Protilátky proti virům parainfluenzy 1 (IgG) Návod na použití ELISA testu Objednací číslo Určení Třída IgG Substrát Formát EI 2721-9601 G Parainfluenza viry typu 1 IgG Ag-potažené mikrotitrační jamky 96 x 01 (96) Princip testu: ELISA souprava umožňuje kvantitativní provedení in-vitro testu pro určení lidských protilátek třídy IgG proti parainfluenza virům typu 1. Diagnostická souprava obsahuje mikrotitrační stripy, každý s osmi jednotlivě oddělitelnými jamkami, které jsou potaženy směsí antigenů parainfluenza virů typu 1. V prvním reakčním kroku jsou v jamkách inkubována ředěná séra získaná od pacientů. V případě pozitivních vzorků se specifické IgG (také IgM a IgA) protilátky navážou na antigeny. Detekce navázaných protilátek se provede při druhé inkubaci provedené s enzymem značenou protilátkou proti lidskému IgG (enzymový konjugát), která vyvolá barevnou reakci. Intenzita barevné reakce je přímo úměrná koncentraci protilátek proti parainfluenza 1 antigenům. Obsah kitu: - Mikrotitrační jamky potažené antigeny: 12 mikrotitračních stripů, každý obsahující 8 jednotlivě oddělitelných jamek v rámečku (připravené k použití) - Kalibrační sérum 1, 200 RU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno tmavě červeně. - Kalibrační sérum 2, 20 RU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno červeně. - Kalibrační sérum 3, 2 RU/ml (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití, značeno světle červeně. - Pozitivní kontrolní sérum (lidské IgG): 1 x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno modře. - Negativní kontrolní sérum (lidské IgG): 1x 1,3 ml, připravené k použití. Značeno zeleně. - Enzymový konjugát: peroxidasou značené králičí protilátky proti lidským IgG: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Značeno zeleně. - Vzorkový pufr: 1 x 100 ml, připraveno k použití. Značeno světle modře. - Promývací pufr: 1 x 100 ml (10 x koncentrovaný) - Chromogen/substrátový roztok: 1 x 12 ml, připraveno k použití. Chromogen: tetrametylbenzidin; substrát: peroxid vodíku. - Zastavovací roztok: 1 x 12 ml, připraveno pro použití. 1 N kyselina fosforečná. - Návod k provedení testů - Protokol s hodnotami. Uskladnění a stabilita: Diagnostický kit musí být skladován při teplotě mezi +2 o C až +8 o C, nesmí být zmražen. Všechny komponenty dosud neotevřené soupravy jsou stabilní do data exspirace. Upozornění: Užitá kontrolní séra jsou testována pomocí enzymoimunologických testů a nepřímých imunofluorescenčních metod na nepřítomnost HBsAg, anti-hcv, anti- HIV-1 a anti-hiv-2. Nicméně, se vším uvedeným materiálem se musí zacházet jako s potenciálně infekčně nebezpečným a musí se s ním zacházet velmi opatrně. Některé reagencie jsou jedovaté (pufr, roztok chromogen/substrát). Vyvarujte se kontaktu s kůží. V případě kontaktu, omyjte kůži mýdlem a velkým množstvím vody. 1
Příprava a stabilita reagencií Všechny reagencie se musí nechat před použitím vytemperovat na pokojovou teplotu. Potažené jamky: Připravené k použití. Uchopte zabalenou desku nad lepícím švem a trhnutím otevřete lepící ochranný obal. Neotvírejte dříve, než je mikrotitrační deska vytemperovaná na pokojovou teplotu, tím zabráníte zvlhnutí jednotlivých proužků. Ihned přemístěte jamky mikrotitrační desky, které nebudete používat, zpět do ochranného zalepovacího obalu a obal stiskem lepícího švu uzavřete. Zbylé jamky v již jednou otevřeném ochranném obalu se musí skladovat na suchém místě v rozmezí teplot +2 o C až +8 o C, lze je použít