacími barvivy. Jsou-li tyto sondy intaktní, je fluorescence oznamovacího barviva potlačena blízkostí tlumícího barviva kvůli vlivu Försterova přenosu energie. Při PCR hybridizuje sonda s cílovou sekvencí a je rozštěpena 5' 3' nukleázovou aktivitou termostabilních polymeráz ZO5 a ZO5D DNA. Jakmile je oznamovací a tlumící barvivo uvolněno a odděleno, nedochází nadále k útlumu a fluorescenční aktivita oznamovacího barviva se zvýší. Amplifikace HCV RNA a HCV QS RNA je měřena nezávisle při různých vlnových délkách. Tento proces je opakován po předem určený počet cyklů, přičemž každý cyklus efektivně zvyšuje emisní intenzitu jednotlivého oznamovacího barviva a umožňuje nezávislou identifikaci HCV RNA a HCV QS RNA. PCR cyklus, při němž růstová křivka začíná exponenciální růst, souvisí s množstvím počátečního materiálu na začátku PCR reakce. 05902754001-01CS 3 Doc Rev. 1.0

Stanovení množství virové HCV RNA se provádí pomocí kvantifikačního standardu HCV. Ten kompenzuje účinky inhibitorů a kontroluje přípravné a amplifikační procesy, čímž umožňuje přesnější kvantifikaci HCV RNA v každém vzorku. HCV QS je neinfekční Armored RNA (arna) konstrukce, která obsahuje fragmenty HCV sekvencí s identickými vazebnými místy pro primer jako cílovou HCV RNA a unikátní vazebnou oblast pro sondu, která umožňuje odlišení HCV QS amplikonu od HCV cílového amplikonu. HCV QS se přidává do každého vzorku o známém počtu kopií a prochází následujícími kroky přípravy vzorku, reverzní transkripce, PCR amplifikace a detekce štěpených, dvojitě značených oligonukleotidových detekčních sond. Analyzátor COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 vypočítává koncentraci HCV RNA v testovaných vzorcích porovnáním signálu HCV se signálem HCV QS u každého vzorku a kontroly. Při polymerizační fázi PCR reakce v analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 jsou vzorky osvětleny a excitovány filtrovaným světlem a filtrovaná emisní fluorescenční data jsou shromažďována pro každý vzorek. Hodnoty pro každý vzorek jsou poté korigovány na kolísání hodnot zařízení. Tyto hodnoty fluorescence jsou odeslány zařízením do softwaru AMPLILINK a uloženy v databázi. Pre-Checks (kontroly) se používají pro stanovení, zda-li HCV RNA a HCV QS RNA data reprezentují sady, které jsou platné a příznaky jsou generovány v případě, že data leží mimo nastavené limity. Po dokončení a splnění všech kontrol jsou odečety fluorescence zpracovány pro generování Ct hodnot pro HCV RNA a HCV QS RNA. Kalibrační konstanty specifické pro šarži poskytované spolu s kvantitativním testem COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 jsou generovány pomocí kalibračního materiálu a používány pro kalkulaci hodnoty titru pro vzorky a kontroly založené na rozdílu hodnot HCV RNA a HCV QS RNA Ct. Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je standardizován dle mezinárodní normy WHO pro RNA viru hepatitidy C pro analýzy nukleových kyselin pomocí amplifikační technologie (WHO International Standard for Hepatitis C Virus RNA for Nucleic Acid Amplification Technology Assays) (NIBSC kód 96/790) 23 a hodnoty titru jsou udávány v mezinárodních jednotkách (IU/ml). 05902754001-01CS 4 Doc Rev. 1.0

ČINIDLA COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative Test, v2.0 (P/N: 05532264 190) HCV QT v2.0 CS1 (HCV kazeta s činidly pro magnetické skleněné částice) Magnetické skleněné částice Tris pufr 0,09 % azid sodný 0,1 % Methylparaben HCV QT v2.0 CS2 (HCV kazeta s lytickým činidlem) Dihydrát citrátu sodného 42,5 % Guanidinthiokyanát < 6 % Polydokanol 0,9 % Dithiothreitol Xn 42,5 % (hm.) Guanidinthiokyanát HCVQTV2 72 testů 1 x 72 testů 1 x 72 testů Zdraví škodlivý R20/21/22-R52/53-R32: Zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití. Škodlivý pro vodní organismy, může vyvolat dlouhodobé nepříznivé účinky ve vodním prostředí. Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami. S13-S61: Uchovávejte odděleně od potravin, nápojů a krmiv. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. Viz speciální pokyny nebo bezpečnostní listy. Xn < 6 % polydokanol Zdraví škodlivý R22-R41-R50: Zdraví škodlivý při požití. Nebezpečí vážného poškození očí. Vysoce toxický pro vodní organismy. S26-S39-S61: Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. Používejte osobní ochranné prostředky pro oči a obličej. Zabraňte uvolnění do životního prostředí. Viz speciální pokyny nebo bezpečnostní listy. HCV QT v2.0 CS3 HCV multičinidlová kazeta obsahuje: Pase (Roztok proteinázy) Tris pufr < 0,05 % EDTA Chlorid vápenatý Octan vápenatý 7,8 % proteináza Glycerol Xn 7,8 % (hm.) proteináza 1 x 72 testů 1 x 3,8 ml Zdraví škodlivý R37/38-R41-R42: Dráždí dýchací orgány a kůži. Nebezpečí vážného poškození očí. Může vyvolat senzibilizaci při vdechování. S22-S24-S26-S36/37/39: Nevdechujte prach. Zamezte styku s kůží. Při zasažení očí okamžitě důkladně vypláchněte vodou a vyhledejte lékařskou pomoc. Používejte vhodný ochranný oděv, ochranné rukavice a ochranné brýle nebo obličejový štít. 05902754001-01CS 5 Doc Rev. 1.0

