TEM (Transmition Electron Microscopy) HRTEM (High Resolution TEM) SEM (Scanning Electron Microscopy) EDX (Energy-dispersive X-ray spectroscopy)
Mikroskopy http://www.paru.cas.cz/lem/book/podkap/pic/7.1/1.gif
Konstrukční princip elektronového mikroskopu Jsou dány vlastnostmi urychlených elektronů Možnost ovlivnění dráhy elektronů elektromagnetickým nebo elektrostatickým polem. Elektronový paprsek se může účinně šířit pouze ve vakuu. Elektronový paprsek je možno pozorovat pouze nepřímo (fluorescenční stínítko, fotografická deska, televizní obrazovka). Druh elektronového mikroskopu (prozařovací, řádkovací) dán interakcí elektronů s preparátem, která se užívá k zobrazení ( prozářené elektrony; vyražené =sekundární elektrony).
Interakce elektronů se vzorkem S. Jackson, Metal Oxide Catalyst, ISBN: 978-3-527-62612-0
Mikroskopy - TEM Hitachi H-9500 300kV Transmission Electron Microscope JEOL2010F Simulátor TEM http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/tem/tem.html
Proč elektronová mikroskopie Jakýkoliv mikroskop může maximálně rozlišit (přibližně) pouze 2 body ležící od sebe ve vzdálenosti ½ λ (vlnové délky) zdroje osvětlení. Viditelné světlo má λ přibližně 550nm = světelný mikroskop má rozlišovací schopnost přibližně 250nm. Maximální užitečné zvětšení je cca 1000x. Rozlišovací schopnost oka/rozlišovací schopnost mikroskopu=0,25/2,5.10-4 = 1000x Vlnová délka příslušející urychlenému elektronu (60kV) je přibližně 0,005nm (=stotisíckrát kratší než viditelné světlo). 0,25/2,5.10-7 = 100000000x Praktická rozlišovací schopnost elektronového mikroskopu je 0,5-0,7 nm, špičkově 0,25-0,3nm, tedy méně než teoretická hodnota (vady elektronoptického systému).
TEM Transmisní elektronový mikroskop je možné popsat jako složité technické zařízení, které umožňuje pozorování preparátů do tloušťky 100 nm při vysokém zvětšení a s velkou rozlišovací schopností. Vzhledem k příbuznosti paprskových diagramů lze jej považovat za analogii světelného mikroskopu v procházejícím světle. Oba přístroje mají společnou i řadu součástí - zdroje světla nebo elektronů, čočky skleněné nebo elektromagnetické a v obou se preparát umísťuje na mechanický stolek. TEM potřebuje ke své činnosti i mnoho dalších systémů, které u světelného mikroskopu nejsou, např. vysokonapěťové zdroje, elektroniku k řízení mikroskopu a výkonný vakuový systém pro vyčerpání jeho vnitřních prostor mikroskopu na hodnotu, která zabezpečí střední volnou dráhu elektronu alespoň v délce 3 m. http://www.paru.cas.cz/lem/book/
Interakce elektronového paprsku se vzorkem Tenkým vzorkem pod 100 nm část elektronů prochází ( prozáření ) beze změny část elektronů se absorbuje (teplo!) Prozařovací = transmisní elektronový mikroskop TEM (= stínový obraz)
Tenký vzorek Při průchodu elektron těsně míjí: atomové jádro = velká úchylka směru, ztráta rychlosti = elastický (pružný) rozptyl zasáhne jiný elektron = malá úchylka ve směru, ztráta velké části rychlosti = neelastický (nepružný) rozptyl = změna vlnové délky = chromatická vada = preparát musí být tenký odstranění uchýlených elektronů = clona mezi preparátem a objektivní čočkou zvětšování kontrastu preparátu = vnášení atomů těžkých kovů (Pb, U, W, Os, ), které mají větší náboj jádra a snáze působí elastický rozptyl.
