přímá kvantitativní analýza v HPLC MS (bez izotopového otopoého značení) Jan Havliš Masarykova univerzita Přírodovědecká fakulta, Brno Ústav experimentální biologie : Oddělení funkční genomikya proteomiky : : Centrální laboratoř
: nízkokroková (shotgun shotgun)analýza komplexního vzorku proteinů/peptidů :relativní (rozdílové) stanovení buňka proteom vzorek proteom poteo (?) MS spektra proteiny pote y(?) data rekonstrukce k proteomu (?) : co : kolik : proč 3
náplň přednášky přímá kvantifikace? : kvantifikace ace vms aneb proč to dělat jednoduše, když to jde i složitě :: vliv ionizace použití hmotnostní značky :: je to opravdu tak výhodné? : přímá kvantifikace (bez izotopového značení) aneb cesta je to složitější, za to méně přesná :: ionizace problém stále zůstává :: neukončená snaha odejít spíše se štítem než na něm 4
kvantifikace pomocí MS intenzita signálu = f (koncentrace koncentrace) : hmotnostní spektrometrie složitý proces ionizace účinnost ionizace = f (koncentrace koncentrace, chemické struktury, pozadí) účinnost ionizace (ionisation efficiency) : počet vyprodukovaných iontů v závislosti na ionizační energii 5
dlouhá cesta od teorie k praxi klasické analytické stanovení v rámci proteomu (či jiné komplexní směsi) : obtížné referenční materiál a kalibrace pro každý analyt? analytické předpoklady v kvantitativní proteomice pomocí MS : 100% výtěžnost všech proteinů ů : lineární kalibrační závislosti : nulové výseky těchto závislostí na ordinátě : široký dynamický rozsah aejsou ale ve výsledku reálné? : takřka žádné absolutní hodnoty obsahu : mizerná přesnost, ale i správnost : těžko dosažitelné potřebné hodnoty mezí detekce a stanovitelnosti 6
nejběžnější řešení? :: použitím vnitřního standardu (s využitím hmotnostních značek) optimálně : standard i analyt ionizovány současně : standard i analyt mají stejnou chemickou strukturu : poměr analyt/standard jsou i jiná řešení? : bez derivatizace vzorku (hmotnostní značkou)? :: použitím využití intenzit nebo ploch píků :: použitím počítání spekter! nábližka : nejdelší vzdálenost mezi dvěma body 7
kontrola vzorek kontrola vzorek lehká značka těžká značka proteolytické štěpení proteolytické štěpení směs LC MS(/MS) LC MS(/MS) intenzity či plochy píků nebo počítání spekter poměry intenzit ve spektrech 8
krok první základní principiální kroky přímé kvantifikace : identifikace signálů, tedy peptidů, potažmo proteinů : hledáme unikátní peptidy :: redundance d databázová tbá á :: redundance fylogenetická krok druhý : převedení obsahu peptid na obsah proteinu (pars pro toto) :: různé ů nábojové stavy jednoho proteinu a jejich ji rovnováha :: různé proteiny sdílejí týž peptid (dekonvoluce signálu) základní obecný postup : odstranění šumu, vyhlazení : odečtení základní linie (jen pro využití intenzit) : normalizace signálu (jen pro využití intenzit) nebo dat (počítání spekter) : identifikace, roztřídění, vyhodnocení četnosti falešných nálezů (FDR, false discovery rate) : stanovení 9
využití intenzit nebo ploch píků : princip podobný stanovení molárního absorpčního koeficientu I A intenzita signálu analytu, u molární ionizační koeficient, c A koncentrace analytu, I B intenzita signálu pozadí experimentální získání u je nesnadné : pracné : závislost nebývá lineární ale : v relativní kvantifikaci nepotřebujeme u znát! jen je li I B1 a I B2 = 0 I A1 c A1 A1 intenzita signálu proteinu 1, I A2 intenzita signálu proteinu 2, A1 koncentrace proteinu 1, c A2 koncentrace proteinu 2 10
696 1x relativ vní intenzita [% %] relativní inte enzita [%] plocha píku [a.u.*min] retenční čas [min] t R [min] 2280 3x plocha píku [a.u.*m min] retenční čas [min] t R [min] 4400 3.3x 6x 6.3x 1.9x relativní inte enzita [%] plocha píku [a.u.*min] retenční čas [min] t R [min] 11
provedení iontočet iontočet (peptide ion intensity counting) : kvantitativní informace přímo v MS : intenzita či plocha monoizotopového píku : I B 0 RSD = < 40 % r 2 = 0.85 sumární iontočet (ion ion accounting) : signály tři nejintenzivnějších tryptických peptidů v MS 2 jsou mírou obsahu proteinu : součet intenzit či ploch monoizotopových píků RSD = 10 15 % r 2 = 0.99 12
průměrná hodnota iontočtů iontočtů (spectral TIC method) : poměr průměrů signálů ze všech MS/MS patřících danému proteinu : průměr intenzit či ploch monoizotopových píků; robustnější parametr :: větší protein generuje více peptidů vyšší vzorkový práh RSD = ~ 20 % I A1 /I A2 A2 = 60 (SIL ~ 20) normalizovaný iontočet (PICA, (PICA, peptide ion current area) : poměr normalizovaných signálů z XIC MS peptidů patřících danému proteinu :: průměr intenzit či ploch prvních tří izotopových specií :: vyhlazení (substituce gaussovského profilu parabolou) :: statistický test, je li S/N daného signálu přijatelný RSD = ~ 10 % min 5 MS spekter na peptid 13