EB (Eluční pufr) Tříbázový pufr 0,09 % azid sodný HCV QT v2.0 CS4 HCV kazeta na činidla specifická pro test obsahuje: QS (kvantifikační standard HCV) Tris pufr EDTA < 0,002 % Poly ra RNA (syntetická) < 0,001 % Armored HCV RNA konstrukce obsahující HCV vazebné sekvence primeru a unikátní vazebnou oblast sondy (neinfekční RNA v bakteriofágu MS2) 0,05 % azid sodný MMX (HCV Master Mix) Tricinový pufr Octan draselný Hydroxid draselný < 20 % dimethyl sulfoxid Glycerol < 0,004 % datp, dctp, dgtp, dutp < 0,002 % upstream a downstream HCV primery pro 5' UTR oblast HCV < 0,001 % fluorescenčně značené oligonukleotidové sondy specifické pro HCV a kvantifikační standard HCV < 0,001 % oligonukleotidový aptamer < 0,05 % polymerázy DNA ZO5 a ZO5D (mikrobiální) < 0,1 % enzym AmpErase (uracil-n-glykosyláza) (mikrobiální) 0,09 % azid sodný Mn 2+ (CAP/CTM roztok manganu) < 0,5 % octan manganatý Ledová kyselina octová 0,09 % azid sodný HCV H(+)C, v2.0 (HCV vysoce pozitivní kontrola) < 0,001 % Armored HCV RNA konstrukce obsahující HCV sekvence (neinfekční RNA v MS2 bakteriofágu) Negativní lidská plazma, nereagující podle testů na protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2, HIV p24 antigenu a HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA a HBV DNA nedetekovatelné PCR metodami 0,1 % konzervant ProClin 300 Xi (3:1) směs 5-chloro-2-methyl-2H-isothiazol-3-onu a 2-methyl-2H-isothiazol-3-onu 1 x 8,1 ml 1 x 72 testů 1 x 3,6 ml 1 x 3,5 ml 1 x 19,8 ml 6 x 0,85 ml Dráždivý R36/38: Dráždí oči a kůži. R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. 05902754001-01CS 6 Doc Rev. 1.0

HCV L(+)C, v2.0 (HCV nízce pozitivní kontrola) < 0,001 % Armored HCV RNA konstrukce obsahující HCV sekvence (neinfekční RNA v MS2 bakteriofágu) Negativní lidská plazma, nereagující podle testů na protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2, HIV p24 antigenu a HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA a HBV DNA nedetekovatelné PCR metodami 0,1 % konzervant ProClin 300 Xi (3:1) směs 5-chloro-2-methyl-2H-isothiazol-3-onu a 2-methyl-2H-isothiazol-3-onu 6 x 0,85 ml Dráždivý R36/38: Dráždí oči a kůži. R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. CTM ( ) C [Negativní kontrola COBAS TaqMan (lidská plazma)] Negativní lidská plazma, nereagující podle testů na protilátky proti HCV, protilátky proti HIV-1/2, HIV p24 antigenu a HBsAg; HIV-1 RNA, HCV RNA a HBV DNA nedetekovatelné PCR metodami 0,1 % konzervant ProClin 300 Xi (3:1) směs 5-chloro-2-methyl-2H-isothiazol-3-onu a 2-methyl-2H-isothiazol-3-onu 6 x 1,0 ml Dráždivý R36/38: Dráždí oči a kůži. R43: Může vyvolat senzibilizaci při styku s kůží. HCV H(+)C, v2.0 Clip (HCV klipy s čárovým kódem pro vysoce pozitivní kontrolu) HCV L(+)C, v2.0 Clip (HCV klipy s čárovým kódem pro nízce pozitivní kontrolu) HCV ( ) C, v2.0 Clip (HCV klipy s čárovým kódem pro negativní kontrolu) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Promývací činidlo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan (P/N: 03587797 190) PG WR (Promývací činidlo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) Dihydrát citrátu sodného < 0,1 % N-Methylisothiazolon-HCl PG WR 1 x 6 klipů 1 x 6 klipů 1 x 6 klipů 1 x 5,1 l 05902754001-01CS 7 Doc Rev. 1.0

VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ Jak je tomu při každém testovacím postupu, je pro správné fungování tohoto testu zásadním požadavkem dodržovat principy správné laboratorní praxe. Vzhledem k vysoké citlivosti testu je třeba dbát opatrnosti, aby mezi činidly a amplifikačními směsmi nedošlo ke kontaminaci. A. PRO ÚČELY DIAGNOSTIKY IN VITRO. B. Tento test je určen pro použití s lidským sérem nebo plazmou odebranou do antikoagulantu EDTA. C. Nepipetovat ústy. D. V pracovních laboratorních prostorách nejezte, nepijte a nekuřte. Při manipulaci se vzorky a s činidly ze soupravy noste ochranné rukavice na jedno použití, laboratorní pláště a prostředek pro ochranu očí. Po práci se vzorky a zkušebními činidly si důkladně umyjte ruce. E. Při odebírání alikvotních podílů z kontrolních lahviček dbejte na to, aby nedošlo k mikrobiální nebo ribonukleázové kontaminaci. F. Doporučuje se používat sterilní pipety na jedno použití a hroty na pipety prosté RNázy. G. Nemíchejte dohromady kontroly z různých šarží, ani z různých lahviček téže šarže. H. Nesmíchávejte kazety na činidla ani kontroly z různých souprav. I. Neotevírejte kazety COBAS AmpliPrep ani nevyměňujte, nemíchejte, neodstraňujte ani nepřidávejte láhve. J. Nespotřebovaná činidla, odpad a vzorky likvidujte v souladu s celostátními a místními předpisy. K. Po uplynutí data expirace již soupravu nepoužívejte. L. Bezpečnostní listy pro materiály (MSDS) zašle na vyžádání Vaše místní pobočka společnosti Roche. M. Manipulace se vzorky a kontrolami se musí řídit pravidly pro zacházení s infekčním materiálem. Musí být používány bezpečné laboratorní postupy, např. postupy uvedené v publikaci Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 19 a v dokumentu CLSI č. M29-A3 20. Všechny pracovní plochy důkladně očistěte a vydezinfikujte čerstvě připraveným roztokem 0,5%chlornanu sodného v deionizované či destilované vodě. N. CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0 obsahují lidskou plazmu pocházející z lidské krve. Zdrojový materiál byl testován a byl shledán nereaktivním na přítomnost povrchového antigenu hepatitidy B (HBsAg), protilátek proti HIV-1/2 a HCV a antigenu HIV p24. Testování negativní lidské plazmy metodami PCR neprokázalo žádné detekovatelné HIV-1 RNA, HCV RNA ani HBV DNA. Nicméně žádná známá testovací metoda nepředstavuje dokonalou záruku, že se s deriváty z lidské krve nepřenesou nějaká infekční agens. Proto je třeba považovat všechen materiál včetně CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0 za potenciálně infekční. O. EB, QS, Mn 2+ a MMX obsahují azid sodný. Ten může reagovat s olověným nebo měděným potrubím a vytvářet vysoce explozivní kovové azidy. Při likvidaci roztoků obsahujících azid sodný do laboratorního umyvadla propláchněte odtok velkým množstvím vody, abyste tak zabránili vytváření azidů. P. Při práci s jakýmkoliv činidlem používejte rukavice na jedno použití, pracovní oděv a ochranné brýle. Dbejte na to, aby se tyto materiály nedostaly do styku s pokožkou, očima nebo sliznicemi. Pokud ke styku dojde, okamžitě postiženou oblast omyjte velkým množstvím vody. Pokud by byla tato opatření zanedbána, může dojít k popáleninám. Jestliže se některá činidla rozlijí nebo rozsypou, rozřeďte je vodou a dosucha vytřete. Q. Dbejte na to, aby HCV QT v2.0 CS2 a tekutý odpad včetně použitých jednotek na zpracování vzorků (SPU) COBAS AmpliPrep v zařízení COBAS AmpliPrep, které obsahují guanidin thiokyanát, nepřišel do styku s roztokem chlornanu sodného (bělidlo). Ze směsi by se mohl uvolňovat vysoce toxický plyn. 05902754001-01CS 8 Doc Rev. 1.0