Tlustý vzorek část elektronů se absorbuje (=teplo) část elektronů vyráží z povrchu jiné elektrony (=sekundární elektrony) s malou energií. Z těch se rekonstruuje obraz = řádkovací = skenovací = rastrovací elektronový mikroskop = SEM.
TEM a optický mikroskop Oba přístroje mají společnou i řadu součástí - zdroje světla nebo elektronů, čočky skleněné nebo elektromagnetické a v obou se preparát umísťuje na mechanický stolek.
Více možností pozorování bright-field imaging dark-field imaging
Kde získat elektrony pro měření Elektronové dělo: funkce: vybavení elektronů, směr, rychlost žhavené wolframové vlákno tvaru V (základní typ) hrot z boritu lanthanu (LaB6) wolframový hrot (autoemisní katoda), nutnost aby elektrony vycházely z co nejmenší plochy fokusační elektroda = Wehneltův válec = (elektrostatická čočka) (stlačuje elektronový svazek do místa těsně před anodou) anoda: potenciální rozdíl mezi katodou a anodou 60-100kV (u biologických preparátů obvykle 80 kv). Vysokovoltová elektronová mikroskopie (200-1000kV) = silné objekty, živé objekty
Jak ovládat svazek elektronů Zobrazovací systém: elektromagnetické čočky = prstence z velmi čistého, měkkého, železa (= co nejmenší zbytkový magnetismus), zasazené v cívkách napájených stejnosměrným proudem. Dráha elektronu odchylována po spirálovité trajektorii dané směrem magnetických siločar. Otvor v čočce: malé rozměry x přesnost. Nepřesnost: osový astigmatismus. Další zdroj astigmatismu = vrstva zuhelnatělých uhlovodíků v otvorech čoček a clon. Osový astigmatismus: hlavní omezení rozlišovací schopnosti. Korekce: vnější přídatné magnetické pole určeného směru = stigmátor.
Vlastnosti elm. čoček pracují pouze ve vakuu pouze spojky lehká fokusovatelnost = změna magnetické hodnoty čočky = změna intenzity proudu v cívce (stabilita proudu v cívce) tvořený obraz se otáčí kolem osy čočky
Vady elm. čoček chromatická = kolísání urychlovacího napětí a tím vlnové délky svazku (stabilita vysokého napětí) = změna rychlosti elektronu při průchodu preparátem (neelastický rozptyl) = nutnost tenkého preparátu (50-100nm) sférická = okraj čočky láme jinak než její střed. Řešení = zmenšení úhlové apertury čočky = clony =kovové (Mo, Pt, Au) s otvorem 15-50 μm
Detekce obrazu pro TEM stínítko pokryté ZnS fotografická deska nebo elektronické zpracování obrazu pomocí snímače CCD a obrazovky (počítače)
Mikroskop TEM Celková sestava TEM: válec kolona, kde se odehrává tvorba obrazu. Jednotlivé části a ovládací mechanické prvky t. Rozvod vakua a systém ventilů. stůl s elektrickými ovládacími prvky pomocná zařízení: zdroj vysokého napětí, vakuové pumpy
Příprava vzorků preparát musí obsahovat drobné částice nebo může být řezem tkání, ale jeho celková tloušťka nesmí přesahovat 100 nm. (Síla preparátu je kompromis: tenký preparát = dobré rozlišení ale malý kontrast, silný preparát obráceně. preparát musí být dostatečně stabilní, aby odolával pobytu ve vakuu a bombardování elektronovým paprskem kontrast preparátu tj. propustnost pro elektrony musí být upravena, aby byla vyhovující plošná velikost preparátu je dána rozměrem (průměr 3mm) kovových (obvykle Cu) terčků s otvory ( síťky ), na které se objekty umisťují.
