Reakční kinetika enzymových reakcí

Transkript

1 Reakční kinetika enzymových reakcí studuje časový průběh enzymových reakcí za různých reakčních podmínek zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných enzymy

2 - uvažujme monomolekulární přeměnu S P např.: hexosafosfátisomerasa D-glukosa-6-fosfát D-fruktosa-6-fosfát

3 Časová závislost koncentrace substrátu [S] a produktu [P] monomolekulární přeměny S P. k 1 = 0,01 s -1, k -1 = 0 s -1 pro případ 1 ("nevratná reakce") k 1 = 0,006 s -1 a k -1 = 0,00375 s-1 pro případ 2 (vratná reakce)

4 Definujme počáteční reakční rychlost -rychlost reakce na počátku experimentu, kdy koncentrace produktů je nulová: dc i v lim v lim = T] o t 0 t 0ν. i dt α i - stechiometrický faktor - hodnoty pro reaktanty (substráty) reakce dosazujeme jako záporné a pro produkty reakce jako kladné -definována pouze pro pokusy in vitro, kde jedině lze zajistit koncentraci produktů reakce nulovou v - měření k definovanému objemu roztoku o dané koncentraci [S], přidáme určité množství enzymu a vhodnou analytickou metodou sledujeme množství vznikajícího produktu. Rychlost reakce můžeme určit jako směrnici časové závislosti koncentrace produktu při kontinuálním měření v čase nula. Obvykle necháme reakci probíhat po určitou dobu, poté ji přerušíme (např. zdenaturováním enzymu) a změříme koncentraci produktu; počáteční reakční rychlost se pak vypočte jako podíl koncentrace produktu a příslušného času. NUTNO DÁT POZOR ABYCHOM BYLI DOSTATEČNĚ DALEKO OD TERMODYNAMICKÉ ROVNOVÁHY (Obvykle přípustný pokles max. o 5 % )

5 v = d[ P] d[ S] = - dt dt Cesta k rovnici Michaelise a Mentenové - zanedbáme zpětnou reakci řízenou konstantou k -2 - enzym: volný (E) a s obsazeným vazebným centrem (ES) [E 0 ] = [E] + [ES] kde [E 0 ] značí celkovou koncentraci aktivního enzymu - substrát volný a vázaný, a pro jeho celkovou koncentraci analogicky platí [S 0 ] = [S] + [ES] (zanedbá se; koncentrace [S] v ES obvykle nepatrná vzledem ke koncentraci volného [S] -produkt se u nevratného modelu vyskytuje v jediném ději, kdy vzniká rozpadem komplexu ES; počáteční reakční rychlost enzymové reakce je proto vyjádřena vztahem: v = 2k[ES] o.

6 Rychlost vzniku (nebo zániku) komplexu ES je dána součtem rychlostí dílčích dějů: Za [E] dosadíme [Eo] - [ES] a získáme vztah Pokud [S] >> [E] je rychlost změny koncentrace komplexu ES výrazně nižší než změna koncentrace substrátů i produktů. Lze tedy položit časovou derivaci rovnou nule, čímž po úpravě získáme: k. 1[E].[S] o [ES ] = k+k+k [S] Počáteční reakční rychlost je dána prostým vynásobením konstantou k 2 (viz výše), takže po vykrácení zlomku na pravé straně konstantou k 1 získáme vztah: k2.[eo ].[S] v o= k k [S] k1

7

8 Závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu K M má rozměr koncentrace; je rovna konc. substrátu při V lim /2; charakterizuje daný enzym za definovaných podmínek; Nízká hodnota K M - vysoká afinita enzymu k substrátu

9 Příklad Při studiu enzymové reakce byly pro následující výchozí koncentrace substrátu změřeny počáteční rychlosti reakce: S [mol/dm 3 ] 6, , , , , vo [nmol/dm 3. min] 15 56, ,9 75 a) Odhadněte hodnoty K m a V lim. b) Jaká bude počáteční rychlost při koncentracích substrátu 2, a mol/dm 3?