POŽADAVKY NA SKLADOVÁNÍ A MANIPULACI A. HCV QT v2.0 CS1, HCV QT v2.0 CS2, HCV QT v2.0 CS3 a HCV QT v2.0 CS4 skladujte při 2 8 C. Pokud jsou nepoužitá, jsou tato činidla stabilní až do vyznačeného data expirace. Po použití jsou při teplotě 2 8 C stálá ještě 70 dní nebo do data expirace, je-li tato doba kratší. HCV QT v2.0 CS1, HCV QT v2.0 CS2, HCV QT v2.0 CS3 a HCV QT v2.0 CS4 je možné v zařízení COBAS AmpliPrep použít maximálně po celkovou dobu 96 hodin. Činidla musí být mezi jednotlivými použitími uchovávána při teplotě 2 8 C. B. HCV H(+)C, v2.0, HCV L(+)C, v2.0 a CTM ( ) C uchovávejte při teplotě 2 8 C. Kontroly jsou stabilní až do vyznačeného data expirace. Po otevření je nutné nespotřebovanou část zlikvidovat. C. Skladujte klipy s čárovým kódem [HCV H(+)C, v2.0 Clip, HCV L(+)C, v2.0 Clip a HCV ( ) C, v2.0 Clip] při teplotě 2 30 C. D. PG WR skladujte při 2 30 C. Nepoužitý PG WR je stálý až do vypršení vyznačené doby expirace. Po otevření se uchovává při teplotě 2 30 C a za těchto okolností je stálé 28 dní (resp. do data exspirace, je-li tato doba kratší). DODÁVANÝ MATERIÁL COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV Quantitative Test, v2.0 HCV QT v2.0 CS1 (HCV kazeta s činidly pro magnetické skleněné částice) HCVQTV2 HCV QT v2.0 CS2 (HCV kazeta s lytickým činidlem) HCV QT v2.0 CS3 (HCV multičinidlová kazeta) HCV QT v2.0 CS4 (HCV kazeta na činidla specifická pro test) HCV H(+)C, v2.0 (HCV vysoce pozitivní kontrola) HCV L(+)C, v2.0 (HCV nízce pozitivní kontrola) CTM ( ) C [Negativní kontrola COBAS TaqMan (lidská plazma)] HCV H(+)C, v2.0 Clip (HCV klipy s čárovým kódem pro vysoce pozitivní kontrolu) HCV L(+)C, v2.0 Clip (HCV klipy s čárovým kódem pro nízce pozitivní kontrolu) HCV ( ) C, v2.0 Clip (HCV klipy s čárovým kódem pro negativní kontrolu) COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan Wash Reagent Promývací činidlo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan PG WR PG WR (Promývací činidlo COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan ) 05902754001-01CS 9 Doc Rev. 1.0

POTŘEBNÝ MATERIÁL, KTERÝ NENÍ SOUČÁSTÍ DODÁVKY Vybavení a software Zařízení COBAS AmpliPrep Analyzátor COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 Dokovací stanice (volitelně) Zařízení cobas p 630 (volitelně) Software AMPLILINK, verze 3.3 Datová stanice pro software AMPLILINK s tiskárnou Příručky k zařízení a softwaru: Aplikační příručka softwaru AMPLILINK verze 3.3 pro použití se zařízením COBAS AmpliPrep, analyzátorem COBAS TaqMan, analyzátorem COBAS TaqMan 48, analyzátorem COBAS AMPLICOR a zařízením cobas p 630 Příručka k přístroji pro zařízení COBAS AmpliPrep pro použití s analyzátorem COBAS TaqMan, analyzátorem COBAS TaqMan 48, analyzátorem COBAS AMPLICOR nebo zařízením cobas p 630 a softwarem AMPLILINK, verze 3.2 a 3.3 Příručka k přístroji pro analyzátor COBAS TaqMan (plus volitelná dokovací stanice) pro použití s provozní příručkou pro software AMPLILINK, verze 3.2 a 3.3 Příručka k přístroji pro analyzátor COBAS TaqMan 48 pro použití s provozní příručkou pro software AMPLILINK, verze 3.2 a 3.3 Příručka obsluhy cobas p 630 verze softwaru 2.2 (volitelně) Další potřebný materiál Stojan na vzorky (stojan SK24) Stojan na činidla Stojan SPU K-nosič Přemísťovač K-nosičů Stojan na K-nosiče Pipetory s aerosolovou bariérou nebo špičkami bez DNázy s přímým vypuzováním (objem 1 000 µl); pipetory musí být přesné na 3 % jmenovitého objemu. Musí být použity špičky s aerosolovou bariérou nebo s přímým vypuzováním bez RNázy, aby se zabránilo vzájemné kontaminaci vzorku a amplikonu. Rukavice na jedno použití bez pudru Vířivý mixér Spotřební materiál Jednotky pro zpracování vzorku (SPU) Vstupní zkumavky pro vzorek (S-zkumavky) s klipy s čárovým kódem Stojan s K-špičkami Krabice s K-zkumavkami v počtu 12 x 96 05902754001-01CS 10 Doc Rev. 1.0