Druhy vzorků Totální (drobné částice a organismy), viry, makromolekuly např. DNA, buňěčné komponenty (dosažení kontrastu: stínování šikmo napařenou vrstvou kovu, negativní barvení ) Repliky (otisky povrchových struktur), dosažení kontrastu: stínování šikmo napařenou vrstvou kovu Ultratenké řezy, aplikace histologických technik na EM. (kontrast: vnášení atomů těžkých kovů Pb, U při histochemických reakcích, kde reakční produk je neprostupný pro elektrony)
Repliky Metody přípravy otisků patřily k nejvíce užívaným v začátcích elektronové mikroskopie. V poslední době je tato poněkud složitá metoda využívána vzácně, nejčastěji v kombinaci s metodou mrazového leptání. Otisky se dělí na jednostupňové a dvoustupňové, pozitivní a negativní (obr. 1) Jednostupňový pozitivní otisk se utvoří tak, že objekt se ve vakuu nejprve šikmo nastínuje kovem a pak se na něj kolmo napaří silnější krycí vrstva uhlíku. Replika se potom splaví nebo sejme pomocí plastické hmoty. Jednostupňový negativní otisk se připraví tak, že se na objekt kolmo napaří ve vakuu vrstva uhlíku a stínuje se až sejmutá replika. 1- pozitivní jednostupňový otisk, 2- Negativní jednostupňový otisk, 3- Pozitivní nepravý jednostupňový otisk (na opačné straně stínovaný), 4Negativní dvoustupňový otisk, 5- Pozitivní dvoustupňový otisk, A- objekt, B- stínovaná vrstva kovu, C- tenká uhlíková replika, D- silná primární replika plastické hmoty, E- silná podkladová vrstva plastické hmoty
Preparační technika elektronové mikroskopie totální preparáty: zvláště důležité pro molekulární biologii. Dva druhy preparace: negativní barvení : suspenze částic a roztok barviva (fosfowolframan K nebo Na, /NH4/2MoO4, UAC, 0,5 1%). Při zaschnutí se vytvoří film kontrastující látky kolem částic a částečně i ve strukturách částic-viry preparáty stínované: napaření těžkého kovu (Pt, Au apod ) = zvýrazňování makromolekul např. DNA repliky: otisky povrchů: dnes hlavně jako součást metody mrazového lámání a leptání freeze fracture a freeze-etching. Jinak použití v biologii jen výjimečné, nyní většinou nahrazeno ultratenké řezy tkáněmi: obdoba klasických histologických technik na mnohem jemnější úrovni. Přechod mezi světelnou a elektronovou mikroskopií = polosilné řezy ( tlusťáky ) Všem způsobům preparace je společné nanesení objektů na nosné terčky = síťky (obvykle z Cu) průměr 3mm. Rozměry ok nepřímo udává ME-SH obvykle mezi 100Mesh (otvory 200μm) a 400MESH (otvory 40μm). Objekty se obvykle montují na síťky pokryté tenkou vrstvou nosné folie, pouze řezy je možno montovat přímo.
