Enzymy biologické katalyzátory Platí o nich totéž co o chemických katalyzátorech, ale mají něco navíc: účinné snížení aktivační energie specifita regulovatelnost účinnosti (aktivity)
Regulace účinnosti enzymů (enzymové aktivity) Množství a lokalisace klíčových enzymů: exprese (proteosynthesa) odbourání (lysozomy, proteasomy) isoenzymy kompartmentace prostorová organisace: multifunkční enzym multienzymový komplex membránově vázané enzymy (ETS) Regulace vlastní enzymové aktivity: nevratná aktivace, limitovaná proteolysa vratná kovalentní modifikace koncentrace substrátu vratná nekovalentní modifikace (inhibitory, aktivátory - efektory)
Regulace účinnosti enzymů (enzymové aktivity) Množství a lokalisace klíčových enzymů: exprese (proteosynthesa) odbourání (lysozomy, proteasomy) isoenzymy kompartmentace prostorová organisace: - multifunkční enzym multienzymový komplex - membránově vázané enzymy (ETS) Regulace vlastní enzymové aktivity: nevratná aktivace, limitovaná proteolysa (příklad) vratná kovalentní modifikace koncentrace substrátu vratná nekovalentní modifikace (inhibitory, aktivátory - efektory)
2. Odštěpení částí řetězců - příklad
Regulace účinnosti enzymů (enzymové aktivity) Množství a lokalisace klíčových enzymů: exprese (proteosynthesa) odbourání (lysozomy, proteasomy) isoenzymy kompartmentace prostorová organisace: - multifunkční enzym multienzymový komplex - membránově vázané enzymy (ETS) Regulace vlastní enzymové aktivity: nevratná aktivace, limitovaná proteolysa (příklad trypsin, chymotrypsin) vratná kovalentní modifikace koncentrace substrátu vratná nekovalentní modifikace (inhibitory, aktivátory - efektory)
Vratná kovalentní modifikace - fosforylace
Regulace účinnosti enzymů (enzymové aktivity) Množství a lokalisace klíčových enzymů: exprese (proteosynthesa) odbourání (lysozomy, proteasomy) isoenzymy kompartmentace prostorová organisace: - multifunkční enzym multienzymový komplex - membránově vázané enzymy (ETS) Regulace vlastní enzymové aktivity: nevratná aktivace, limitovaná proteolysa (příklad) vratná kovalentní modifikace koncentrace substrátu vratná nekovalentní modifikace (inhibitory, aktivátory - efektory) Kinetika enzymových reakcí
Kinetika enzymové katalysy invertasa sacharosa + H 2 O glukosa + fruktosa hexosafosfátisomerasa D-glukosa-6-fosfát D-fruktosa-6-fosfát [S] a [P] [mol/ 0,2 0,18 0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 1[P] 2[P] 2[S] 1[S] 0 100 200 300 400 500 600 t [s] Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P] monomolekulární přeměny S P. k 1 = 0,01 s -1, k -1 = 0 s -1 pro případ 1 ("nevratná reakce") k 1 = 0,006 s -1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce) v = d[ P] dt = - d[ S] dt k = rychlostní konstanta je konstatntou úměrnosti mezi rychlostí reakce a koncentrací reaktantu Reakce 0.řádu Reakce 1.řádu v = k v = k [S]
Základní model - Michaelis & Mentenová k +1 k +2 E + S ES E + P k -1 (k -2 ) Vazba substrátu Rychlá, vratná reakce Katalytická reakce Pomalá, nevratná reakce Předpoklady: Koncentrace [ES] je v ustáleném stavu Koncentrace [S] je mnohem vyšší než [E] Tvorba produktu P určuje rychlost celého děje Tvorba produktu P je přímo úměrná koncentraci [ES], tudíž v 0 = k 2 [ES] Zpětnou reakci tvorby ES z P lze zanedbat? počáteční koncentrace [P] =0 - platí jen pro pokusy in vitro Odvozujeme za podmínky, že reakce běží počáteční reakční rychlostí v 0