ODBĚR, PŘEPRAVA A SKLADOVÁNÍ VZORKŮ POZN.: Zacházejte se vzorky a kontrolami jako s potenciálně infekčním materiálem. Odběr a skladování vzorků Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je určen pro použití se vzorky séra nebo EDTA plazmy. Krev se odebírá do zkumavek SST (sérové separační zkumavky), do zkumavek pro přípravu plazmy BD Vacutainer PPT pro diagnostické testovací metody nebo do sterilních zkumavek za použití EDTA (uzávěr levandulové barvy) jako antikoagulantu. Při manipulaci s odběrovými zkumavkami se řiďte pokyny příslušného výrobce. Čerstvě odebrané vzorky (plná krev) je možné před odstředěním skladovat při 2 25 C až 24 hodin. Sérum nebo EDTA plazmu přesuňte po centrifugaci do sterilní polypropylenové zkumavky. Doporučuje se vzorky uchovávat v alikvotních podílech přibližně po 1 000 µl ve sterilních polypropylenových zkumavkách o objemu 2,0 ml se šroubovacím uzávěrem (například 2ml zkumavka se šroubovacím uzávěrem od společnosti Sarstedt). Vzorky séra nebo EDTA plazmy se mohou uchovávat: Při teplotě 4 C až 72 hodin. Při teplotě -20 C až -80 C až 6 týdnů. Vzorky séra a EDTA plazmy mohou být zmraženy a rozmraženy maximálně pětkrát bez ztráty HCV RNA. Přeprava vzorků Při přepravě plné krve, EDTA plazmy nebo séra je třeba dodržovat celostátní resp. místní předpisy o přepravě etiologických látek 21. Plná krev se přepravuje za teplot 2 25 C a musí se odstředit do 24 hodin od odběru. EDTA plazma nebo sérum se může přepravovat při teplotě 2 8 C nebo ve zmrazeném stavu při teplotách -20 C až -80 C. NÁVOD K POUŽITÍ Podrobné provozní pokyny, popis možných konfigurací, výsledky tisku, interpretaci příznaků a poznámek a chybová hlášení naleznete v provozní příručce pro software AMPLILINK, verze 3.3, jak je uvedeno v části Vybavení a software. Velkost dávky a pracovní postup Každá souprava obsahuje dostatek činidel pro 72 testů, které mohou být provedeny v dávkách po 12 až 24 testech. Alespoň jedna z každé kontroly [CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0] musí být zahrnuta do každé dávky (viz část Kontrola kvality ). Cyklus analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 musí být zahájen do 240 minut po dokončení přípravy vzorku a kontroly. Zpracované vzorky a kontroly NEZMRAZUJTE ani NESKLADUJTE při teplotě 2 8 C. Příprava vzorku a kontroly Používáte-li vzorky zmrazené, tak je ponechte při pokojové teplotě, dokud kompletně nerozmrznou a nechte je 3 5 sekund vířit před použitím. Kontroly by měly být před použitím vyjmuty ze skladování při teplotě 2 8 C, vyrovnány na okolní teplotu a před použitím vířeny 3 5 sekund. Nastavení zařízení COBAS AmpliPrep Část A. Údržba a plnění A1. Zařízení COBAS AmpliPrep je připraveno k práci v pohotovostním režimu. A2. Zapněte datovou stanici pro software AMPLILINK. Připravte datovou stanici dle následujícího návodu: a. Přihlaste se k Windows XP. b. Dvakrát klikněte na ikonu softwaru AMPLILINK. c. Přihlaste se k softwaru AMPLILINK zadáním přiděleného uživatelského jména a hesla. 05902754001-01CS 11 Doc Rev. 1.0

A3. Zkontrolujte zásobu PG WR pomocí obrazovky Status a v případě potřeby jej doplňte. A4. Proveďte veškerou údržbu, jak je uvedeno v záložce Due. Zařízení COBAS AmpliPrep automaticky naplní systém. Část B. Plnění kazet s činidly POZN.: Všechny kazety s činidly by měly být vyjmuty ze skladovacího místa s teplotou 2 8 C, okamžitě vloženy do zařízení COBAS AmpliPrep a ponechány pro vyrovnání s okolní teplotou v zařízení po dobu minimálně 30 minut předtím, než bude zpracován první vzorek. Nenechejte kazety s činidly vyrovnat s teplotou mimo zařízení, protože by mohlo dojít ke kondenzaci na štítcích s čárovým kódem. Neotírejte kondenzát v případě, že se objeví na štítcích s čárovým kódem. B1. Vložte HCV QT v2.0 CS1 do stojanu na činidla. Vložte HCV QT v2.0 CS2, HCV QT v2.0 CS3 a HCV QT v2.0 CS4 do dalšího stojanu na činidla. B2. Zaveďte stojan na činidla obsahující HCV QT v2.0 CS1 do pozice stojanu A zařízení COBAS AmpliPrep. B3. Zaveďte stojan na činidla obsahující HCV QT v2.0 CS2, HCV QT v2.0 CS3 a HCV QT v2.0 CS4 do pozice stojanu B, C, D nebo E zařízení COBAS AmpliPrep (podrobné informace viz příslušné příručky pro zařízení). Část C. Plnění spotřebním materiálem POZN.: Stanovte počet kazet na činidla pro COBAS AmpliPrep, jednotek pro zpracování vzorků (SPU), vstupních zkumavek na vzorky (S-zkumavky), K-špiček a K-zkumavek, které budou potřeba. Jedna SPU, jedna vstupní S-zkumavka, jedna K-špička a jedna K-zkumavka jsou potřeba pro každý vzorek a kontrolu. Při použití zařízení COBAS AmpliPrep s analyzátorem COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 je možné mít více konfigurací. Podle použité konfigurace zaveďte příslušný počet stojanů s kazetami na činidla, stojanů se vzorky se vstupními S-zkumavkami, stojanů SPU, stojanů s K-špičkami, stojanů s K-zkumavkami a K-nosiči na stojanech pro K-nosiče do příslušných pozic stojanů zařízení COBAS AmpliPrep. C1. Umístěte SPU do stojanu(ů) SPU a zaveďte stojan(y) do pozice stojanu J, K nebo L zařízení COBAS AmpliPrep. C2. Podle použité konfigurace zaveďte plný(é) stojan(y) K-zkumavek do polohy stojanu M, N, O nebo P zařízení COBAS AmpliPrep. C3. Zaveďte plný(é) stojan(y) s K-špičkami do polohy stojanu M, N, O nebo P zařízení COBAS AmpliPrep. C4. Podle použité konfigurace zaveďte K-nosiče na stojanech pro K-nosiče do polohy stojanu M, N, O nebo P zařízení COBAS AmpliPrep. Část D. Objednávání a vkládání vzorků D1. Stojany na vzorky připravte následovně: připevněte klipy s čárovým kódem ke každé pozici stojanu na vzorky, kam je ukládán vzorek (S-zkumavka). Připevněte jeden ze specifických klipů s čárovým kódem pro kontroly [CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0] ke každé pozici stojanu na vzorky, do které budou kontroly (S-zkumavky) uloženy. Klipy s čárovým kódem by měly mít stejné číslo šarže kontroly, jako je číslo šarže na kontrolních lahvičkách v soupravě. Dbejte na to, abyste přiřadili správnou kontrolu k pozici s odpovídajícím kontrolním klipem s čárovým kódem. Vložte jednu vstupní S-zkumavku do každé pozice obsahující klip s čárovým kódem. D2. Pomocí softwaru AMPLILINK vytvořte příkazy pro každý vzorek a kontrolu v okně Orders na záložce Sample. Zvolte příslušný testový soubor a dokončete uložením. 05902754001-01CS 12 Doc Rev. 1.0

