PLANÁRNÍ (PLOŠNÁ) CHROMATOGRAFIE
Tenkovrstvá chromatografie je technika pro identifikaci a separaci směsi organických látek Identifikace složek směsi (nutné použít standard) analysa frakcí sbíraných během purifikace analysa čistoty látek Při TLC se látky ze směsi rozdělují mezi adsorbent (stacionární fáze, obvykle silikagel, SiO 2 ) a solvent (mobilní fáze), která proudí skrz adsorbent
Uspořádání tenkovrstvé a papírové chromatografie Vzestupné Sestupné
mobilní fáze vzlíná stacionární fází TLC látky rozpuštěné v mobilní fázi putují TLC deskou složky směsi putují rozdílnou rychlostí, která záleží na intermolekulárních silách mezi látkou a silikagelem stacionární fáze a látkou a složkami mobilní fáze http://www.instructables.com/id/ew1ydcyf4rec0iu/ stacionární fáze SiO2 je velmi polární - silné dipól-dipól interakce, vodíkové můstky čím polárnější analyt, tím silnější vazba se stacionární fází, tím menší rychlost mobilní fáze relativně nepolární silné Londonovy síly, dipól-dipól interakce, vodíkové můstky nepolární analyt interaguje se stacionární méně silně než s mobilní fází putuje rychleji
Charakterizace separece u i R F, i = = um d d i m d i d m u i u m d i d m rychlost skvrny i-tého analytu rychlost (čela) mobilní fáze vzdálenost středu skvrny i-tého analytu od startu vzdálenost čela mobilní fáze od startu
Co nám říká hodnota R f? o R f hodnoty lze použít k usnadnění identifikace látky v porovnání se standardy o R f hodnota není fyzikální konstanta, mělo by být provedeno srovnání pouze skvrny na stejné desce za stejnou dobu o Dvě látky, které mají stejnou hodnotu R f mohou být totožné; ty, které mají různé hodnoty R f nejsou totožné
málo polární nejvíce polární Typ látky alkany alkeny etery aromáty aldehydy a ketony alkoholy aminy organické kyseliny soli polárnější látky se váží silněji na stacionární fázi málo polární nejvíce polární rozpouštědlo hexany tetrachlormethan toluen chloroform diethyleter ethylacetát aceton methanol kys. octová voda eluční síla běžných rozpouštědel
Detekce barevný produkt SUPR UV (látky které světélkují pod UV světlem) vizualizace postřikem s vhodným chemickým činidlem (ninhydrin, H 2 SO 4, KMnO 4, I 2 )
Aplikace dělení aminokyselin, vitamínů, alkaloidů, uhlovodíků, nukleotidů, potravinářských barviv, cukrů, Flash chromatografie
Flash chromatografie použití pro purifikaci nízkomolekulárních přírodních látek a produktů organických synthes
mobilní fáze: - dvou a vícesložkové systemy běžná rozpouštědla: dichloromethan/hexan ether/hexan hexan/ethylacetát dichloromethan/methanol ethanol chloroform/ethanol chloroform/aceton
pro odhad retence na koloně: C V =1/R f C V - objem mobilní fáze potřebný k eluci komponenty vztažený na objem kolony R f - hodnota retence na TLC desce
Na začátek zařadit metody: s vysokou kapacitou velkým výtěžkem nízké rozlišení Později metody s: vysokým rozlišením dostačujícím výtěžkem kapacita méně významná Základní zásady Pokud možno řadit metody za sebou racionálně, bez nutnosti mezikroků (např. dialýza nebo ultrafiltrace možné snížení výtěžku) Čím méně kroků, tím větší výtěžnost proteinu Metody zřeďovací kombinovat s metodami koncentrujícími
Příklady Srážení síranem amonným (vysoká koncentrace soli ve vzorku) chromatografie s hydrofóbní interakcí Ionexová chromatografie (eluce vysokou iontovou silou) chromatografie s hydrofóbní interakcí Gelová chromatografie se používá na konci celé purifikační sekvence odstranění fragmentů a komplexů Nevhodné kombinace Srážení síranem amonným a ionexová chromatografie (nutno zařadit odsolovací krok dialýza, ultrafiltrace)
Sledování průběhu separace Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] Specifická aktivita [U/mg] Stupeň přečištění Výtěžek 0,8 50 1000 25-100 % (NH 4 ) 2 SO 4 2,5 10 850 34 1,4 85 % HIC 2,5 6 600 40 1,6 60 % dialysa 2,2 6,5 550 39 [%] 1,6 55 % IEX 0,2 3 500 1000 40 50 %
Sledování průběhu separace Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] 258,1 20 4000 (NH 4 ) 2 SO 4 118,1 9 4053 HIC 57,5 6 3565 GPC 19,3 2 2565
Metoda buněčný extrakt Koncentrace bílkovin [mg/ml] Objem [ml] Celková aktivita [U] 258,1 20 4000 (NH 4 ) 2 SO 4 118,1 9 4053 HIC 57,5 6 3565 GPC 19,3 2 2565 Specifická aktivita [U/mg] 0,77 Stupeň přečištění - Výtěžek [%] 100 3,81 4,9 101 10,33 13,3 89 66,45 85,8 64
Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mm maltosy a 0,5 ml 50 mm Tris pufru ph 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na 2 CO 3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm 3.cm -1.mol -1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?
