Analýza organckých sloučenn 16.11. 2010 Jan Presler, Jří Pazourek Vybrané separační technky v organcké analýze Extrakce (l-l) Plynová chromatografe (GC) Kapalnová chromatografe (LC) Elektromgrační metody kaplární elektroforéza (CE) gelová elektroforéza (GE)... podrobný kurs: J. Havlš: Separační metody Volba extrakčního systému Faktory: povaha analytu a fází: vzáemné nterakce elektrostatcká vazba: on-on; dpól-dpól, on-dpól H můstky: zvláštní příklad elektrostatcké vazby; solvatace chemcká vazba: koordnačně-kovalentní Extrakční čndlo: nepolární, polární, ontové Vysolovací čndlo: přídavek sol snžue delektrckou konstantu a váže rozpouštědlo v solvatační sféře Analyt: polární látka...extrakční čndlo musí být rozpouštědlo polárněší než rozpouštědlo vzorku. A obráceně Tvorba komplexů, asocátů, dmerzace, polymerace 4 EXTRAKCE l - l (kapalna - kapalna) rovnovážný stav látky v systému dvou nemístelných kapaln (dvou fází) obvykle konvence: - fáze I: vodná (w), rozpouštědlo obsahuící vzorek - fáze II: organcká (o), extrakční čndlo K D : rozdělovací (dstrbuční) konstanta poměr aktvt dané formy látky ve fáz o a w ( a) II lm [A] II KD (a) ca 0 [A] I I 2 Klasfkace rozpouštědel dle hlavní nterakce dsperzní nterakce v nepolární kapalně, ndukované dpóly, polarzovatelnost, slabé síly (např. CCl 4, benzen) dpól-dpól kapalna s permanentním dpóly, polární; (např. voda, alkoholy, kyselny) H-můstky zvláštní případ slné dpól-dpólové nterakce ndukční ndukované dpóly, solvatace permanentním dpóly (I 3- ) vazba on-ndukovaný dpól (např. voda, amonak, alkoholy) 5 D: rozdělovací poměr poměr celkových koncentrací látky (ve všech formách) D= c A II c A I D m : hmotnostní rozdělovací koefcent D m = (m A ) II = D V II (m A ) I V I E: výtěžek, účnnost extrakce n II D m E= n II = = n 0 n I +n II D m +1 R 1 0.5 Permtvta rozpouštědel místelná s vodou ε nemístelná s vodou voda 78 ntrobenzen 35 metanol 32 amylalkohol 15.8 1-propanol 21 etylacetát 6 pyrdn 12 metylzobutylketon doxan 2.2 chloroform 5 ε 13 benzen 2.2 hexan 1.9 0 0.01 0.1 1 10 100 D m 3 6 1
Provedení extrakce dskrétní extrakce ednorázová, vícenásobná (opakovaná) kontnuální extrakce Rychlost extrakce 1) maxmalzace plochy rozhraní 2) mnmalzace transportní vzdálenost z obou fází Protřepávání (vznk emulze může prodloužt rozdělení fází) Rozpouštědla vzáemně nemístelná, navzáem však částečně rozpustná. Použtí rozpouštědel předem nasycených zabrání změnu obemu oprot obemu před protřepáním. 1903 Mchal S. Cvět Hstore chromatografe Dělení rostlnných pgmentů na skleněné koloně naplněné CaCO 3 s použtím organckých rozpouštědel Oddělené barevné zóny... název chromatografe M. Tswett, Trav. Soc. Nat. Varsove, 6 (1903) 14 D.T. Day separace ropných komponent D.T. Day, Proc. Am. Phl. Soc., 36 (1897) 112 7 10 Analyt: M n+ Příklad: tvorba nepolárního komplexu (w) Lgand: HL (o, w) HL L - + H + Komplex: ML n (o) M(H 2 O) m n+ + nl - ML n + m H 2 O Podmíněná konstanta stablty (K D = f ([H + ]) K D = f ([H + ], chelatotvorné čndlo) Chromatografe Vzorek (nebo extrakt vzorku) převeden (rozpuštěn) do