Praktikum č. 8: Diagnostika ve veterinární mikrobiologii (odběr, zasílání a zpracování vzorků určených k bakteriologickému vyšetření. Metody kultivačního stanovení koncentrace bakterií. Cíle: 1. Seznámit se s obecnými zásadami odběru, zasílání a zpracování různých typů vzorků pro bakteriologické vyšetření. 2. Naučit se obecný algoritmus postupů bakteriologického vyšetření různých typů klinického materiálu, vzorků vody, potravin a prostředí. Vzorky odebírané za účelem bakteriologického vyšetření lze rozdělit podle původu na klinický (z živých zvířat) a sekční materiál (z uhynulých nebo poražených zvířat), vzorky prostředí (krmivo, podestýlka, voda apod.) a ostatní druhy vzorků (potraviny, suroviny rostlinného a živočišného původu. Při odběru vzorků klinického a sekčního materiálu vycházíme ze znalostí o přirozené kolonizaci některých sliznic zvířat smíšenými populacemi bakterií (střevo, vagína, horní cesty dýchací apod.) a přirozené sterilitě tkání a tělních tekutin zdravých zvířat. Obecné zásady při odběru vzorků pro bakteriologické vyšetření 1. Požadavky na odběr se striktně řídí vlastnostmi hledaných mikroorganismů. 2. Nejdříve si stanovíme pro jaký účel bude zamýšlené vyšetření provedeno (potvrzení klinické nebo patologicko-anatomické diagnózy, preventivní vyšetření, kontrola úspěšnosti terapie) a jakého původce či spektrum původců chceme diagnostikovat. Tím se řídí volba pomůcek pro odběr, velikost a počet vzorků. Je vhodné před zamýšleným odběrem požadavky konzultovat s diagnostickou laboratoří, která vyšetření bude provádět. Některé laboratoře poskytují podrobné návody k odběru vzorků v elektronické podobě např. http://www.vetmed.iastate.edu/departments/vdpam/vdl/forms/ 3. Někteří bakteriální původci infekčních chorob zvířat mají zvláštní nároky na odběr vzorků, v případě podezření na zoonózy je nutné při odběru a transportu vzorků dodržet bezpečností opatření proti přenosu infekce na člověka (antrax, tuberkulóza, brucelóza, tularémie a pod). 4. K odběru vzorků vždy používáme sterilní pomůcky (skleněné nebo plastové kontejnery s hermetickým uzávěrem, vatové tampony, nástroje apod.). 5. Dostupné jsou komerčně vyráběné odběrové soupravy určené pro odběr a transport různých typů vzorků. 6. Při odběru se snažíme vyvarovat se nežádoucí křížové kontaminace. 7. Odběrové nádobky řádně označíme a s žádankou vhodným způsobem transportujeme/zasíláme do laboratoře. V laboratoři jsou vzorky vybaleny, roztříděny podle typu požadovaných vyšetření, zaevidovány do laboratorní dokumentace (kniha příjmu vzorků, laboratorní protokol) a je zahájeno jejich vyšetřování. 49
Obrázek č. 11: Ukázka žádanky o vyšetření klinického vzorku 50
Základní kroky laboratorní diagnostiky bakteriálních infekcí Přítomnost patogenních bakterií ve vzorku může být potvrzena diagnostickým barvením otisků a roztěrů, kultivací a následným biochemickým určením, sérologickými a molekulárními metodami. Sled jednotlivých kroků bakteriologického vyšetření klinického a sekčního materiálu 1. Přímá mikroskopie nativních nebo fixovaných barvených preparátů (roztěry, otisky), extrakce DNA ze vzorku (PCR) 2. Primokultivace pevných a tekutých půd s jejich následnou inkubací dle nároků hledaných bakterií. 3. Hodnocení primokultur s využitím screeningu jejich vlastností (hodnocení morfologie kolonií, barvení dle Grama, katalázová a oxidázová zkouška, případně jiné rychlé testy), konfirmace metodou PCR. Subkultivace vzorků z tekutých médií. 