po dobu nejméně dvou měsíců. Kalibrační a kontrolní séra: Připravena k použití. Séra se musí před použitím řádně promíchat. Enzymový konjugát: Připraven k použití. Konjugát se musí před použitím řádně promíchat. Vzorkový pufr: Připraven k použití Promývací pufr: Promývací pufr je dodáván 10 x koncentrovaný. Požadované množství pufru se čistou pipetou odebere ze zásobní lahve a zředí se 1 : 10 destilovanou vodou. Například, zřeďte 5 ml pomocí 45 ml vody pro 8 mikrotitračních jamek. Naředěný pufr je stabilní pro použití maximálně po dobu jednoho týdne při teplotě +2 o C až +8 o C. Poznámka: Jestliže se v koncentrovaném pufru objeví krystaly, zahřejte ho na 37 o C a před ředěním promíchejte. Chromogen/substrátový roztok: Připravený pro užití. Uzavřete láhev ihned po použití, obsah je citlivý na světlo. Zastavovací roztok. Připravený pro užití Ředění séra a vzorků plasmy Vzorky séra a plazmy pro analýzu se ředí 1: 101 vzorkovým pufrem. Například, přidejte 10 µl séra k 1 ml vzorkového pufru a dobře promíchejte. Poznámka: Kalibrační a kontrolní séra jsou již naředěna a připravena pro přímé použití, neřeďte je znovu. Inkubace Inkubace vzorku: 1. Krok. Přeneste 100 µl kalibračního séra, pozitivní a negativní kontroly nebo ředěného vzorku séra do jednotlivých mikrotitračních jamek podle pipetovacího protokolu a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě. Promývání: Vyprázdněte jamky a následně promyjte každou jamku třikrát 300 µl naředěného promývacího pufru. Aby došlo k promytí, nechejte pufr v jamce působit alespoň třicet vteřin během každého promývacího cyklu, teprve potom jamku vyprázdněte. Po proběhnutí všech promývacích cyklů 2
(provedených ručně nebo automaticky) kapalinu z jamek řádně odstraňte, vyklepejte promývací pufr poklepem desky dnem vzhůru na filtrační papír. Inkubace konjugátu: 2. Krok. Napipetujte 100 µl enzymového konjugátu (peroxidasou značené anti-lidské IgG) do každé jamky mikrotitrační desky. Inkubujte po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Promývaní: Vyprázdněte jamky. Promývání je popsáno výše Inkubace substrátu: 3. Krok. Napipetujte 100 µl roztoku chromogen/substrát do každé mikrotitrační jamky. Inkubujte po dobu 15 minut při pokojové teplotě ve tmě. Zastavení reakce: Napipetujte 100 µl zastavovacího roztoku do každé jamky mikrotitrační desky a to v tom samém pořadí, jako byl kapán chromogen/substrátový roztok. Měření: Fotometrické měření intenzity barvy by mělo být prováděno při vlnové délce 450 nm a referenční vlnové délce větší než 620 nm do 30 minut od přidání zastavovacího roztoku. Před měřením je nutné mikrotitrační desku pečlivě protřepat, tím se zajistí homogenní distribuce roztoku. Pipetovací protokol 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A C1 P4 P12 P20 B C2 P5 P13 P21 C C3 P6 P14 P22 D pos P7 P15 P23 E neg P8 P16 P24 F P1 P9 P17 G P2 P10 P18 H P3 P11 P19 Výše uvedený pipetovací protokol je příkladem kvantitativního stanovení protilátek v sérech od 24 pacientů (P1 až P24). Kalibrační séra (C1 až C3), pozitivní (pos) a negativní (neg) kontrolní séra a všechny vzorky sér pacientů byly inkubovány každý v jedné jamce. Spolehlivost ELISA testu se dá zvýšit užitím měření duplikátů každého vzorku. Jamky se mohou po jedné odlamovat z proužku. To umožňuje sestavit test s minimálními spotřebami všech reagencií. Výpočet výsledků: Jako horní limit referenční oblasti pro lidi neinfikované (cut-off) je Euroimmunem doporučena hranice 20 relativních jednotek