moblní fáze, což e plyn u GC a kapalna u LC. Moblní fáze (MF) e pak tlačena (obvykle přetlakem) skrze nepohyblvou a nemístelnou staconární fáz (SF). Obě fáze sou vybrány tak, že složky vzorku (=analyty) maí různou afntu k SF. Složka vzorku, která má k SF větší afntu, stráví v SF delší dobu a potřebue tak více času k průchodu kolonou než složka, která není v SF přílš zadržována a zdržue se převážně v MF. Důsledkem této rozdílné rychlost průchodu kolonou e separace (= oddělení) těchto složek po průchodu kolonou. 8 11 Klasfkace separačních technk Dle prncpu chromatografcké LC, GC elektromgrační - E Dle účelu preparatvní analytcká Dle fáze plynná - GC kapalná LC, E Dle provedení kolonové planární Chromatografe Technky ako GC (a HPLC) používaí kolony, úzké trubce plněné staconární fází, přes kterou e tlačena moblní fáze. Vzorek e kolonou nuceně transportován postupným přtékáním MF. Tento proces se nazývá eluce. Průměrná rychlost, kterou sa vzorek pohybue kolonou, e určena dobou, kterou vzorek stráví v SF a MF. Retence e míra zadržování analytu ve SF. Chromatografe nepatří mez absolutní analytcké separační metody, tzn. základní charakterstka kvalty analytu, t. retenční čas (obem) není ednoznačnou dentfkací; vždy e musíme srovnávat se standardem hledané látky nebo potvrdt specfckou detekční metodou. 9 12 2
Vyhodnocení chromatogramu Pro kvaltatvní (separační) účely nás zaímá, zda se složky vzorku oddělly. Pokud chceme toto oddělení popsat kvanttatvně, musíme zavést některé velčny popsu chromatogramu: doba mez nástřkem analytu a okamžkem, kdy analyt dosáhne detektor (umístěný za kolonou), se nazývá retenční (eluční) čas t R. Pokud dode k rozdělení analytů (o to se většnou snažíme), každý analyt ve vzorku (směs) bude mít různý retenční čas. Čas, kdy od okamžku nástřku dode k detektoru MF (tedy nezadržovaná složka), se nazývá mrtvý čas t M. Protože složky procházeí kolonou a přcházeí do detektoru ako zóny s nevětší koncentrací uprostřed, záznamem detektoru e nečastě chromatografcký pík. Separační faktor a = k 2 /k 1 Udává selektvtu separace, relatvní retenc dvou analytů. a = 1,0: píky se překrývaí a > 1,0: dochází k separac píků a = 1,4: dochází k úplné separac píků (na základní ln) 13 16 Chromatogram Účnnost Charakterzue schopnost kolony produkovat úzké zóny analytu, souvsí s rozlšením Počet teoretckých pater, N Výškový ekvvalent teoretckého patra, H H = L/N délka kolony, L Maxmum píku (sgnálu) souvsí s maxmem koncentrace zóny a v maxmu píku obvykle odečítáme retenční čas. t R a t M se tedy získaí z grafckého záznamu sgnálu detektoru na čase = z chromatogramu (vz obrázek) Pro Gaussovský pík w 1/2 = 2.354s nebo w = 4s N = (t R /s) 2 = 5,545(t R / w 1/2 ) 2 = 16(t R / w) 2 14 17 Retenční faktor, k Rozlšení k = (t R -t M )/t M k = n S /n M Stupeň separace mez přlehlým píky Udává, do aké míry se sousední píky překrývaí Vz www.chromeda.org Udává relatvní retenc analytu (), poměr množství analytu v SF a MF k = 0: analyt nenterague se SF, stráví v ní nulový čas R, 2 ( tr, tr, ) 2 tr w w w w k = 1: analyt stráví steně dlouhou dobu v MF a SF k = 3: analyt stráví 3x delší dobu v SF než v MF a bude eluován z kolony ve 4-násobku t M R, n a 1,. 4 a,. 1 k k 15 18 3
