Testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství

Testování scaffoldů pro tkáňové inženýrství

Proces tkáňového inženýrství

Proces tkáňového inženýrství 1. Návrh nosiče Seznámení se s problematikou dané tkáně/orgánu Návrh nosiče pro danou aplikaci 2. Příprava nosiče 5. Klinické testy Klinické testy Klinická praxe 4. Testování in vivo Testování in vivo 3. Testování in vitro Charakterizace nosiče (SEM analýza, mechanické testování, smáčivost) Cytotoxicita nosiče (MTS test, ROS oxidační stres, konfokální mikroskopie Preklinické testy

Nosiče (scaffoldy) - požadavky o Biokompatibilita (imunitní odpověď) o Biodegradabilita (rychlost degradace úměrná rychlosti formování tkáně) o Mechanická podpora (dočasná) o Porézní struktura (dostatečně velké a hluboké) umožňující usazení buněk, jejich růst a migraci, distribuci živin/metabolitů, vaskularizace nové tkáně o 3D struktura o syntetické x přírodní o snaha o napodobení přirozeného prostředí buněk v organismu

Postup testování in vitro Izolace buněk Nasazení buněk na nosič Testování osazených nosičů

Tkáňové kultury převzato a modifikováno z (Uccelli et al., 2008) Primární kultury - Buněčné linie Normální - nádorové Embryonální adult kmenové - diferencované

Izolace buněk Autologní, alogenní, xenogenní buňky Enzymatická izolace (kolagenasa, trypsin) narušení ECM Explantační metoda vložení tkáně do kultivačního média

Kmenové vs. diferencované buňky Kmenové buňky: např. mezenchymální kmenové buňky (MSC) Diferencované buňky: např. chondrocyty, fibroblasty, keratinocyty

BIOLAB KNT TUL NHDF lidské dermální fibroblasty MG63 lidské osteoblasty, nádorová linie HUVEC - lidské endotelové buňky 3T3 - myší fibroblasty, nádorová buněčná linie

Biokompatibilita nosiče Test adheze, proliferace, diferenciace, migrace, apoptózy

Testy buněčné adheze Adheze probíhá v řádu hodin Aspekty ovlivňující adhezi: hydrofilita, náboj, topografie a složení povrchu scaffoldu Sledování počtu uchycených buněk v určitém čase po nasazení pomocí světelné/fluorescenční mikroskopie, SEM

Studium morfologie - mikroskopie Optická mikroskopie Fluorescenční a konfokální mikroskopie Fluorofory a immunocytochemie Elektronová mikroskopie Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM) = odražené elektrony = kontury povrchů Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) = procházející elektrony = složený vzorků Mikroskopie atomárních sil (AFM) Sledování kontur povrchu pomocí atomárních hrotů

Optická mikroskopie Rozlišovací schopnost: vzdálenost dvou bodů, které mikroskop zobrazí jako dva samostatné body. Je dána zářením, kterým objekt osvětlujeme, a vlastnostmi objektivu. Okulár pouze zvětšuje obraz tvořený objektivem. Obecně platí, že není možné rozlišit body bližší než polovina vlnové délky záření. U světla se to tedy rovná zhruba 250nm.

Vzpřímené a invertované mikroskopy

Fázový kontrast - sledování buněk Buňky jsou nízko kontrastním objektem Pro zvýšení kontrastu se využívá fázového filtru - filtr obsahuje fázový prstenec pro posun světla Princip: při přechodu objektem dochází k posunu fáze procházejícího světla fázová destička umožňuje posun o ¼ fáze při sumaci dochází k změně v intenzitě světla

Fluorescenční mikroskopie Fluorescenční mikroskop umožňuje analýzu pomocí fluorescenčního značení Mikroskop obsahuje (navíc): Zdroj světla (Hg výbojka) tvořící bíle světlo Excitační filtry (úprava procházejícíce světla) Emisní filtry (úprava vyžarujícího světla) Detektor (CCD čip)

Fluorescence a fluorofory Fluorescence: jev při kterém dochází k absorpci fotonu a následně jeho emisi vyzářením Energie emitovaného fotonu se snižuje přechodem mezi energetickými hladinami vlnová délka emitovaného světla je delší než absorbovaného fotonu Látky s fluorescenčními vlastnostmi se nazývají fluorofory Photobleaching = vysvědcování látek v důsledku poškození světlem

Fluorescence a fluorofory Fluorofory mají typické absorpční a emisní spektra Vhodnou konjugací k detekčním molekulám dojde k jejich vizualizaci Fluorescenční proteiny zelený (GFP) a žlutý (YFP)

Fluorescence a fluorofory

BIOLAB_KNT_TUL 3T3_PI 3T3_DAPI PLT _ anticd41-fitc

Elektronová mikroskopie Rastrovací elektronová mikroskopie (SEM): Elektronové dělo produkuje proud elektronů Magnetické čočky usměrňují paprsek Detektor snímá odražené elektrony od vzorku Transmisní elektronová mikroskopie (TEM): Elektrony procházející přes vzorek jsou promítány na detektoru

SEM TEM

BIOLAB_KNT_TUL- buněčná aheze SEM PLT_1x10 7 _0d_PCLFS_5000x 3T3_1x10 4 _1d_PCLFS_1000x

Testy buněčné proliferace Aspekty ovlivňující proliferaci: poměr stimulačních a inhibičních (toxických) faktorů povrchu Hodnocení stupně proliferace a buněčné viability Izolace buněčné DNA a určení její množství (PicoGreen assay) mikroskopie Metabolické testy (MTT, MTS, XTT)