RU/ml. Hodnoty nad touto indikovanou hranicí se pokládají za pozitivní, pod touto hraniční hodnotou za negativní. Jak pozitivní, tak negativní kontrolní sérum slouží jako vnitřní kontroly pro určení spolehlivosti provedeného testu. Měly by být zařazeny do každého běhu. Kvalitativní nebo semikvantitativní vyhodnocení: Hodnoty extinkce vzorků sér přesahující hodnotu kalibračního séra 2 (20 RU/ml) se považují za pozitivní, séra s hodnotami pod touto hranicí jako negativní. Vedle této kvalitativní interpretace je možné také stupňovité hodnocení výsledků. Poměry > 1,0 se považují za pozitivní, poměry < 1,0 jako negativní. Poměry se vypočítají z následujícího vztahu: 3
Extinkce vzorku séra Extinkce kalibračního séra 2 = Poměr Kvantifikace: Křivka standardů, ze které se odečítá koncentrace protilátek ve vzorcích sér, se sestrojí vynesením hodnot extinkce získaných z měření 3 kalibračních sér, bod po bodu, proti odpovídajícím jednotkám (lineární/lineární). Následující graf je příkladem typické kalibrační křivky. Prosím, neužívejte tuto kalibrační křivku k určení koncentrací protilátek v sérech pacientů. Jestliže hodnoty extinkce vzorku leží nad hodnotami standardní křivky, doporučujeme, aby byl vzorek znovu otestován při ředění 1:400. Výsledek v RU/ml získaný ze standardní křivky pro tento vzorek se potom musí vynásobit faktorem 4. Charakteristiky testu Kalibrace: Pro určení protilátek proti virům parainfluenzy neexistuje žádné mezinárodní referenční sérum, hodnocení se proto provádí v relativních jednotkách (RU). Pro každý běh musí hodnoty extinkce kalibračních sér a relativní jednotky určené pro pozitivní a negativní kontrolu ležet v rozmezích stanovených pro danou šarži. Protokol obsahující tyto hodnoty je součástí soupravy. Jestliže se nedosáhne hodnot určených pro kontrolní séra, test by mohl být nepřesný a proto se musí opakovat. Aktivita použitého enzymu je závislá na teplotě a hodnoty extinkce se mohou lišit, pokud nepoužijete termostat. Čím vyšší je pokojová teplota během inkubace substrátu, tím vyšší jsou hodnoty extinkce. Odpovídající změny se projeví také vzhledem k času inkubace. Kalibrační séra jsou vystavena stejnému vlivu, takže tyto změny jsou povětšinou zakalkulovány ve 4
výpočtu výsledků. Tuto situaci lze vzít v úvahu a upravit inkubaci se substrátem ve vztahu k laboratorní teplotě následovně: Pokojová teplota 14 o C - 18 o C Pokojová teplota 19 o C - 23 o C Pokojová teplota 24 o C - 30 o C doba inkubace substrátu 18 min doba inkubace substrátu 15 min doba inkubace substrátu 12 min Antigen: Jako zdroj antigenu slouží inaktivované buněčné lyzáty VERO buněk infikovaných VP1 kmenem viru parainfluenzy 1. Linearita: Linearita testu byla zkoumána pomocí série ředění sér pacientů s vysokými hladinami protilátek. Tato ELISA vykazuje linearitu měření v oblasti 2 až 200 RU/ml. Detekční limit: Detekční limit této soupravy anti-parainfluenza ELISA (IgG) je přibližně 1 RU/ml. Klinická významnost Parainfluenza viry se vyskytují celosvětově. V případě dětí a kojenců jsou zodpovědny za asi 35% všech akutních infekcí respiračního traktu. Ve vážných případech, může dojít ke vzniku pseudo-croup. U dospělých vede infekce parainfluenza virem k onemocnění horních cest dýchacích, většinou doprovázenému teplotou. Parainfluenza viry se mohou vyskytovat endemicky, zvláště mezi pozdním podzimem a jarem. Přenášejí se aerosolem. Protilátky proti jednotlivým typům parainfluenzavirů často mezi sebou vykazují zkřížené reakce. 5