4. Získání čisté bakteriální kultury výběrem kolonií, jejich subkultivací a následnou identifikací. 5. Provedení doplňujících vyšetření (sérotypizace, antibiogram apod.) A) Vyšetření obarvených roztěrů exudátů a otisků tkání (rychlé ověření přítomnosti bakterií) Barvení dle Grama lze rozlišit kontrastní G+ bakterie (modrofialové) na pozadí tkáňového detritu (červený), naopak G- bakterie je nesnadné rozlišit Barvení dle Ziehl-Neelsena základní metoda průkazu mykobakterií Modifikované barvení dle Ziehl-Neelsena průkaz Coxiella burnetii, brucel, nokardií a chlamydií Barvení dle Giemsy průkaz Dermatophilus congolensis, rickettsie, borrelií, bipolární barvitelnosti (tinkce) pasteurel Barvení dle Giemsy-Romanovského - polychromatické barvení vhodné k identifikaci Bacillus anthracis (modré tyčinky s růžovým pouzdrem) v otiscích tkání a roztěrech krve Louhový preparát (+ Calcoflor nebo Rylux) průkaz dermatofyt, plísní a kvasinek Barvení roztěrů a kryostatických řezů tkání druhově specifickými protilátkami značenými fluoresceinem obtížně kultivovatelné bakterie (Clostridium chauvoei, Lawsonia intracellularis, Brachyspira hyodysenteriae, B.pilosicoli) B) Využití kultivačních médií k předběžné identifikaci patogenních bakterií Krevní agar umožňuje růst většině patogenních bakterií (G+ a G-) a jejich rozlišení podle intenzity hemolýzy (částečná, úplná, dvojitá, viridace). Přídavkem antibiotických suplementů lze použít krevní agary k selektivní izolaci skupin bakterií (G+ koků, kampylobakterů, brucel aj.) MacConkey agar selektivní médium vhodné k izolaci nenáročných G- tyčinek (enterobakterie, pseudomonády, aeromonády aj.) Edwardsův agar selektivní médium k izolaci a rozlišení streptokoků 51
Čokoládový agar tepelně ošetřený krevní agar (V a X faktor) umožňuje izolaci hemofily a Taylorella equigenitalis Rappaport-Vassiliadisův bujón umožňuje selektivní pomnožení salmonel na úkor jiných střevních bakterií přítomných ve vzorcích Mnoho dalších médií vhodných k selektivnímu pomnožení nebo izolaci patogenních bakterií C) Kritéria pro předběžnou identifikaci bakterií: Posouzení morfologie kolonií Přítomnost/nepřítomnost hemolýzy na krevním agaru Schopnost růst na MacConkey agaru (růstově nenáročné gramnegativní bakterie) Barvitelnost dle Grama (Ziehl-Neelsen, Giemsa), velikost, tvar a uspořádání buněk Pohyblivost Výsledek O-F testu Výsledek katalázové a oxidázové zkoušky Vyšetření přirozeně sterilního materiálu Vzorky přirozeně sterilních tkání a tělních tekutin mohou být vyšetřeny na koncentraci bakterií (kvantitativně). Pro takový účel je třeba zajistit aseptický odběr vzorku do vhodné sterilní nádobky. Tkáně se v laboratoři homogenizují ve sterilní třecí misce nebo ve stomacheru a následně ředí sterilním ředidlem (např. peptonová voda, PBS). Jednotlivá desetinásobná ředění vzorku se v množství 0.1 nebo 0.2 ml kultivují roztěrem na povrch vhodného agarového média nebo se zalévají agarem vytemperovaným na 45 o C. Tělní tekutiny se zpracují obdobným způsobem. K ředění je nutné přikročit pokud předpokládaná koncentrace bakterií dosahuje více než 1 000 bakteriálních buněk v ml/gramu vzorku. Úkol: Demonstrace postupů vyšetření vzorků moče, krve, vody, sekčního materiálu a potravin. Poznámky: 52
Obr. č. 12: Princip stanovení koncentrace bakterií v neznámém vzorku kultivací 53