Kvantifikace DNA

Metabolické testy měření metabolické aktivity - KVANTIFIKACE SPEKTROFOTOMETRIE zabývá se kvantitativním studiem spekter měřením množství světla látkou propuštěného, odraženého nebo pohlceného v závislosti na vlnové délce

Při interakci elektromagnetického záření (světla) vhodné vlnové délky s částicemi látky dochází k využití energie fotonu (absorpci) pro excitaci valenčních elektronů. Intenzita prošlého světla (I) je menší než intenzita světla na látku dopadajícího (I o ). Transmitance (T) zeslabení intenzity světla po průchodu roztokem látky, tedy množství světla určité vlnové délky, které prošlo vzorkem. Určena poměrem I/I o. Absorbance (A) záporný dekadický logaritmus transmitance T I I 0 A log 10 I I 0

Lambert-Beerův zákon vztah mezi koncentrací látky v roztoku a absorbancí A log 10 Při dané vlnové délce je absorbance přímo úměrná koncentraci látky (c) a tloušťce absorbující vrstvy (l) délce optické dráhy neboli šířce kyvety. Molární extinkční (absorpční) koeficient ε je specifický pro danou látku a vlnovou délku. I I 0 c l

Použití: měření absorpčních spekter (širší spektrum vlnových délek) kvantitativní stanovení (při jedné anebo několika vlnových délkách). kinetika jednoduchých, například enzymových reakcí široké uplatnění chemie, fyzika, biochemie, biologie i medicína Klinická biochemie: Stanovení koncentrací látek obsažených v tekutinách reakce látky s příslušným indikátorem například za vzniku barevné sloučeniny spektrofotometrické zjištění koncentrace sledované látky

absorbance (570-650) Metabolické testy- MTT test (MTT assay) Kolorimetrický test pro určení viability buněk metabolická aktivita NAD(P)H dependentních oxidoreduktáz (cytozol - mitochondrie) substrát: tetrazoliové sloučeniny (MTT, MTS, XTS, WTS) MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide produkt: formazan (měření A spektrofotometricky- 500-600nm) MTT test 3 2,5 250 rpm 2 1,5 1 0,5 5 000 rpm 10 000 rpm 15 000 rpm 0 1d 4d 7d 14d time of cultivation

Mikroskopie Fluorescenční (značení jader, značené protilátky) SEM LIVE/DEAD assay - Rozlišení živých a mrtvých buněk (% viability) Živé buňky jsou obarveny jinak než mrtvé (např.: zeleně živé, mrtvé červeně - princip testu: živé buňky nemají poškozenou membránu, nepropustí tak barvivo, které se váže na DNA - PI).

BIOLAB KNT TUL fluorescence microscopy of 3T3 cells after 1 and 4 days of cultivation SEM microscopy of 3T3 cells after 1 and 4 days of cultivation

Testy buněčné migrace Důležité pro hodnocení krytů ran Yarrow et al. BMC Biotechnology 2004 4:21

Detekce buněčné diferenciace Kmenové buňky, progenitorové buňky vliv růstových faktorů a hormonů Sledování syntézy RNA pro dané proteiny (PCR analýza RT PCR) Detekce proteinů v mezibuněčné hmotě (ELISA, imunofluorescenční barvení )

PCR (polymerase chain reaction) Namnožení specifického úseku DNA analýza genu (přítomnost, mutace) genové exprese (RT PCR) kvantifikace DNA (qpcr) 3 kroky: 1) denaturace rozpad dvoušroubovicové str. - ssdna 2) annealing - nasednutí primerů na specifická místa ssdna 3) polymerace - syntéza DNA (termostabilní DNA polymeraza) Např. 30 cyklů (z 1 původní molekuly DNA lze získat po 32 cyklech až 1 miliardu kopií)

Cycler

Detekce - elektroforéza Barvení - ethidium bromid

o Sledujeme expresi genu na úrovni mrna nutno mrna převést na DNA (cdna ) o Reversní transkripce (enzym reversní transkriptáza)

Diferenciace- detekce specifických proteinů

ELEKTROFORÉZA Princip dělení nabitých částic na základě různých elektroforetických pohyblivostí Použití analytické i preparativní

Parametry separace náboj velikost tvar Koncentrace gelu nižší dělení pouze podle náboje vyšší nebo gradient dělení také podle velikosti a tvaru Vliv ph - ovlivňuje náboj, stabilitu, aktivitu "kyselá" (kyselé ph): + "alkalická" (alkalické ph): + Směr migrace závisí na pi proteinů všechny nemusí "putovat gelem"

ELFO na PAGE v přítomnosti SDS (Sodium Dodecyl Sulphate dodecylsíran sodný) SDS se váže na proteiny, uděluje jim uniformní záporný náboj SDS-PAGE

Vyhodnocení

WESTERN BLOTTING 1. elektroforéza rozdělení proteinů, např. SDS-PAGE 2. blotting přenos na membránu, např. elektroforeticky 3. detekce (většinou imunodetekce)

Statická vs. dynamická kultivace

Dynamická kultivace Pri staticke kultivaci nejsou bunky uvnitr 3D scaffoldu dostatecne vyzivovany nedochazi k prorustani bunek dovnitr tkanoveho nosice Dynamicka kultivace vice odpovida prirozenym podminkam v organismu

Bioreaktor