FIB příprava vzorků pro TEM pomocí Ga iontového děla lze obrábět a sledovat přímo v SEM http://www.fzu.cz/popula rizace/mikroobrabenifokusovanym-iontovymsvazkem
FIB příprava vzorků pro TEM http://www.fzu.cz/popula rizace/mikroobrabenifokusovanym-iontovymsvazkem
3D rekonstrukce pomocí TEM W kontakt transistoru v 2D a 3D rekonstrukci vzorek je během měření naklápěn a pak sestaven model, v 3D zřetelné změny tloušťky 100 nm http://www.ifam.fraunhofer. de/2804/analytik/tem/litera tur/tem_2006_aipsemiconductortomography_en.pdf
3D rekonstrukce - Plazmová polymerace s nanoinkluzemi TEM 0,5 x 0,5 μm n-hexane content 0% AFM 1 x 1 μm J. Matoušek at. all, Vacuum 84 (2010), IF 1%
HRTEM Strukturní informace s rozlišením lepším než 2 A V krystalických materiálech lze rozlišit jednotlivé sloupce atomů Atomární rozlišení v transmisním elektronovém mikroskopu (HRTEM) je dosaženo pomocí interference (kombinace) přímého paprsku s difraktovaným paprskem (případně několika). Ačkoli vysokorozlišovací obrázky vypadají velice jednoznačně, jejich interpretace je velice složitá a vyžaduje počítačové simulace pro správnou interpretaci. Vždy je nutné mít na paměti, že pozorujeme pouze 2D projekci 3D objektu! Navíc "rozmazanou" vlivem nedokonalostí elektromagnetických čoček. Prvně 1978 Aaron Klug
HRTEM Limit - strukturní informace s rozlišením lepším než 2 A V krystalických materiálech lze rozlišit jednotlivé sloupce atomů Lze i natáčet vzorek tomografie s HRTEM
HRTEM princip TaO - http://en.wikipedia.org/wiki/electron_crystallography http://www.microscopy.ethz.ch/tem_hrtem.htm
Princip Velká apertura objektivu pro průchod mnoha svazku světla Obraz interference difraktogramu a svazku
Ideální HRTEM Vysoké rozlišení, žádný kontrast
Fázový kontrast Pro tenký vzorek a rovinou elektronovou vlnu Nutné zavést do TEM fázový posun Sférickou ablací objektivové čočky Rozostřením objektivové čočky Dostaneme interferenční obraz
Příklad pozorování Al/MgAl2O4 rozhraní
HRTEM - aplikace Zkoumání rozložení strukturních defektů krystalové mřížky Nano krystaly a jejich identifikace v aforfní matrici Nano částice Difůze jednotlivých atomů dopování atd. Omezení je zejména v tom, že svazek musí být velmi intenzivní vzorek se silně ohřívá
High resolution TEM - HRTEM v současnosti až 0.8A (0.08 nm). pozorujeme difrakční obrazce, které jsou Fourierovou transformací periodického potenciálu tj. složitá teorie, získání obrázku vyžaduje zpětnou matematickou transformaci měřeného signálu Si proměnná tloušťka Ge /Si http://www.tf.uni-kiel.de/matwis/amat/def_en/kap_6/backbone/r6_3_4.html
http://www.nature.com/nmat/journal/v 10/n3/fig_tab/nmat2964_F1.html HRTEM grafen Monovrstva dole, dvojvrstva nahoře
Mikroskopy - SEM
Rozdíly
Princip Elektronový paprsek se vytváří stejně jako v TEM. Fokusuje se soustavou čoček do co nejmenší stopy (průměr 5-10nm), která dopadá na pozorovaný preparát. Pomocí vychylovacích cívek elektronový paprsek přejíždí po povrchu pozorovaného preparátu v řádcích. Dopadem primárního paprsku jsou z preparátu vyráženy sekundární elektrony. Ty jsou přitahovány k detektoru a dopadají na scintilátor s fotonásobičem. Elektrický signál z fotonásobiče je zesílen a určuje intenzitu elektronového paprsku na obrazovce. Primární paprsek po preparátu a paprsek obrazovky běží synchronně.
Interakce elektronů s povrchy Typická vzdálenost atomů v pevné látce 0.4 nm = 4 A
SE SE mají nízkou energii proto se musí urychlit předpětím cca 10 kv z bližších míst je jich více než z vzdálenějších proto topografický kontrast, každý bod 10 až 1000 elektronů. SE
BSE BSE závisí na středním atomovém čísle vzorku. Obraz v odražených elektronech je schopen odlišit oblasti s různým prvkovým složením. Např. uhlík bude tmavý. BSE
Zrno z FeOx prášku SE sekundární elektrony BSE zpětně odražené elektrony
Tenké vrstvy a povrchové struktury D = 400-90o, total gas flow 7 sccm
Často kombinace SE + BSE Překrystalizované vlákno žárovky
Biologické vzorky SE - Křídlo mouchy
Tkaniny a filtry, membrány
Volba urychlovacího napětí Používá se mnohem nižší urychlovací napětí než u TEM (SEM obvykle 20 kv, TEM obvykle 80kV). Důvod je, aby se sekundární elektrony uvolňovaly co možná blízko povrchu objektu.
