Příloha 1. Návod pro laboratorní úlohu

Podobné dokumenty
Příloha 2. Návod pro laboratorní úlohu

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DEKOCHINÁTU METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - FUMONISIN B 1 A B 2

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS - aflatoxin B1, B2, G1 a G2

L 54/116 CS Úřední věstník Evropské unie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU A SEMDURAMICINU METODOU HPLC

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/85

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SEMDURAMICINU METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MELAMINU A KYSELINY KYANUROVÉ METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU A A VITAMÍNU E METODOU HPLC

L 54/76 CS Úřední věstník Evropské unie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU LC/MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU NEPOVOLENÝCH DOPLŇKOVÝCH LÁTEK METODOU LC-MS

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/89

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - OCHRATOXIN A

L 54/80 CS Úřední věstník Evropské unie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Stanovení obsahu celkového a volného tryptofanu metodou HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU MADURAMICINU METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS

Stanovení vit. A a vit. E metodou HPLC v krmivech a premixech dopl ňkových látek

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv Vydání 1 STANOVENÍ OBSAHU KOKCIDIOSTATIK METODOU LC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU 5-VINYL - 2-THIOOXAZOLIDONU (GOITRINU) METODOU GC

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU D METODOU HPLC

Jednotné pracovní postupy analýza půd STANOVENÍ OBSAHU PERFLUOROALKYLOVÝCH SLOUČENIN (PFAS) METODOU LC-MS/MS

Standardní operační postup

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MYKOTOXINŮ METODOU HPLC - ZEARALENON

L 54/32 CS Úřední věstník Evropské unie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU C METODOU HPLC

Stanovení složení mastných kyselin

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Analýza kofeinu v kávě pomocí kapalinové chromatografie

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VITAMÍNU A A VITAMÍNU E METODOU HPLC S UV DETEKCÍ

L 54/66 CS Úřední věstník Evropské unie

Metodický postup pro stanovení PAU v půdách volných hracích ploch metodou HPLC a GC

STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU REZIDUÍ POLÁRNÍCH PESTICIDŮ METODOU LC-MS

Chyby spektrometrických metod

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU GTH METODOU GC-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU REZIDUÍ POLÁRNÍCH PESTICIDŮ METODOU LC-MS

UNIVERZITA PARDUBICE Fakulta chemicko-technologická Katedra analytické chemie. Nám. Čs. Legií 565, Pardubice.

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU POLYBROMOVANÝCH DIFENYLETERŮ METODOU GC-MS

STANOVENÍ ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY METODOU FOTOCHEMILUMINISCENCE NA PŘÍSTROJI PHOTOCHEM

STANOVENÍ KOFEINU V NÁPOJÍCH METODOU HPLC

Konfirmace HPLC systému

Jednotné pracovní postupy testování odrůd STANOVENÍ OBSAHU TANINŮ V ČIROKU SPEKTROFOTOMETRICKY

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ. Stanovení těkavých látek

STANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ

Stanovení fenolických látek pomocí kapalinové chromatografie

LABORATOŘE OBORU I ÚSTAV ORGANICKÉ TECHNOLOGIE

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU KADMIA A OLOVA METODOU FAAS

VYUŽITÍ BEZKONTAKTNÍ VODIVOSTNÍ DETEKCE PRO HPLC SEPARACI POLYKARBOXYLÁTOVÝCH DERIVÁTŮ CYKLENU. Anna Hamplová

ANALÝZA EXTRAKTU PODLE MEHLICHA 3 METODOU ICP-OES

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU KOBALTU METODOU ICP-MS

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MĚDI, ŽELEZA, MANGANU A ZINKU METODOU FAAS

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ. Stanovení těkavých látek

ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU SELENU METODOU ICP-OES

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU ARSENU, KOBALTU, CHROMU A NIKLU METODOU ICP-OES

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Problémy v kapalinové chromatografii. Troubleshooting

Zajištění správnosti výsledků analýzy kotininu a kreatininu

Danica Pospíchalová. Stanovení nelegálních drog a jejich metabolitů v odpadních vodách