Rovnice Michaelise a Mentenové v o = k 2. [ Eo]. [ S] k - 1 + k 2 [ S] k1 v o = V lim [S] K m + [S] [S] >> K m : v o = k 2. [E o ] = V lim (=V max ) reakce 0. řádu [S] << K m : reakce 1. řádu v o V lim =. [ S] = k. [ S] KM [S] = K m : v 0 = V lim /2
K m??? Je rovna koncentraci substrátu při níž reakce probíhá rychlostí odpovídající ½ V lim K m má rozměr koncentrace (1-10 -8 M) Charakterizuje určitý enzym a substrát ale pouze za definovaných podmínek Není to rovnovážná konstanta - zahrnuje více rychlostních konstant, pro různé reakční mechanismy různé rychl.konst. Vliv koncentrace enzymu na reakční rychlost!! Pomocí hodnot K m lze porovnat afinitu enzymu k různým substrátům a odhadnout fyziologické koncentrace substrátů
Jak určit hodnoty K m a V lim? metoda počátečních reakčních rychlostí: změřit závislost v o na [S] - metoda nelineární regrese: Např. program EnzFitter vo [mmol/l/min] 2 1,6 1,2 0,8 0,4 0 0 1 2 3 4 5 6 [S] [mmol/l] - metoda linearisovaných výnosů: dvojnásobný reciproký výnos podle Lineweavera a Burka (1934)
Příklad ze nedávné minulosti: Methanol je vysoce toxický, protože je oxidován jaterní alkoholdehydrogenasou na formaldehyd a ten se v těle dále oxiduje na kyselinu mravenčí: CH 3 OH + NAD + CH 2 O + NADH + + H + HCOOH Pacienti jsou mimo jiné léčeni intravenózním podáváním čistého ethanolu. Vysvětlete, proč je tento postup účinný, víte-li že hodnoty Km pro oba substráty jsou následující: Km (ethanol) = 2.1 x 10-3 M Km (methanol) = 1.3 x 10-1 M
Další důležité pojmy: v 0 = k 2 [ES] reakce probíhá limitní rychlostí když [ES] = [E t ] Z definice limitní rychlosti: V lim = k 2. [E t ] V [ E lim t ] 2 k k cat číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu) Počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu za jednotku času K s = [E].[S]/[ES] = k -1 /k 1 Substrátová konstanta Katalytická aktivita enzymového preparátu Jednotky : unit (U), katal (kat), nkat Specifická aktivita - Celková aktivita -
VÍCESUBSTRÁTOVÁ KINETIKA A + B P + Q - následný mechanismus (postupný, sekvenční) - náhodný - uspořádaný - "ping-pongový mechanismus
Nemichaelisovské enzymy Více aktivních center počáteční reakční rychlost [mol/l/min] 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 3 2 1,5 1 0 5 10 [S] [mmol/l] v o = V K lim.[ S] + [ S] n n Positivní homotropní allosterický efekt allosterické enzymy
Faktory ovlivňující aktivitu enzymů Závislost počáteční reakční rychlosti na ph a teplotě
Faktory ovlivňující enzymovou aktivitu: Inhibitory Kompetitivní inhibice E I KI = [ ].[ ] [ EI ] v o = K M V lim.[ S] I. + [ ] 1 [ S] KI K M = K M I. + [ ] 1 K I K M K M V lim = V lim
Podukt Substrát Kompetitivní inhibitory fumarát sukcinát glutarát malonát oxalát COO - COO - COO - COO - COO - C-H H-C-H H-C-H H-C-H COO - C-H H-C-H H-C-H COO - COO - COO - H-C-H COO - Sukcinátdehydrogenasa
Vliv kompetitivního inhibitoru na enzymovou kinetiku grafické znázornění K m K m V lim = V lim
Inhibice nekompetitivní (noncompetitive)
Vliv nekompetitivního inhibitoru na enzymovou kinetiku K m = K m V lim V lim
Akompetitivní inhibice (acompetitive) K m K m V lim V lim V lim /K m = V lim /K m
Allosterická inhibice (aktivace) v o = V K lim.[ S] + [ S] n n
Imobilizované enzymy Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány, zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně Imobilizace enzymů Vazba na nosič Zachycení (entrapment) sorpcí Kovalentní vazbou V matrici gelu Opouzdření (encapsulation)