Plynová chromatografe (GC) Tenkovrstvá chromatografe (TLC) ednoduchá, rychlá a často používaná chromatografcká metoda sloužící např. k rychlé kontrole čstoty separovaného analytu typ kapalnové chromatografe (LC) chromatografe v otevřené koloně, když na tenké vrstvě e podstatně méně staconární fáze, a tudíž analýza na tenké vrstvě může být velm rychlá v porovnání s kolonou 19 22 Kapalnová chromatografe (LC) rozdělovací kapalnová chromatografe (LLC) - SF e vrstvčka kapalny zachycena na tuhém nosč - mnohonásobná kapalnová extrakce a reextrakce řízené rozdělovací konstantou K(D) adsorpční kapalnové chromatografe (LSC) - analyt adsorbován na staconární fáz - proces e řízen adsorpční zotermou chromatografe nadkrtckým tekutnam (SFC) ontově výměnná chromatografe (IEC) - výměna ontů na onexech afntní chromatografe (AC) - specfcká nterakce 20 TLC vyvíení probíhá obvykle v uzavřené komoře (atmosféra nasycená param moblní fáze), kde chromatografcká deska stoí smočena ve vrstvě moblní fáze, která vzlíná vzhůru vyvíení ukončíme dříve, než čelo MF dosáhne konce desky 23 Schéma kapalnové chromatografe TLC Nanášíme 0,1% až 5% roztoky v množství 200 nl až 20 μl do skvrn o průměru 2 až 6 mm Charakterstkou skvrny e poměr d /d m. Vzorky rozpuštěné v těkavém rozpouštědle se nanáší na start Všechny nanesené látky se musí obevt mez startem a čelem rozpouštědla. 21 24 4
TLC Staconární fáze sou naneseny na skleněných deskách nebo ednoduše na hlníkových fólích (ty se daí stříhat). Tenké vrstvy mohou obsahovat fluorescenční ndkátor UV 254nm k usnadnění detekce analyzovaných látek (nepřímá detekce). Používaí se praktcky všechny staconární fáze ako pro kolonovou chromatograf se zrntostí 5 až 40 μm: oxd hlntý, slkagel, celulóza, ontoměnče, polyamd a slkagel s -C 18, -NH 2 nebo -CN skupnam. Moblní fáze: cyclohexan, toluen, chloroform, dchlormetan, aceton, ethanol, methanol, voda, amonak, kyselna octová a ech směs. 25 Schéma chromatografu (HPLC) Dávkovací smyčka Vysokoúčnná kapalnová chromatografe Hgh-performance lqud chromatography (HPLC) Dnes se praktcky výlučně používá kolonové chromatografe za vysokého tlaku P pumpa kolona detektor odpad zapsovač 28 Detekce v TLC Vzualzace skvrn - kys. sírová, teplo - barvení Ce, I 2 a. - UV osvětlení - specfcká čndla pro třídy analytů, např. nnhydrn pro amny Denztometre V současnost běžné skenery a patřčný software 26 Kapalnová chromatografe Retence - dynamcký process, analyt soutěží s molekulam rozpouštědla, rovnováhy Adsorpce - hydrofobní nterakce (reversní fáze, RPHPLC) - ontové nterakce (onexová chromatografe, např. SCX) - polární (dpól-dpól) nterakce (normální fáze) - gelová fltrace (sze excluson) - afnta Kolony - 4,6; 3; 2,1 a 1 mm průmyslový standard, průtok: μl - ml/mn - 75-300 μm plněné kaplární kolony, velkost částc: 0.5-5 μm průtok: nl μl/mn - 10-100 μm monoltcké kolony v křemenné kapláře 29 Vysokoúčnná chromatografe na tenké vrstvě (HPTLC) Lepší techncké provedení s rezervoáry MF HPTLC vs. TLC tenčí vrstva sorbentu 0,20 vs. 0,25 mm menší průměr zrna 7 vs. 12-20 μm a lepší dstrbuc průměru zrn vyšší rozlšení na kratší d m ; 50 mm vs. 100-120 mm rychleší analýza lepší optcké vlastnost pro denztometr vodvost ndex lomu absorbance crkulární dchrosmus amperometre, potencometre fluorescence hmotnostní spektrometre NMR AES, AAS... atd. Detekce v LC 27 30 5