D3. Přiřaďte příkazy pro vzorek a kontrolu k pozici stojanu na vzorky v okně Orders a záložce Sample Rack. Číslo stojanu na vzorky musí být pro stojan připravený v kroku D1. D4. Vytiskněte zprávu Sample Rack Order pro použití jako pracovní tabulku. D5. Připravte stojany na vzorek a kontrolu na určeném místě pro přidávání vzorků a kontrol dle následujícího postupu: Vířením promíchejte každý vzorek a kontrolu [CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0] po dobu 3 až 5 sekund. Při manipulaci se vzorky a kontrolami zabraňte kontaminaci rukavic. D6. Přeneste 650 µl každého vzorku a kontroly [CTM ( ) C, HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0] do odpovídající vstupní S-zkumavky s čárovým kódem pomocí mikropipetoru s aerosolovou bariérou nebo špičkou bez RNázy s pozitivním posuvem. Zabraňte přenosu částic a/nebo fibrinových sraženin z originálního vzorku do vstupní S-zkumavky. Vzorky a kontroly by měly být přemisťovány do pozic na zkumavky, jak bylo určeno a zaznamenáno v pracovní tabulce v kroku D4. Klipy s čárovým kódem by měly mít stejné číslo šarže kontroly, jako je číslo šarže na kontrolních lahvičkách v soupravě. Přiřaďte správnou kontrolu k pozici s odpovídajícím klipem s čárovým kódem kontroly. Zabraňte kontaminaci horní části S-zkumavky vzorkem nebo kontrolami. D7. Jestliže používáte zařízení cobas p 630 pro přípravu vzorků, přečtěte si příručku obsluhy pro zařízení cobas p 630. D8. V závislosti na použité konfiguraci zaveďte stojan(y) na vzorky naplněné vstupními S-zkumavkami do pozic F, G nebo H zařízení COBAS AmpliPrep. D9. V závislosti na použité konfiguraci zaveďte stojan(y) na vzorky se vstupními S-zkumavkami a K-zkumavkami (jedna pro každou vstupní S-zkumavku, zavedené v pozici vpravo vedle vstupních S-zkumavek) do pozic F, G nebo H zařízení COBAS AmpliPrep. Část E. Spuštění cyklu zařízení COBAS AmpliPrep E1. Spusťte zařízení COBAS AmpliPrep pomocí softwaru AMPLILINK. Část F. Konec cyklu zařízení COBAS AmpliPrep a přesun do analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 (pouze pro manuální přenos) F1. Zkontrolujte příznaky a chybová hlášení. F2. Vyjměte zpracované vzorky a kontroly ze zařízení COBAS AmpliPrep na stojanech na vzorky (pro analyzátor COBAS TaqMan bez dokovací stanice) nebo na stojanech pro K-nosiče (pro analyzátor COBAS TaqMan 48), v závislosti na konfiguraci. F3. Odstraňte odpad ze zařízení COBAS AmpliPrep. POZN.: Žádné zpracované vzorky a kontroly by neměly být vystaveny světlu po dokončení přípravy vzorku a kontroly. Amplifikace a detekce Nastavení analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 Cyklus analyzátoru COBAS TaqMan nebo COBAS TaqMan 48 musí být zahájen do 240 minut po dokončení přípravy vzorku a kontroly. Zpracované vzorky a kontroly NEZMRAZUJTE ani NESKLADUJTE při teplotě 2 8 C. Část G. Zavedení zpracovaných vzorků G1. V závislosti na konfiguraci zařízení proveďte odpovídající kroky pro přemístění K-zkumavek do analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48: Část H. Spuštění cyklu analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 H1. Spuštění cyklu analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 v závislosti na použité konfiguraci. 05902754001-01CS 13 Doc Rev. 1.0