detekce peptidu základní kroky : MS data; odlišení od chemického šumu; určení náboje : lokalizace v rozměru retenčního času a rekonstrukce chromatografického profilu podle hodnoty m/z monoizotopického iontu peptidu : integrace celkového iontového proudu peptidu = kvantitativní informace ale : podobné m/z (přesnost) či podobný t R potřeba jednoznačné identifikace : identifikace ztráta času a materiálu na MS 2 kolokalizace srovnávaných peptidu : každý biologický vzorek se měří separátně (na rozdíl od měření se značkami) : podle koordinát (m/z m/z, t R ) se hledají srovnávané peptidy (přesnost) : normalizace t R (vnitřní standard d přidaný či skutečně č ě vnitřní) :: normalizovaný retenční čas (NET, normalised retention time) 14
výběr signifikantních peptidů : normalizace intenzit (odstranění artefaktů) informaticky :: hmotnostní značka správnosti (AMT, accurate mass tag) : výběr signifikantních peptidů p (statisticky statisticky) mezi skupinami vzorků : LTQ OT MS umožňuje paralelní MS 2 identifikaci a kvalitní kvantifikační MS data :: zvyšuje výpočetní nároky : 66% shoda mezi dvěma LC MS/MS běhy; 10 běhů max. počet unikátních peptidů unikátní peptidy m/z m/z normalizovaný retenční čas [min] 15
využití počítání MS/MS spekter : čím více je proteinu, tím více vytvoří tryptického peptidu : čím více tryptického peptidu, tím je pravděpodobnější, že bude podroben MS 2 pík (XIC) tryptického peptidu z proteinu o koncentraci c 1 : celkový počet unikátních peptidů na protein : celkový počet MS/MS spekter na protein r 2 = 0.99 linearita :dva řády spekter N S počet spekter n i obsah proteinu inten nzita intenzita retenční čas 8 MS 2 spekter pík (XIC) peptidu z proteinu o koncentraci c 2 kde 2*c 2 = c 1 4 MS 2 spektra počet retenční čas obsah proteinu [mol] 16
exponencializovaný index obsahu proteinu (empai empai, exponentially modified d protein ti abundance index) ) provedení index obsahu proteinu (protein abundance index) počet jedinečných: prekurzorových iontů sekvencí N i počet pozorovaných tryptických peptidů jednoho proteinu sekvencí bez překryvu N tot tot počet všech pozorovatelných tryptických peptidů jednoho proteinu n(hsa) [fmol] molární zlomek 17
absolutní exprese proteinu (APEX APEX, absolute protein expression) :normalizace počtu pozorovaných unikátních peptidů pomocí predikované pravděpodobnosti detekce/identifikace peptidu linearita :tři třiaž čtyři řády N S počet MS 2 spekter z jednoho proteinu, N PS počet predikovaných MS 2 spekter, c tot t celková koncentrace proteinu, n celkový počet identifikovaných proteinů, p pravděpodobnost detekce/identifikace peptidu 18
pokročilá normalizace dat normalizovaný faktor četnosti spekter (normalized spectral abundance factor) N S počet MS 2 spekter související s jedním proteinem, N AA počet aminokyselin tohoto proteinu, n celkový počet identifikovaných proteinů spektrální index (spectral index) x it č i intenzitasignálu, m počet MS 2 spekter, n počet unikátních peptidů proteinu, k počet unikátních proteinů, L délka proteinu 19
s volným přístupem p softvér MapQuant, MZmine, MsInspect,OpenMs OpenMs, MSight, SuperHirn, PEPPeR komerční Decyder MS (GE Healthcare) X Tracker (Cranfield Ca edu Uni) ProteinLynx (Waters Waters) Elucidator (Rosetta Rosetta) ProteoIQ (BioInquire BioInquire) SIEVE (Thermo Electron) G.I.G.O. : ze smetí nic než smetí neuděláš 20
srovnání srovnáníkvantifikačních postupů diferenční gelová el. proteiny identifikované a kvantifikované pomocí 1 peptidu sumární iontočet itraq proteiny identifikované a kvantifikované pomocí 2 peptidu sumární iontočet diferenční gelová el. itraq 21
shrnutí významu přímé kvantifikační metodologie + experimentální snadnost žel, jen na první pohled + neomezené množství paralelních analýz časové omezení + nízká cena provozní, ale ne pořizovací výsledky silně zatížené metodickými zjednodušeními vyšší dynamický rozsah, ale nízká přesnost a správnost žádné kalibrace, žádné standardy, ale také žádné řízení jakosti (QC) vyhodnocení speciální komplexní softvér vysoké instrumentální nároky vysoké rozlišení, vícerozměrná separace 22
prakticky, o fous lépe vychází počítání spekter, ale! neexistuje obecné řešení závěr jsem poněkud zmatená. tohle byl začátek něčeho, konec něčeho nebo to něco bylo už všechno? 23
děkuji za pozornost finanční č podpora GA ČR MŠMT GA203 203/09 09/0148 0148 MSM0021622413 0021622413,MSM MSM0021622415 24