RP HPLC Gradentová eluce, např: - start: 10% org fáze + 90% vodné fáze - konec: 60% org fáze + 40% vodné fáze - organcká fáze: ACN (acetontrl) + 0.1% TFA (kyselna trfluoroctová) - vodná fáze: 0.1% TFA Organcký solvent přspívá k rozpustnost peptdů, umožňue detekc v UV (230 240 nm) a rychle se vypařue. TFA... ontově párovací reagent Standardní technka kolonové separace pro peptdy a proteny Domnantní kolonová separační technka Dvourozměrná gelová elektroforéza (2D GE) 1. rozměr Izoelektrcká fokusace (IEF) na moblzovaném ph gradentu separace protenů podle pi rozlšení cca. 0,02 pi 2. rozměr SDS elektroforéza separace protenových komplexů s SDS podle m konstantní poměr m/z (1.4 g/1g of proten) rozsah m cca 10-300 kda Vhodná pro separac až desettsíců protenů, v případě velm ednoduchých směsí stačí 1D GE Zhruba 5% protenů a 30% peptdů mgrue anomálně, např. s PTM 31 34 Elektromgrační separační metody Př.: 2D PAGE ldské plazmy Lmtní ontová moblta, m = v/e (m 2 V -1 s -1 ) - pro c -> 0 - elektrcká síla = třecí síla, khv = qe - pro sfercké částce m = q/(6phr) Kohlraushova regulační funkce - Σ c z /m = konst. - zcela ný prncp než v případě chromatografe 32 Zdro: Expasy 35 Elektromgrační separační metody Klasfkace dle prncpu - zónová elektroforéza - zoelektrcká fokusace - zotachoforéza - gelová elektroforéza, 1- a 2- rozměrná - elektrochromatografe Provedení - planární (gel, papír a.) - ve sloupc/koloně/kapláře Kaplární elektroforéza Mgrace v elektrckém pol (Kohlraushova regulační funkce) Různé provedení (křemenná kaplára, <100 mm) - CZE, kaplární zónová elektroforéza - CIEF, kaplární zoelektrcká fokusace - CITP, kaplární zotachoforéza - CGE, kaplární gelová elektroforéza - CEC, kaplární elektrochromatografe Vlastnost - vysoce účnná, rychlá, ednoduchá separační technka - osvědčená např. pro sekvenování DNA - potencál pro separac peptdů a protenů (x adsorpce, elmg. dsperze...) 33 36 6
Analytcké čpy (čp, mkročp, mcrofludc devce, mcrofabrcated devce) Lab on a chp ntegrace více kroků (dávkování, příprava, separace...) paralelní analýzy (opakuící se motv na ednom čpu) nízká cena čp na edno použtí (př sérové výrobě) Základní typy: 1. Fludní systém (čpy s kanálky) - systémy ntegruící několk kroků - systémy pro paralelní analýzu 2. 2D pole - afntní pole, pole pro sekvenování - pole valek se špčkam pro ESI MS 37 Příklady analytckých čpů Aglent/Calper 38 Čp pro HPLC-MS: zakoncentrování vzorku, RPLC a ESI Prototype chp/valve setup Flud connectons 6 port rotary valve Rotor Stator Sde Vew Top vew Waste Sample n Sample enrchment column Top Vew Nano LC Pump LC Column Nanoelectrospray tp 39 7