10 0 Dvojnásobně reciproký výnos snadné určení V lim a K M ze získaných dat Jiné metody software, odhad

11 Katalytickou aktivitu 1 katalu (1 U) vykazuje enzymový preparát, který za definovaných podmínek (ph, pufr, teplota) při nasycení substrátem přemění 1 mol (1 mol) substrátu za 1 sec (1 min). Další důležité pojmy: definice limitní rychlosti: V lim = k 2. [E o ] V lim k [ Eo] 2 k cat když [E 0 ] = [ES] = číslo přeměny ( turnover number ) = molekulová (molární) aktivita enzymu - počet molů substrátu, které je 1 mol enzymu schopen přeměnit při saturaci substrátem za jednotku času = kolik molekul substrátu je za stejných podmínek schopna přeměnit 1 molekula enzymu za jednotku času Katalytická aktivita enzymového preparátu ( množství aktivního enzymu) K čemu to? - kupuji enzym (cena za jednotku) - kolik potřebuji enzymu pro reakci - koncentrace katalytické aktivity (kat/ml) - klin. biochemie

12 Číslo přeměny = molekulová (molární) aktivita enzymu

13 Závislost v 0 na [E] při [S]=konst.

14 Závislost počáteční reakční rychlosti na ph a teplotě

15 "Nemichaelisovské enzymy v 0 Allosterický efekt (ze Slovníku Biochemických pojmů; M. Kodíček) (Z řeckého allós = jiný, stereós = prostor) - konformační změna v určité části molekuly biopolymeru vyvolaná jistou změnou v jiné části molekuly; Touto změnou může být kovalentní modifikace (např. fosforylace enzymu) či nekovalentní vazba nízkomolekulárního či makromolekulárního Efektoru (např. vazba [S] nekompetitivního inhibitoru na enzym, positivní homotropní allosterický efekt u hemoglobinu, vyvolání konformační změny membránového receptoru vazbou bílkovinného hormonu apod.). Allosterický efekt se uplatňuje zásadním způsobem při regulaci biologické aktivity mnoha bílkovin. - positivní homotropní allosterický efekt (allosterické enzymy) -hemoglobin čestný enzym

16 Positivní homotropní alosterický efekt v o = V K lim.[ S] + [ S] n n v 0 na [S] pro enzym kde působí positivní homotropní allosterický efekt hodnoty Hillova rovnice; n - koeficient sigmoidity - čím vyšší má hodnotu, tím více se závislost v 0 na [S] liší od hyperboly a má výraznější tvar sigmoidy. Hodnota n bývá často rovna počtu enzymově aktivních podjednotek v oligomerním enzymu. Sigmoidita fyziologický význam; citlivá reakce změny [S]. Konstanta K souvisí s hodnotou [S] ½, což je koncentrace substrátu potřebná k dosažení v 0 =V lim /2, vztahem:

17 Dva molekulové modely pro positivní homotropní allosterický efekt a) Symetrický (Monodův). Dva konformační stavy; vysoká/nízká afinita k substrátu. Navázáním první molekuly substrátu je aktivní konformace stabilizována, schopnost ostatních podjednotek vázat a přeměňovat substrát se prudce zvýší a na závislosti v 0 na [S] - inflexní bod. Přechod z jedné konformace do druhé je náhlý bez stabilních meziproduktů a všechny podjednotky mají stejnou konformaci (s vysokou nebo nízkou afinitou); proto symetrický b) Sekvenční. Přepokládá se zde, že vazba prvního substrátu indukuje v enzymu konformační změny, které se postupně šíří od jedné podjednotky k druhé a převádějí jejich aktivní místa do konformace o vyšší schopnosti vázat a přeměňovat substrát.