Část I. Ukončení cyklu analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 I1. Po dokončení cyklu analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48 vytiskněte výsledkový protokol. Zkontrolujte příznaky a chybová hlášení ve výsledkovém protokolu. Vzorky s příznaky a komentáři jsou interpretovány podle popisu v části Výsledky. Po odsouhlasení uložte data do archívu. I2. Vyjměte použité K-zkumavky z analyzátoru COBAS TaqMan nebo analyzátoru COBAS TaqMan 48. KONTROLA KVALITY Jedna COBAS TaqMan negativní kontrola, jedna HCV nízce pozitivní kontrola a jedna HCV vysoce pozitivní kontrola musí být zahrnuta do každé testové dávky. Dávka je platná v případě, že se neobjeví žádný příznak pro žádnou kontrolu [HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0 a CTM ( ) C]. Není rozhodující, na které pozici ve stojanu na vzorky jsou kontroly umístěny. Na výtisku výsledků zkontrolujte výskyt příznaků a poznámek pro ověření, zda je šarže platná. Negativní kontrola CTM ( ) C musí dát výsledek Target Not Detected. Je-li CTM ( ) C označeno jako neplatné, pak je celá dávka neplatná. Celý postup zopakujte (příprava vzorků a kontrol, amplifikace a detekce). Je-li CTM ( ) C trvale neplatná ve více dávkách, kontaktujte vašeho místního zástupce společnosti Roche pro technickou pomoc. Pozitivní kontroly Přiřazený rozsah pro HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0 je specifický pro každou šarži činidel a je uveden na čárovém kódu kazety s činidly pro kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. HCV RNA IU/ml pro HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0 musí spadat do daného předepsaného rozsahu. Jsou-li jedna nebo obě pozitivní kontroly označeny příznakem jako neplatné, je neplatná celá dávka. Celý postup zopakujte (příprava vzorků a kontrol, amplifikace a detekce). Jestliže leží titr HCV RNA u jedné nebo obou pozitivních kontrol soustavně mimo přiřazené rozmezí u mnoha šarží, obraťte se o technickou pomoc na místní zastoupení firmy Roche. VÝSLEDKY Analyzátor COBAS TaqMan nebo analyzátor COBAS TaqMan 48 automaticky stanovuje koncentrace HCV RNA pro vzorky a kontroly. Koncentrace HCV RNA je vyjádřena v mezinárodních jednotkách (IU) /ml. Software AMPLILINK: Stanovuje Ct pro HCV RNA a HCV QS RNA. Stanovuje koncentraci HCV RNA založenou na Ct hodnotách pro HCV RNA a HCV QS RNA a kalibračních koeficientech specifických pro danou šarži, které jsou poskytnuty na čárových kódech kazet. Zkontroluje, zda vypočtený počet kopií (IU/ml) HCV L(+)C, v2.0 a HCV H(+)C, v2.0 spadá do vymezeného rozmezí. 05902754001-01CS 14 Doc Rev. 1.0

Validace dávky: Zkontrolujte výsledkové okno softwaru AMPLILINK nebo výsledkový výtisk na přítomnost příznaků a komentářů, abyste se ujistili, že je dávka platná. Pro kontrolní objednávky je provedena kontrola pro stanovení, zda-li je hodnota IU/ml pro kontrolu v rámci specifikovaného rozsahu. Je-li hodnota IU/ml pro kontrolu mimo její rozsah, objeví se PŘÍZNAK, který označuje, že kontrola selhala. Dávka je platná v případě, že se neobjeví žádný příznak pro žádnou kontrolu [HCV L(+)C, v2.0, HCV H(+)C, v2.0 a CTM ( ) C]. Dávka není platná, pokud se u HCV kontrol objeví některý z následujících indikátorů: Negativní kontrola: Příznak Výsledek Interpretace NC_INVALID Invalid Neplatný výsledek nebo vypočítaný výsledek titru negativní kontroly není negativní, tj. není generován výsledek Target Not Detected. HCV nízce pozitivní kontrola: Příznak Výsledek Interpretace LPCINVALID Invalid Neplatný výsledek nebo vypočítaný výsledek titru nízce pozitivní kontroly není v přiřazeném rozmezí. HCV vysoce pozitivní kontrola: Příznak Výsledek Interpretace HPCINVALID Invalid Neplatný výsledek nebo vypočítaný výsledek titru vysoce pozitivní kontroly není v přiřazeném rozmezí. Pokud je dávka neplatná, je třeba celou dávku, tj. včetně přípravy vzorků a kontrol, reverzní transkripce, amplifikace a detekce, zopakovat. Interpretace výsledků: Pro platnou dávku zkontrolujte každý jednotlivý vzorek na přítomnost příznaků nebo komentářů ve výtisku výsledku. Platná dávka může zahrnovat platné i neplatné výsledky vzorků podle toho, zda se u jednotlivých vzorků objeví příznaky, resp. poznámky nebo ne. 05902754001-01CS 15 Doc Rev. 1.0

Výsledky vzorků se interpretují takto: Výsledek Interpretace Target Not Detected Ct hodnota pro HCV je nad hranicí testu nebo nebyla získána žádná Ct hodnota pro HCV. Výsledky nahlaste jako HCV RNA nedetekována. <1.50E+01 IU/mL Vypočtená hodnota IU/ml je pod spodním limitem kvantifikace (LLOQ) analýzy. Nahlaste výsledky jako HCV RNA detekována, méně než 15 IU/ml HCV RNA. 1.50E+01 IU/mL a 1.00E+08 IU/mL >1.00E+08 IU/mL Vypočítané výsledky větší než nebo rovny 15 IU/ml a menší než nebo rovny 1,00E+08 IU/ml jsou v lineárním rozmezí analýzy. Nahlaste výsledky jako XX IU/ml HCV RNA detekováno. Vypočtené výsledky leží nad lineárním rozmezím testu. Nahlaste výsledky jako vyšší než 1,00E+08 IU/ml HCV RNA. Jsou-li žádané kvantitativní výsledky, měl by být originální vzorek rozředěn HCV-negativním lidským sérem nebo EDTA plazmou v závislosti na matrix originálního vzorku a test by měl být zopakován. Vynásobte uvedený výsledek faktorem ředění. Pokud je zobrazený výsledek vzorku Failed, Invalid nebo Aborted, prostudujte si aplikační příručku pro software AMPLILINK verze 3.3, jak je uvedeno v části Potřebný materiál, který není součástí dodávky. POZN.: Vzorky nad rozsahem analýzy mohou také produkovat neplatný výsledek s indikátorem QS_INVALID. Jsou-li žádané kvantitativní výsledky, měl by být originální vzorek rozředěn HCV-negativním lidským sérem nebo EDTA plazmou v závislosti na matrix originálního vzorku a test by měl být zopakován. Vynásobte uvedený výsledek faktorem ředění. PROCEDURÁLNÍ OMEZENÍ 1. Tento test byl validován pro používání pouze s lidským sérem nebo plazmou odebranou do EDTA jako antikoagulantu. Testování jiných typů vzorků může vést k nepřesným výsledkům. 2. I když vzácně, mutace ve vysoce konzervovaných oblastech virového genomu pokryté primery testu a/nebo sondami mohou vést k podhodnocení množství nebo selhání detekce viru. 3. Kvantifikace HCV RNA závisí na tom, kolik virových částic je ve vzorku přítomno, na což mají vliv metody odběru vzorku, faktory pacienta (např. věk, symptomy) a/nebo stádium infekce. 4. K získání spolehlivých výsledků je třeba dodržovat příslušné postupy odběru, transportu, skladování a zpracování vzorků. 5. Díky přítomnosti enzymu AmpErase v Master Mixu pro test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV se snižuje riziko kontaminace amplikonu. Kontaminaci od HCV pozitivních kontrol a klinických vzorků lze ovšem zabránit pouze důsledným uplatňováním zásad správné laboratorní praxe a pečlivým dodržováním postupů uvedených v tomto příbalovém letáku. 6. S tímto výrobkem mohou pracovat pouze pracovníci proškolení pro práci se zařízením cobas p 630 (volitelně), zařízením COBAS AmpliPrep a analyzátorem COBAS TaqMan nebo analyzátorem COBAS TaqMan 48. Obsluha musí dobře znát aplikace běžící na zařízeních a musí uplatňovat zásady správné laboratorní praxe. 7. Tento výrobek se smí používat pouze se zařízením cobas p 630 (volitelně), zařízením COBAS AmpliPrep a analyzátorem COBAS TaqMan nebo analyzátorem COBAS TaqMan 48. 8. Díky podstatným rozdílům mezi technologiemi se doporučuje, aby uživatelé před změnou technologie na jinou provedli korelační metodické studie ve vlastní laboratoři a kvantifikovali rozdíly mezi technologiemi. 05902754001-01CS 16 Doc Rev. 1.0

