Předmět: Bi 8360 Molekulární diagnostika mikroorganismů Diagnostika prionů 2014 Vladislava Růžičková
Prion "proteinaceous infectious particle proteinová infekční částice Prion (PrP Sc -patologická forma prionového proteinu (PrP C ). Stanley Prusiner - 1997 Nobel Prize
PRIONY - obecné vlastnosti PrP Sc jsou to izoformy standardních proteinů PrP C vyznačující se změněnou konformací (vzniklou konverzí) navozující v buňce jejich autonomní zmnožování PrP Sc mohou vznikat též jako translační produkty kódované mutantními alelami chromozomových genů; tyto produkty se mění spontánně v izoformu schopnou se zmnožovat. Výskyt v: savčích buňkách kvasinkách vláknitých houbách
Vlastnosti prionů v buňkách 1. Vyznačují se přenositelností z buňky do buňky. Přenos: infekcí (u savců), cytodukcí (u kvasinek) a anastomózou, tj. splynutí hyf u vláknitých hub 2. Ovlivňují fenotyp buňky, nikoli její genotyp 3. Prion, který je produktem mutantní alely,má stejný účinek na fenotyp buňky jako prion získaný cestou přenosu z jiné buňky. 4. Priony jsou z cytoplazmy vratně odstranitelné mohou se v buňce, ze které byly odstraněny, opět spontánně objevit. 5. Tvorba agregátů
Vznik prionů a příklady prionových onemocnění u lidí STEPHEN J. DEARMOND/UNIVERSITY OF CALIFORNIA, SAN FRANCISCO, AND JEFFREY H. KORDOWER/RUSH UNIVERSITY
TSE transmisivní spongiformní encefalopatie u savců způsobené priony PrP Sc způsobují prionózy- neurodegenerativní změny v mozku astrocytech a v mikrogliích člověka a některých druhů savců Dlouhá inkubační doba (měsíce až roky), pak prudký průběh, kóma a smrt. KURU u etnika Fore na Nové Guineji Creutzfeldtova-Jakobova nemoc (CJD) Nová forma (vcjd) (v 1996) (humánní( BSE) Fatální familiáln lní insomnie (FFI ) Gerstmannův- Sträussler usslerův- Scheinkerův syndrom (GSS) Není humorální nebo celulární imunologická odezva
Forma FORMY PRIONÓZ U LIDÍ Expozice TSE agens? Typy Mutace v genu PrP? Sporadická Ne CJD, FFI Ne Familiální/ Geneticky podmíněná Ne Familiální CJD, GSS, FFI Ano Infekční/ iatrogenní Ano Kuru, Varianta CJD Ne
Creutzfeldtova-Jakobova nemoc (CJD) tvoří 85 % všech prionóz Celosvětová incidence 1 2 případy/ milion obyvatel/rok ve věku nad 65 let. Průměrné trvání nemoci je 8 měsíců. 85 90 % pacientů umírá do 1 roku od klinické manifestace, jen 4 % přežívají do 2 let. Obě pohlaví jsou postižena stejně. Prevalence 3 typů CJD 1. sporadická nejvíce případů (příčina je neznámá) 2. genetická (10-15 %, polymorfismus v genu prpn v oblasti kodonu 129, methionin nebo valin) 3. náhodně přenesená (5 %) Heterogenní klinický obraz s mnohočetným deficitem Pacienti obvykle umírají na pneumonii
Diagnostická kriteria WHO pro scjd z roku 2002 Diagnóza scjd možná Rychlý průběh demence (kratší než 2 roky)+ 2 další příznaky: Myoklonie (záškuby svalů); zrakové/mozečkové projevy; pyramidové příznaky; akinetický mutismus (psychicky podmíněná němota) Diagnóza pravděpodobná Klinický obraz jako výše uvedeno plus znaky: Přítomnost proteinu 14-3-3 v likvoru Typické EEG projevy (periodicky se opakující generalizující trifazické nebo polyfazické vlny) Diagnóza scjd jistá Průkaz patogenního prionu v mozkové tkáni Histologický nález (spongiformní dystrofie, atrofie neuronů a glióza) Imunohistochemický nález (použití protilátek prokazujících výskyt prionu ve tkáni) Westernův přenos (WB) (specifický průkaz prionu) Genetické vyšetření (určení polymorfismu kodonu 129 genu Prnp)
Priony v těle člověka
D i a g n o s t i k a TSE Není možnost 100% diagnózy in vivo KLINICKÁ DIAGNÓZA: symptomatologie Onemocnění CJD se projevuje ve věku 55 70 let. U CJD je typickým projevem rychle postupující demence spojené s poruchami pohybové činnosti, ztrátou paměti a stavy zmatenosti, jako důsledek degenerativních změn v mozkové tkáni. Proto je většinou rozpoznána až v značně pokročilém stádiu nemoci. U vcjd jsou charakteristickými znaky: raný věk 19-39 let psychické projevy - úzkost, deprese, nechtěné svalové kontrakce a zhoršená svalová koordinace neuropatologické spongiformní změny, ztráta neuronů, zbytnění gliové tkáně (patrno v bazálních gangliích a v thalamu).