Vzorky velikost objektů až několik cm objekt musí být dokonale vysušen a preparován tak, aby povrchové struktury byly co nejlépe zachovány povrch objektu musí být pokryt vodivou vrstvou, která je souvislá, věrně sleduje detaily povrchu a nemaskuje je vodivá vrstva na povrchu preparátu musí umožňovat co největší zisk vyzářených sekundárních elektronů (ne uhlík)
Mrazová fixace Je stejně jako při použití chemického způsobu přípravy preparátů prvním a velmi důležitým krokem přípravy. Většina živých organismů obsahuje více než 70 % vody nerovnoměrně rozdělené do membránami ohraničených oblastí. Chceme-li tedy biologický vzorek dobře mrazově zafixovat, musíme vycházet především z vlastností vody, které jej tvoří. Při zmrazování voda vykazuje řadu anomálií, kterými se odlišuje od ostatních látek a které celý proces znesnadňují: - její objem ve zmrazeném stavu je zhruba o 9 % větší než v kapalném stavu - její hustota není nejvyšší v bodě tuhnutí, ale v kapalném stavu při teplotě 277 K - má anomálně vysoký bod tání (273 K), bod varu (373 K) a kritickou teplotu (647 K) - má vysoké vypařovací teplo a dielektrickou konstantu, která přispívá k její roli univerzálního rozpouštědla v biochemických reakcích - je známa řada krystalických forem ledu Tyto anomálie jsou do značné míry způsobeny přítomností intermolekulárních vazeb vodíkových můstků a van der Waalsových sil. V praxi znamenají nebezpečí poškození ultrastruktury v důsledku potrhání buněk zvětšujícím se objemem nebo tvořícími se krystaly.
EDAX Někdy EDS nebo EDX Energy-dispersive X-ray spectroscopy Obvykle integrována od SEM, lze i do TEM Umožňuje určit prvkové složení Na vzorek vyšleme svazek elektronů a pozorujeme vyzářené světlo (X-ray oblast) Pozn: lze použít i svazek X-ray, pak jde o Rentgenovskou fluorescenci (XRF)
EDX
EDX Charakteristické záření Některé elementy se překrývají Ti Kβ - V Kα Mn Kβ - Fe Kα Vliv vzorku na měření, fotony ne vždy musí opustit vzorek směrem k detektoru - drsné a nehomogenní vzorky Lze kvantitativní i kvalitativní analýza
Detektory např. EDAX SDD moderní detektor Silicon Drift Detector Od Boru (5) nahoru včetně Sapphire Si(Li) Detector for the SEM and TEM Od Berylia (4) nahoru
Bodová analýza složení
Lineární scan 1D řez po povrchu vzorku
Rastrování
Si a S vměstky v oceli http://www.azom.com/article.aspx?articleid=3131
Au na povrchu http://le-csss.asu.edu/em_service
PVD nanesená TiN vrstva Deformed-layer http://www.azom.com/article.aspx?articleid=3131 Sub-layer
Literatura http://web.natur.cuni.cz/parasitology/parpages/mikroskopickatechnika/elektronovamik roskopie.doc Tescan JEOL Wikipedia http://www.paru.cas.cz/lem/book/ http://www.siliconfareast.com/edxwdx.htm http://dmseg5.cwru.edu/groups/ernst/courses/emse-512-s05/pages/transparencie s/emse-512-06.pdf http://www.edax.com/products/eds/team/team-eds-system-sem-x-ray-microanaly sis.aspx