INTERFERUJÍCÍ LÁTKY Zvýšené hladiny triglyceridů (3 300 mg/dl), konjugovaného bilirubinu (25 mg/dl) a nekonjugovaného bilirubinu (20 mg/dl), albuminu (6 000 mg/dl), hemoglobinu (200 mg/dl) a lidské DNA (40 mg/dl) ve vzorcích a také přítomnost autoimunních onemocnění jako je systémový lupus erythematodes (SLE), revmatoidní artritida (RA) a antinukleární protilátky (ANA) neinterferují s kvantifikací HCV RNA v kvantifikačním testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Následující složky léčiv testované při maximální plazmatické hladině (C max ) a při trojnásobné C max nevykázaly interferenci s kvantifikací HCV RNA pomocí kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0: Nukleotidové inhibitory reverzní transkriptázy a DNA polymerázy Tenofovir Adefovir dipivoxil Inhibitory HIV proteázy Atazanavir Saquinavir Ritonavir Lopinavir/Ritonavir Nelfinavir Darunavir Tipranavir Fosamprenavir Inhibitory HIV fúze Enfuvirtid Látky pro léčbu herpetických virů Gancyklovir Valgancyklovir Acyklovir Inhibitor HIV integrázy Raltegravir Nenukleozidové inhibitory reverzní transkriptázy Efavirenz Nevirapin Nukleozidové inhibitory reverzní transkriptázy Lamivudin Zidovudin Stavudin Abacavir Didanosin Emtricitabin Entekavir Telbivudin Inhibitory vstupu HIV Maraviroc Imunomodulátory Peginterferon alfa-2b Ribavirin Peginterferon alfa-2a 05902754001-01CS 17 Doc Rev. 1.0

VYHODNOCENÍ LABORATORNÍCH VÝSLEDKŮ A. Mez detekce Detekční limit kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 byl stanoven analýzou sérií ředění Mezinárodního standardu WHO pro RNA viru hepatitidy C pro analýzy nukleových kyselin pomocí amplifikační technologie, genotyp 1a, získaný od NIBSC, u HCV negativní lidské EDTA plazmy nebo séra. Pro každou základní složku byly analyzovány tři nezávislé série ředění. Celkově až 252 replikátů na hladinu koncentrace bylo testováno pro každý typ matrix. Studie byla provedena s použitím tří šarží činidel kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Výsledky pro EDTA plazmu a sérum jsou vyobrazeny v tabulkách 1 a 2 a ukazují, že kvantifikační test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 detekoval HCV RNA při koncentracích 15 IU/ml nebo vyšších s úspěšností detekce 95 %. Rozdíl mezi sérem a EDTA plazmou nebyl statisticky významný. Tabulka 1 Detekční limit v EDTA plazmě stanovený Mezinárodním standardem WHO pro RNA viru hepatitidy C pro analýzy nukleových kyselin pomocí amplifikační technologie Vstupní titr (HCV RNA IU/ml) platných replikátů pozitivních Úspěšnost detekce v % 50 251 251 100 25 251 250 100 15 251 246 98 10 252 236 94 5 252 180 71 2,5 251 121 48 0 250 0 0 LOD podle PROBIT při 95% úspěšnosti detekce LOD podle úspěšnosti detekce 11 IU/ml 95% interval spolehlivosti: 10 13 IU/ml 15 IU/ml Tabulka 2 Detekční limit v séru stanovený Mezinárodním standardem WHO pro RNA viru hepatitidy C pro analýzy nukleových kyselin pomocí amplifikační technologie Vstupní titr (HCV RNA IU/ml) platných replikátů pozitivních Úspěšnost detekce v % 50 188 188 100 25 189 188 99 15 189 185 98 10 189 172 91 5 189 140 74 2,5 189 92 49 0 189 0 0 LOD podle PROBIT při 95% úspěšnosti detekce LOD podle úspěšnosti detekce 12 IU/ml 95% interval spolehlivosti: 10 14 IU/ml 15 IU/ml 05902754001-01CS 18 Doc Rev. 1.0