18 Inhibice enzymů Jakákoliv látka snižující rychlost enzymové reakce, může být považována za inhibitor. Možná je i tzv. - inhibice substrátem: - při velmi vysokých [S] hodnota v 0 může klesat (místo aby limitovala k hodnotě V lim ). Substrát je do vazebného centra vázán řadou nekovalentních interakcí. Při velmi vysoké koncentraci substrátu se může do aktiv. centra tisknout více molekul substrátu, přičemž žádná z nich nemá takovou orientaci, aby katalytické skupiny mohly realizovat její chemickou přeměnu. v 0 [S]

19 Kompetitivní inhibice Zdroj: E I KI = [ ].[ ] [ EI ] v o = K M V lim.[ S] I. + [ ] 1 [ S] KI I K M = KM. + [ ] 1, V lim = V K lim I

20 Kompetitivní inhibice

21 Akompetitivní inhibice Zdroj: v o = V lim S I + [ ].[ ] 1 KI KM S I + [ ] [ ] 1 KI ES I KI = [ ].[ ] [ ESI ]

22 Akompetitivní inhibice

23 Nekompetitivní inhibice E I KI = [ ].[ ] [ EI ] ES].[ I ] [ [ ESI ] E S KS = [ ].[ ] [ ES] EI ].[ S] [ [ ESI ] v o = V lim.[ S] I + [ ] 1. KS + [ S] KI V lim = V lim [ I] ( 1 ) KI

24 Nekompetitivní inhibice

25 Regulace enzymové aktivity INHIBICE: - nevratná - vratná: a) substrátem b) kompetitivní (competitive) c) akompetitivní (acompetitive) d) nekompetitivní (noncompetitive)

26 Závislost počáteční reakční rychlosti na koncentraci substrátu a) neinhibované reakce, b) při kompetitivní inhibici, c) při akompetitivní inhibici a d) při nekompetitivní inhibici Další typy inhibice: -smíšená -ireverzibilní

27 Regulace enzymové aktivity (připomenutí - viz minulá přednáška) na úrovni transkripce a translace (konstitutivní a induktivní) pomocí změn kovalentní struktury (řízeno specifickými enzymy) - nevratné (aktivace štěpením peptidové vazby - proenzymy) - vratné (fosforylace, adenylace...) efektory (aktivátory a inhibitory) - allosterický efekt

28 Imobilizované enzymy Definice IUPAC - enzymy, které jsou fyzicky ohraničeny nebo lokalizovány, zachovávají si svoji aktivitu a mohou být použity opakovaně a kontinuálně Imobilizace enzymů Vazba na nosič Zachycení (entrapment) sorpcí Kovalentní vazbou V matrici gelu Opouzdření (encapsulation)

29 Využití enzymů aplikovaná enzymologie využití enzymů, resp. enzymových systémů, včetně celých buněk: průmysl potravinářský a nepotravinářský klinická biochemie (diagnostika a stanovení analytů) farmaceutika Technologicky významné enzymy Hydrolasy (80%) 50% proteasy, 50% glykosidasy Isomerasy GI (12%!) Oxidoreduktasy (GOD - analytika) Ostatní (5-7%) Zdroje technických preparátů enzymů: Mikrobiální (bakterie a plísně) - extremofilní MO Rostlinné Živočišné Rekombinantní technologie

30 Příklady Biodetergenty (proteasy, amylasy, lipasy, celulasy, peroxidasy) Hydrolýza škrobu (amylasy, GI, transferasy) Mlékárenství (chymosin) Hydrolýza proteinů.

31 Biotechnologie Definice? Aplikace biologických vědních oborů a inženýrských disciplin k přímému nebo nepřímému využití živých organismů nebo jejich součástí v jejich přirozené nebo modifikované podobě. Přednosti: surovinová základna, energetická nenáročnost, šetrnost k životnímu prostředí Nevýhody: Vysoké náklady na V a V, malá efektivnost?

32 Biotechnologické směry 1. Průmyslová mikrobiologie a) Fermentační (ethanol, kyselina citronová) b) Produkty biosynthes (primární a sekundární metabolity, biopolymery), c) Biotransformace d) Biomasa 2. Průmyslové biotechnologie 3. Biotechnologie životního prostředí (bioremediace) 4. Živočišné biotechnologie 5. Biotechnologie užitkových rostlin 6. Veterinární a medicínské biotechnologie

33

34 Regulace enzymové aktivity