Stanovení sacharidů ve vybraných přírodních matricích pomocí kapalinové chromatografie s odpařovacím detektorem rozptylu světla (HPLC-ELSD)

ERYTHROMYCINI ETHYLSUCCINAS. Erythromycin-ethylsukcinát

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU DRASLÍKU, SODÍKU, HOŘČÍKU A VÁPNÍKU METODOU FAAS/FAES

OPTIMALIZACE METODY ANODICKÉ ROZPOUŠTĚCÍ VOLTAMETRIE PRO ANALÝZU BIOLOGICKÝCH VZORKŮ S OBSAHEM RTUTI

Postup ke stanovení báze metamfetaminu metodou GC-FID

L 54/72 CS Úřední věstník Evropské unie

CS Úřední věstník Evropské unie L 54/59

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

Studijní materiál HMF_1 1. Hydroxymethylfurfural a jeho stanovení v potravinách 2. Kapalinová chromatografie (HPLC, UPLC)

LABORATOŘ ANALÝZY POTRAVIN A PŘÍRODNÍCH PRODUKTŮ

P. Martinková, D. Pospíchalová, R. Jobánek, M. Jokešová. Stanovení perfluorovaných organických látek v elektroodpadech

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VÁPNÍKU, DRASLÍKU, HOŘČÍKU, SODÍKU A FOSFORU METODOU ICP-OES

Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická Fakulta v Hradci Králové Katedra analytické chemie

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv MULTIREZIDUÁLNÍ METODA STANOVENÍ MYKOTOXINŮ METODOU LC-MS/MS

13/sv. 6 CS (80/891/EHS)

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU AMINOKYSELIN

ÚLOHA č. 9 PLYNOVÁ ROZDĚLOVACÍ CHROMATOGRAFIE (GLC) Seznámení s metodou, stanovení methylalkoholu a ethylalkoholu v konzumním destilátu

PROCES REALIZACE ANALÝZY

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU REZIDUÍ PESTICIDŮ METODOU LC-MS

Stanovení chmelových silic metodou SPME GC

HPLC-ED AMINOBIFENYLŮ POMOCÍ BOREM DOPOVANÉ DIAMANTOVÉ FILMOVÉ ELEKTRODY

MINIATURIZACE PRŮTOKOVÝCH ELEKTROCHEMICKÝCH CEL PRO GENEROVÁNÍ TĚKAVÝCH SLOUČENIN. Jakub Hraníček

Úkoly. Cvičení (datum vaší skupiny)

MOŽNOSTI STANOVENÍ 2-ETHYLHEXYL NITRÁTU V NAFTĚ. OLGA NYKODÝMOVÁ, BOHUSLAV DVOŘÁK, PETRA BAJEROVÁ, ALEŠ EISNER a KAREL VENTURA.

VYUŽITÍ A VALIDACE AUTOMATICKÉHO FOTOMETRU V ANALÝZE VOD

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU VÁPNÍKU MANGANOMETRICKY

Požadavky kladené na úřední laboratoře v oblasti kontroly potravin

Derivační spektrofotometrie a rozklad absorpčního spektra

přesnost (reprodukovatelnost) správnost (skutečná hodnota)? Skutečná hodnota použití různých metod

VYUŽITÍ TEPELNÉHO ZMLŽOVAČE V AAS

Evropský sociální fond Praha & EU: Investujeme do vaší budoucnosti LC-NMR 1. Jan Sýkora

SKUPINOVÁ ANALÝZA MOTOROVÝCH NAFT

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU MASTNÝCH KYSELIN V OLEJÍCH A TUCÍCH METODOU GC

Příloha 1: Série chromatogramů vybraných standardů polyfenolických látek zaznamenány pomocí metody HPLC s detekcí UV-DAD.