Charakteristika CJD ve srovnání s vcjd Charakteristika Klasická CJD Varianta CJD Věk úmrtí 68 let 28 let Doba trvání nemoci 4-5 měsíců 13-14 měsíců Klinické symptomy Demence, časné neurologické projevy Specifický nález na MR Přítomen Přítomen Psychiatrické projevy, pozdější neurologické poruchy, senzorické halucinace Specifický nález na EEG Imunohistochemie mozkové tkáně Nález prionů v lymfatické tkáni Přítomnost amyloidních plaků v mozku Přítomen Variabilní akumulace PrP Sc Nesnadno detekovaný Přítomny Nepřítomen Významná akumulace PrP Sc Snadno detekovaný Přítomny
Laboratorní diagnostika SE založena na EEG a MR: U sporadické formy CJD je typický nález na EEG (elektroencefalograf), na MR (magnetická rezonance) je zjevné postižení (hyperintenzity) bazáln lních ganglií, atrofie a v likvoru lze prokázat protein 14-3-3. před vypuknutím variantní formy CJD lze priony prokázat v tonzilách, apendixu nebo ve slezině; na MR je postižení zejména v thalamu, likvor je negativní na protein 14-3-3. EEG typický pro CJD chybí.
LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA Neurohistopatologie vzorky z pitevního materiálu spongiformní změny (opticky prázdné prostory vzhled mycí houby), úbytek neuronů a zmnožení astrocytů (astrocytózu) amyloidní plaky. Degenerace mozkové tkáně při CJD. Mikroskopická detekce V první fázi se v mozkové tkáni tvoří vakuoly (díry) 5 20mm velké. spongiformní změny (opticky prázdné prostory vzhled mycí houby), úbytek neuronů a zmnožení astrocytů (astrocytózu). V závěrečné fázi (spodní obrázek) jsou vakuoly velké 5 70 mm. http://www.osel.cz/index.php?clanek=1004
Imunohistochemie přímá detekce PrP Sc ve tkáni Obecný protokol odběr a fixace tkáně krájení a napínání histologických řezů optimalizace prezentace antigenů blok aktivity endogenních enzymů vazba primární protilátky (vazba sekundární protilátky) detekční systém barvení pozadí (zejména jader) protilátka značená kovem nebo fluoresceinem http://www.abcam.com/prion-protein-prp-antibody-ab6664.html
Prionics-Check LIA test detekce PrP Sc proužek mebrány s navázanými protilátkami anti PrP Sc
Protein 14-3-3 (cca 30 kd) patří do skupiny konzervovaných proteinů s funkcí v regulaci fosforylace proteinů a aktivace proteinů kinázových drah. Existuje in vivo ve formě dimeru, v nervovém systému. Tvoří izomerní formy. Jeho koncentrace v cerebrospinální tekutině > 1,5 ng/ml indikuje diagnózu CJD. Detekce se provádí metodou Westernového přenosu.
Cyklická amplifikace prionového proteinu (PMCA) protein misfolding cyclic amplification) (Saborio et al. 2001; Soto et al. 2005). Metoda detekce prionu v krvi v presymptomatickém období.
Cyklická amplifikace prionového proteinu (PMCA)
Molekulární diagnostika prionů Genetické vyšetření familiálních SE. U Familiární CJD lze diagnostikovat inzert 144 bp v genu Prnp (6 repeticí) u kodonu 53 50 90 oktapeptidové repetice PHGGGWGQ
Genetická analýza mutací v genu prpn u familiálních SE Spontánní mutace se dědí jako dominantní autozomální znak přenášený mendelisticky substituce T za C MATĚJ,Radoslav. Praha. 2010
Výskyt prionóz v ČR FFI (celosvětově asi 8 10 případů, v ČR žádný případ) GSSS (5ti letý průběh) v ČR jedna rodina, u níž nebylo provedeno genetické vyšetření. CJD (dědičné případy známo asi 20) rodokmeny v sociogeografických klastrech na severozápadním Slovensku (Kysuce a na Oravě s přesahem na severovýchodní část Moravy a na jižním Slovensku s přesahem do Maďarska. vcjd většina obětí cca 200 případů tvořili Britové. CJD 2002 2003 2004 2005 2006 Genetická 2 3 0 1 0 Sporadická Celkem 5 7 8 11 11 11 9 10 11 11