B. Přesnost Přesnost kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 byla stanovena analýzou sérií ředění klinických vzorků HCV (genotyp 1a) nebo Armored HCV RNA (arna) v HCV negativní lidské EDTA plazmě nebo séru. Bylo testováno šest hladin ředění ve třech replikátech na každou hladinu ve 12 dávkách ve 4 dnech. Každý vzorek prošel celou procedurou kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 zahrnující přípravu vzorku, amplifikaci a detekci. Studie byla provedena s použitím tří šarží činidel kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 a výsledky jsou vyobrazeny v tabulce 3. Kvantifikační test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 vykazuje dobrou přesnost u tří šarží činidel v rozsahu koncentrací 3,0E+02 IU/ml až 1,0E+08 IU/ml. Tabulka 3 Přesnost kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 (vzorky EDTA plazmy a séra)* Nominální koncentrace [IU/ml] Plazma s EDTA Celková přesnost jako SD [Log 10 ] Sérum Šarže 1 Šarže 2 Šarže 3 Šarže 1 Šarže 2 Šarže 3 3,0E+02 0,22 0,07 0,09 0,07 0,05 0,09 3,0E+03 0,15 0,07 0,07 0,06 0,06 0,06 3,0E+04 0,06 0,05 0,07 0,05 0,07 0,08 3,0E+05 0,08 0,07 0,08 0,05 0,05 0,04 3,0E+06 0,14 0,04 0,07 0,11 0,06 0,07 1,0E+08 0,07 0,05 0,11 0,07 0,06 0,08 * Titry jsou považovány za log-normálně distribuované a jsou analyzovány po Log 10 transformaci. Ve sloupcích 2 7 je celková směrodatná odchylka (SD) log-transformovaného titru pro každou ze tří šarží činidel. C. Lineární rozmezí Dva panely linearity byly použity pro hodnocení lineárního rozsahu kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Tyto panely se skládaly z ředění v EDTA plazmě nebo séru pozitivních klinických vzorků HCV RNA pro dolní a střední část dynamického rozmezí (až 3,0E+05 IU/ml) a Armored HCV RNA pro horní část dynamického rozmezí (až 2,0E+08 IU/ml). Studie byla provedena s dvěma šaržemi činidel kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 podle metod definovaných v CLSI EP6-A 22. Všech 11 členů panelu pro EDTA plazmu a všech 14 členů panelu pro sérum byly testovány u 16 replikátů na hladinu koncentrace, matrix a šarži činidla. Kvantitativní test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 je lineární od 15 HCV RNA IU/ml až po alespoň 1,0E+08 HCV RNA IU/ml při použití přijatelné absolutní odchylky od linearity +/- 0,2 log 10 (viz typické výsledky v obrázku 1 a 2). V lineárním rozmezí testu je přesnost testu +/- 0,2 log 10. 05902754001-01CS 19 Doc Rev. 1.0

Obrázek 1 Stanovení lineárního rozmezí pro vzorky EDTA plazmy u kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 Log 10 sledovaného titru [IU/ml] 8 6 4 2 R 2 = 0,9991 0 0 2 4 6 8 Log 10 přiřazeného titru [IU/ml] Regresní vykreslení ukazuje průměrné pozorované výsledky vzorků u klinických vzorků (plný kosočtverec) a vzorků arna (prázdný kosočtverec) zanesený vůči přiřazenému log 10 titru. Regresní linie (tučně, od 11 to 1,1E+08 IU/ml) je zobrazena spolu s linií shody (šedě), aby tak bylo možné graficky zobrazit lineární chování testu. Směrodatná odchylka log 10 titru je zobrazena jako chybové úsečky; je zobrazena hodnota R 2. Obrázek 2 Stanovení lineárního rozmezí pro vzorky séra u kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 Log 10 sledovaného titru [IU/ml] 8 6 4 2 R 2 = 0,999 0 0 2 4 6 8 Log 10 přiřazeného titru [IU/ml] Regresní vykreslení ukazuje průměrné pozorované výsledky vzorků u klinických vzorků (plný kosočtverec) a vzorků arna (prázdný kosočtverec) zanesený vůči přiřazenému log 10 titru. Regresní linie (černá, od 11 do 1,2E+08 IU/ml) je zobrazena spolu s linií shody (šedě), aby tak bylo možné graficky zobrazit lineární chování testu. Směrodatná odchylka log 10 titru je zobrazena jako chybové úsečky; je zobrazena hodnota R 2. 05902754001-01CS 20 Doc Rev. 1.0

D. Inkluzivita Výsledky kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 u genotypů HCV byly vyhodnoceny (i) verifikací meze detekce u genotypů 1 až 6 a (ii) verifikací lineárního rozmezí u genotypů 1 až 6. Verifikace meze detekce u genotypů 1 až 6 Klinické vzorky HCV RNA 8 různých genotypů/subtypů (1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 a 6) byly rozředěny na tři různé hladiny koncentrace v EDTA plazmě nebo séru a u každé hladiny byla stanovena míra úspěšnosti detekce s až 70 replikáty. Studie byla provedena s použitím jedné šarže činidel kvantifikačního testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0. Výsledky pro EDTA plazmu a sérum jsou vyobrazeny v tabulkách 4 a 5 a jsou důkazem, že kvantifikační test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan HCV, v2.0 detekoval HCV RNA u 8 různých genotypů/subtypů při koncentracích 15 IU/ml nebo vyšších s úspěšností detekce 95 %. Rozdíl mezi sérem a EDTA plazmou nebyl statisticky významný. Tabulka 4 Verifikace meze detekce u genotypů HCV RNA v EDTA plazmě Genotyp platných replikátů 5 IU/ml 15 IU/ml 45 IU/ml Úspěšnost detekce pozitivních v % platných replikátů Úspěšnost detekce pozitivních v % platných replikátů Úspěšnost detekce pozitivních v % 1a 63 44 70 63 63 100 63 63 100 1b 63 47 75 63 62 98 63 63 100 2a 63 43 68 63 61 97 62 61 98 2b 62 57 92 62 62 100 62 62 100 3 62 58 94 63 63 100 62 62 100 4 63 43 68 63 62 98 63 63 100 5 63 47 75 62 62 100 62 62 100 6 63 55 87 63 62 98 63 63 100 Genotyp platných replikátů Tabulka 5 Verifikace meze detekce u genotypů HCV RNA v séru 5 IU/ml 15 IU/ml 45 IU/ml Úspěšnost detekce pozitivních v % platných replikátů Úspěšnost detekce pozitivních v % platných replikátů Úspěšnost detekce pozitivních v % 1a 63 45 71 62 62 100 63 63 100 1b 62 48 77 63 63 100 63 63 100 2a 63 47 75 61 60 98 63 63 100 2b 63 42 67 63 61 97 63 63 100 3 63 58 92 63 63 100 63 63 100 4 63 41 65 63 62 98 63 63 100 5 62 46 74 61 60 98 62 62 100 6 70 58 83 70 69 99 69 69 100 05902754001-01CS 21 Doc Rev. 1.0