Jednotné pracovní postupy zkoušení krmiv STANOVENÍ OBSAHU ARSENU METODOU ICP-MS

Transkript:

Příloha 1. Návod pro laboratorní úlohu VYSOKÁ ŠKOLA CHEMICKO-TECHNOLOGICKÁ V PRAZE ÚSTAV CHEMIE A ANALÝZY POTRAVIN Technická 5, 166 28 Praha 6 tel./fax.: + 420 224 353 185; jana.hajslova@vscht.cz Analýza fytoestrogenů daidzeinu a genisteinu v sóji, sójových potravinách a krmivech technikou HPLC-DAD

Analýza fytoestrogenů daidzeinu a genisteinu v sóji, sójových potravinách a krmivech technikou HPLC-DAD 1. Vymezení oboru metody Cílem této úlohy je seznámit studenty s aplikací techniky HPLC-DAD při kontrole hladin fytoestrogenů daidzeinu a genisteinu v sójových bobech, sójovém extrudátu, sójové mouce, sójových klíčcích, krmivu s přídavkem sóji atd. Danou metodou lze stanovit i celkový obsah daidzeinu a genisteinu po kyselé hydrolýze přítomných glykosidů (daidzin, genistin a jejich malonyl popř. acetyl estery). Vedoucí úlohy nejprve shrne základní informace o aplikačním potenciálu techniky HPLC- DAD a poté bude demonstrovat funkci instrumentu. Studenti pak pod dohledem pedagoga provedou vlastní analýzu. Podle požadovaného rozsahu úlohy vyučující rozhodne, jestli budou studenti analyzovat již připravený a přečištěný extrakt nebo budou v rámci laboratorní práce připravovat extrakt (případně hydrolyzát), který budou před vlastním stanovením ještě přečišťovat. Diskutována bude interpretace získaných záznamů a odhad pracovních charakteristik postupu. Zjištěné hladiny fytoestrogenů budou diskutovány s údaji v literatuře. 2. Princip metody Stanovení volných aglykonů a glykosidů vedle sebe Analyty se extrahují z matrice 80%ním methanolem. Hrubý extrakt se přečistí metodou SPE. Vlastní stanovení se provede pomocí HPLC-DAD. Stanovení celkového obsahu daidzeinu a genisteinu ve vzorku Glykosidy daidzeinu a genisteinu se zhydrolyzují pomocí kyselé hydrolýzy (HCl) za tepla. Získaný hydrolyzát se přečistí pomocí SPE a vlastní stanovení se provede pomocí HPLC-DAD 3. Chemikálie a laboratorní pomůcky Chemikálie, spotřební materiál, standardy methanol (LichroSolv for HPLC gradient grade, Merck, Nemecko) ethanol konzumní, velejemný deionizovaná voda (přečištěná z destilované vody pomocí zařízení Milli-Q, Millipore, Německo) chlorovodíková kyselina (p.a., Penta, Česká Republika) octová kyselina (glacial, 99,99+%, Aldrich, Německo) SPE kolonky Oasis HLB 60 mg (Waters) Filtrační papíry, Filtrak (modrý 390, VEB Freiberger) Certifikované standardy : daidzein, genistein - čistota 98%, Sigma, Sloučenina Název CAS number M r Daidzein (DAI) 4',7-Dihydroxyisoflavon 486-66-8 254,2 Genistein (GEN) 4',5,7-Trihydroxyisoflavon 446-72-0 270,2 Příprava zásobních roztoků standardů Zásobní roztoky jednotlivých standardů byly připraveny rozpuštěním 7,9 mg daidzeinu a 11,4 mg genisteinu v 10 ml methanolu. Zásobní standardní roztoky standardů jsou získány