Aktivita alfa-glukosidasy byla měřena s využitím maltosy jako substrátu a produkt reakce byl detekován reakcí s činidlem GOD250, které obsahovalo glukosaoxidasu a leukoformu barviva ve vhodném pufru. Reakční směs obsahovala 0,5 ml enzymu (4 mg/ml, Mr 110kDa), 0,5 ml 200 mm maltosy a 0,5 ml 50 mm Tris pufru ph 8,2. Reakce probíhala 20 minut při 37 C a byla ukončena přídavkem 1,5 ml 10 % Na 2 CO 3. Ke směsi byly přidány 2 ml činidla a směs byla inkubována 15 minut při 37 C. Výsledné produkty byly detekovány při 498 nm v 1cm kyvetě. Molární absorpční koeficient byl odvozen z kalibrační křivky (závislost absorbance na koncentraci glukosy po přídavku činidla) a byl stanoven na 440 dm 3.cm -1.mol -1. Jaká je specifická aktivita a celková aktivita enzymového preparátu pokud byla naměřena absorbance 1,438 a celkový objem enzymového preparátu je 10 ml?
Stanovení koncentrace bílkovin
Kjeldahlova metoda stanovení N 2 Mineralizace vzorku převedení organického dusíku na NH 4 + Stanovení NH 4 + - titrace, fotometrie, selektivní elektrody
UV spektrofotometrie
UV spektrofotometrie 280 nm aromatické AMK interference nukleotidů 180-230 nm peptidová vazba Výhody - nedestruktivní metoda
VIS spektrofotometrie Přídavek činidla barevný derivát Destruktivní metoda Nutná kalibrační závislost
Biuretová metoda Princip : Cu 2+ vytváří v silně alkalickém prostředí komplex se 4 N peptidové vazby Cu 2+ Měření : 540 560 nm 1-10 mg/ml
Lowryho metoda Princip : kombinace Folinovy a Biuretové metody Tyr, Trp, Cys Měření : 720-750 nm 5-250 µg/ml
Metoda dle Bradfordové Princip : při vazbě Coomassie Brilliant Blue G 250 na bílkovinu dochází k posunu absorpčního maxima z 465 na 595 nm. Meření : 595 nm 1-1000 µg/ml
BCA metoda Meření : 562 nm 0,4-100 µg/ml
Měření: 575 nm Ninhydrinová metoda
Fluorescence Princip : - vazba fluoroforu (fluorescamin) na bílkovinu měření vzniklé fluorescence Měření: 390/475 nm 10 ng
Stanovení koncentrace DNA
Metoda měření absorbance v UV oblasti
Metoda s diaminobenzoovou kyselinou Měření: depurinace + DABA Měření: 420 nm 25 µg Metoda s difenylaminem Měření: depurinace + DPA Měření: 595 nm 25 µg
Ethidiumbromid Fluorescenční metody 4`,6`-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 2-(2-[4-hydroxyphenyl]-6-benzimidazolyl)-6- (1-methyl-4- piperazyl)benzimidazol trihydrochlorid (Hoechst 33258)
Stanovení koncentrace RNA
Metoda měření absorbance v UV oblasti 1 OD 260 = 40 µg/ml ssrna A 230:260:280 ~1:2:1
Metoda s orcinolem Princip: depurinace + reakce s orcinolem Měření: 660 nm