Typy nosičů - přírodní polymery (polysacharidy, proteiny) - syntetické polymery (polystyren, polyakryláty, hydroxylakylmethakryláty, atd.) - anorganické nosiče ( minerály, aktivní uhlí, porézní sklo, porézní oxidy kovů)
Vliv imobilizace na vlastnosti enzymů: 1. Inaktivace reaktanty nebo produkty imobilizační reakce 2. Podmínky imobilizační reakce 3. Vazebné síly fixují enzym v neaktivní konfiguraci 4. vazebná reakce s fčními skupinami AK v aktivním centru 5. Orientace enzymové molekuly na povrchu limituje přístup substrátu 6. Vliv funkčních skupin nosiče a) Nosič s kladným nábojem b) Nativní enzym c) Nosič se záporným nábojem
Biotechnologie Definice? Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich přirozené nebo modifikované podobě. Přednosti: surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu prostředí Nevýhody: Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?
Biotechnologické směry 1. Průmyslová mikrobiologie a) Fermentační (ethanol, kyselina citronová) b) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity, biopolymery), c) Biotransformace d) Biomasa 2. Průmyslové biotechnologie 3. Biotechnologie životního prostředí (bioremediace) 4. Živočišné biotechnologie 5. Biotechnologie užitkových rostlin 6. Veterinární a medicínské biotechnologie
Využití enzymů aplikovaná enzymologie využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk: průmysl potravinářský a nepotravinářský klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů) farmaceutika Technologicky významné enzymy Hydrolasy (80%) 50% proteasy, 50% glykosidasy Isomerasy GI (12%!) Ostatní (5-7%) - Oxidoreduktasy (GOD - analytika) Zdroje technických preparátů enzymů: Mikrobiální (bakterie živočišné a rostlinné a plísně) - extremofilní MO rekombinantní technologie
Příklady ze života Biodetergenty (proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy) Mlékárenství (chymosin) Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy) Hydrolýza proteinů úprava krmných směsí. až po biostoning (celulasy)
Mlékárenství - výroba sýra Mléko - suspenze kaseinových mycel Specifita chymosinu Aspartátová proteasa, ph optimum 3,5-6,5 Povrch kaseinové mycely -glu-..-his-(pro-his) 2 -leu-ser-phe-met-ala val 1 105 106 169 Para-κ-kasein hydrofobní kaseinmakropeptid hydrofilní Rekombinantní: mrna z mukosy předžaludků - produkční MO - E.coli, B. subtilis, S.cerevisiae, K. lactis, A. niger
Koagulace kaseinových micel - 1.fáze sladkého srážení mléka 2.fáze koagulace probíhá jen v přítomnosti Ca 2+ 3.fáze postupující hydrolysa, nežádoucí
Prokřížení proteinů transglutaminasa (protein-glutamin gammaglutamyltransferasa) potravinářské lepidlo - změna textury proteinů - tvorba gelů
Biotransformace: Enzymy: Biochemické modifikace látek i v organismu Celé buňky: Přeměna prekursorů na jiné látky vedlejší produkty metabolismu (na rozdíl od fermentací přeměna živin na produkty)
Příprava L-aminokyselin 1. Enzymové rozlišení racemické směsi α-aminokaprolaktam
Vliv organických rozpouštědel na biokatalysu + Vyšší rozpustnost hydrofobních látek Změna specifity Nižší aktivita vody potlačení hydrolysy Snažší separace produktů, vyšší výtěžek Menší riziko mikrobiální kontaminace Potlačení vedlejších reakcí Vyšší termostabilita enzymů v nepolárním prostředí - Nižší aktivita enzymů vyšší spotřeba Denaturace proteinů Reversní micely (voda v apolárním prostředí) - lipasy