rozpuštěním pevného standardu v methanolu. Takto připravený zásobní standardní roztok uložen v mrazničce při 18 C. Doba použitelnosti 1 rok. Pracovní roztoky standardů, ze kterých jsou pak ředěny jednotlivé koncentrace kalibrační křivky, jsou připravovány ze zásobního standardu ředěním v mobilní fázi. Pracovní standardy jsou uchovávány v chladničce při + 5 C a používají se max. 4 měsíce. Pro ředění jsou používány mikrostříkačky Hamilton (objem 100, 250, 500 a 1000 µl). Při ředění standardních roztoků se používá odměrné kalibrované sklo (ČSN A, třídy K10). Tyto zásobní standardy byly uchovávány v temnu při teplotě 18 C. Přístroje a zařízení Laboratorní homogenizátor 38BL40, Dynamics Corporation of America Ultrazvuková lázeň Topné hnízdo, LTHS 100, Brněnská Drutěva v.d. Rotační vakuová odparka Büchi Rotavapor R-114 s vodní lázní B-480, (Švýcarsko) Automatická SPE: Aspec XL, Gilson, Francie Kapalinový chromatograf HP 1200 (Hewlett-Packard, USA) s DAD a FLD detektorem Analytická kolona a předkolona pro kapalinovou chromatografii: Discovery C18, 15 cm x 3 mm x 5 µm; Guard columm C18, 2 cm x 0,4 mm x 5 µm; Supelco, Německo 4. Popis jednotlivých kroků experimentu Příprava vzorku Vzorky jsou před analýzou skladovány v temnu při laboratorní teplotě. Vzorky bobů a krmiv jsou homogenizovány pomocí laboratorního homogenizátoru. Sójová mouka není dále upravována. A) Stanovení obsahu volného daidzeinu, genisteinu a kumestrolu Asi 1 g homogenizovaného vzorku je extrahován 3x20 ml směsi methanol:voda (80:20, v/v) 3x20 minut na ultrazvukové lázni. Jednotlivé extrakty se filtrují (filtr 390) a filtrační koláč se promýje extrakční směsí (cca 10 ml). Spojené filtráty se doplní nebo zahustí na vakuové rotační odparce na známý objem. Přečištění extraktu Odebraný alikvotní podíl extraktu se přečistí metodou SPE. Kolonky (Oasis HLB) se kondicionují 5 ml methanolu a 5 ml vody. Methanolický extrakt se ředí vodou v poměru 1 ml extraktu: 3 ml vody. Na kolonku se nanese potřebné množství zředěného extraktu (4-12 ml). Dále se vymyjí nečistoty 5 ml 10% vodného roztoku methanolu. Analyty se eluují 8 ml methanolu. Eluát se odpaří do sucha na vakuové rotační odparce a odparek se rozpustí v mobilní fázi. B) stanovení obsahu celkového daidzeinu, genisteinu a kumestrolu Asi 1 g homogenizovaného vzorku byl hydrolyzován kyselinou chlorovodíkovou (10 ml 6mol/l) se 40 ml 96% ethanolu v jednom podílu. Směs byla zahřívána pod zpětným chladičem při teplotě varu ethanolu po dobu 4 hodin. Po ukončení hydrolýzy spolu s extrakcí byla směs doplněna na známý objem. Přečištění extraktu Extrakt se po hydrolýze přečistí metodou SPE stejným způsobem jako extrakt pro stanovení volného daidzeinu a genisteinu.

Pokud je vzorek po SPE rozpuštěný v mobilní fázi zakalený, odstředí se na rotační bubnové odstředivce (1 ml, 3 min, 4000 ot/min) a čistý supernatant se odebere pro HPLC analýzu. HPLC-DAD analýza Parametry separace (HP 1200) Analytická kolona: Discovery C18, 15 cm 3 mm 5 µm, SUPELCO Předkolonka: Discovery Guard column C18 2 cm 0,4 mm 5 µm, SUPELCO Mobilní fáze: methanol : 0,1% octová kyselina (vodný roztok, v/v), gradient (0 min. 30 % methanol - 16 min. 75 % methanol - 16,1 min. 100% methanol 18 min. 100 % methanol; 4 min. post run) Teplota kolony: 45 C Nástřik vzorku: 20 µl Objemový průtok: 0,7 ml/min Nastavení DAD detektoru Vlnová délka pro měření: 260 nm, referenční vlnová délka 360 nm Pro analytické stanovení je používána vlnová délka odpovídají absopčnímu maximu sledovaných analytů: Výhodou DAD detektoru je možnost zjištění těchto absorpčních maxim a tím i možnost stanovení cílových analytů při největší citlivost detekce (viz obr. 1). UV spektra jako mohou sloužit jako další možnost identifikace sledovaných látek (kromě retenčních časů), softwarová funkce peak purity je vhodná ke zjištění případných koelucí ze vzorku. daidzein genistein Obrázek 1 UV spektrum daidzeinu a genisteinu

5. Vyhodnocení naměřených dat Pro vyhodnocení nálezů v reálných vzorcích je nutno připravit směsný rozpouštědlový standard daidzeinu a genisteinu v mobilní fázi. Ke kvantifikaci se použije model kalibrační křivky. Součástí protokolu vypracovaného v souladu s interními předpisy Ústavu chemie a analýzy potravin budou i popsané chromatogramy. 6. Stanovení pracovních charakteristik (výsledky validace) Výtěžnost V současné době není komerčně dostupný vhodný certifikovaný referenční materiál pro dané matrice a analyty. Výtěžnost metody byla ověřena opakovanou analýzou uměle kontaminovaných vzorků, výtěžnost čistícího kroku je pravidelně ověřena použitím roztoku standardu, který je pak analyzován v dané sekvenci spolu s reálnými vzorky. Opakovatelnost Opakovatelnost metody byla stanovena jako relativní směrodatná odchylka (RSD, %) získaná opakovanými analýzami vzorku (n = 6). Ke stanovení RSD byly použity matrice uměle kontaminované standardy cílových analytů na hladiny 50-250 µg/l. Rozsah metody a linearita Vzhledem k tomu, že se sledované analyty mohou v reálných vzorcích vyskytovat v širokém rozsahu koncentrací, je nutné volit kalibrační rozsah koncentrací standardu v dostatečně širokém rozmezí odpovídajícím reálným nálezům. Linearita je ověřena v rozsahu koncentrací měřených standardů (20 ng/ml 5000 ng/ml) pomocí regresního koeficientu R 2 (0,9999). Mez detekce: Mez detekce (LOD) byla stanovena jako nejmenší množství analytu ve vzorku, které lze ještě spolehlivě detekovat s přihlédnutím k šumu v okolí eluční zóny (píku) analytu. LOD zde byla stanovena jako poměr signálu a šumu 3/1 Pracovní charakteristika Analyt Výtěžnost % Opakovatelnost (RSD) % LOD mg/kg Daidzein 90,1 4,1 3,5 Genistein 84,5 4,9 2,8 Příklad analýzy reálných vzorků Analýza krmiva: byly analyzovány dva druhy krmiva sója a rybí moučka. Na obr. 2 je uveden chromatogram vzorků krmiva a analytických standardů. V rybí moučce byly nálezy analytů pod detekčním limitem, v krmivu s přídavkem sóji bylo nalezeno 107,8 mg/kg daidzeinu a 174,6 mg/kg genisteinu. Poměr obsahu genisteinu a daidzeinu ve vzorku krmiva se sójou je cca 1,6. Ten odpovídá běžnému poměru nálezů těchto analytů v sóji, který se pohybuje v intervalu 1,5 1,7. Dle údajů v literatuře se hladiny analytů daidzeinu a genisteinu pohybují podle odrůdy sóji v rozmezí 100 560 mg/kg pro daidzein a 150 840 mg/kg pro genistein.

mau 50 DAD1 A, Sig=260,4 Ref=360,100 (C:\HANAPA~1\HP_DP0~1\3_03032.D) DAD1 A, Sig=260,4 Ref=360,100 (C:\HANAPA~1\HP_DP0~1\SOJA_03.D) DAD1 A, Sig=260,4 Ref=360,100 (C:\HANAPA~1\HP_DP0~1\MOUCKA_B.D) genistein 40 30 daidzein 20 10 0-10 -20 7.5 8 8.5 9 9.5 min Obrázek 2 Ukázka chromatogramu vzorku krmiva: a) modře standard (daidzein c = 790 ng/ml, genistein c = 570 ng/ml), b) červeně - vzorek sóji c) zeleně vzorek rybí moučky