Masarykova univerzita Lékařská fakulta EPIDEMIOLOGIE KANDIDÉMIÍ VE FN BRNO, LABORATORNÍ IDENTIFIKACE KVASINEK

Masarykova univerzita Lékařská fakulta EPIDEMIOLOGIE KANDIDÉMIÍ VE FN BRNO, LABORATORNÍ IDENTIFIKACE KVASINEK Bakalářská práce v oboru zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Iva KOCMANOVÁ Autor: Františka JURČOVÁ Brno, duben 2015

Jméno a příjmení autora: Františka Jurčová Název bakalářské práce: Epidemiologie kandidémií ve FN Brno, laboratorní identifikace kvasinek Pracoviště: Oddělení klinické mikrobiologie FN Brno Vedoucí bakalářské práce: Mgr. Iva Kocmanová Rok obhajoby bakalářské práce: 2015 Souhrn: Kandidémie patří mezi závažné infekce krevního řečiště způsobované rodem Candida, u kterých je důležitá včasná laboratorní diagnostika a identifikace původce. Cílem této práce bylo osvojení technik používaných k identifikaci kvasinek a jejich porovnání, zhodnocení případů kandidémií ve FN Brno a porovnání se světovými daty. Práce je rozdělena na část teoretickou, která se zabývá vlastnostmi rodu Candida, onemocněním, která způsobuje a laboratorní diagnostikou kvasinek. Praktická část obsahuje provedenou laboratorní diagnostiku kvasinek a zpracovaná data z FN Brno. Klíčová slova: kandidémie, kvasinky, Candida, identifikace, MALDI-TOF Souhlasím, aby práce byla půjčována ke studijním účelům a byla citována dle platných norem.

Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně pod vedením Mgr. Ivy Kocmanové a uvedla v seznamu literatury všechny použité literární a odborné zdroje. V Brně dne. Františka Jurčová

Na tomto místě bych ráda poděkovala vedoucí své bakalářské práce Mgr. Ivě Kocmanové za její odborné rady, cenné připomínky, ochotu a čas, který mi věnovala.

Obsah Seznam použitých zkratek... 8 1 Úvod... 9 I TEORETICKÁ ČÁST... 10 2 Charakteristika kvasinek... 10 3 Rod Candida... 11 3.1 Taxonomické zařazení... 11 3.2 Morfologie... 11 3.3 Epidemiologie... 11 3.4 Faktory virulence... 12 3.4.1 Adherence a tvorba biofilmu... 12 3.4.2 Hydrolytické enzymy... 13 3.4.3 Přepínání fenotypu... 13 3.5 Charakteristika jednotlivých druhů... 13 3.5.1 Candida albicans... 13 3.5.2 Candida glabrata... 13 3.5.3 Candida parapsilosis... 14 3.5.4 Candida tropicalis... 14 3.5.5 Candida krusei... 14 4 Onemocnění způsobená rodem Candida... 15 4.1 Povrchové kandidózy... 15 4.2 Systémové kandidózy... 15 4.2.1 Kandidémie... 16 4.3 Imunita... 17 4.4 Léčba... 18 5 Diagnostika kvasinek... 19 5.1 Odběr a zpracování materiálu... 19 5.1.1 Materiál u povrchových infekcí... 19

5.1.2 Materiál slizničních infekcí a systémových mykóz... 19 5.2 Mikroskopie... 20 5.3 Kultivace... 21 5.4 Identifikace kvasinek... 21 5.4.1 Kultivace na chromagaru... 21 5.4.2 Aglutinace... 22 5.4.3 Kultivace na mediích chudých na živiny... 22 5.4.4 Auxanogramy... 23 5.4.5 MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie... 24 5.4.6 Molekulární metody... 25 5.5 Stanovení citlivosti k antimykotikům... 27 5.6 Sérologické metody... 28 II PRAKTICKÁ ČÁST... 29 6 Cíle a hypotézy práce... 29 7 Laboratorní diagnostika kvasinek... 30 7.1 Materiál a metody... 30 7.1.1 Mikroorganismy... 30 7.1.2 Pomůcky a přístroje... 30 7.1.3 Kultivační půdy... 30 7.1.4 Naočkování kmenů... 31 7.1.5 Kultivace při 37 C... 31 7.1.6 Kultivace na Chromagaru Candi... 31 7.1.7 Kultivace na rýžovém agaru... 32 7.1.8 Auxanogram... 32 7.1.9 API test... 32 7.1.10 Aglutinace... 33 7.1.11 Gramovo barvení vybraných kmenů... 33 7.1.12 MALDI TOF... 33

7.2 Výsledky... 34 7.3 Diskuze... 41 8 Epidemiologie kandidémií ve Fakultní nemocnici Brno... 43 8.1 Kritéria výběru dat... 43 8.2 Počet případů... 43 8.3 Zhodnocení rodů a druhů... 44 8.4 Zhodnocení podle pohlaví... 48 8.5 Věk pacienta... 50 8.6 Oddělení... 53 8.7 Zhodnocení podle diagnóz... 57 8.8 Případy s více druhy z jednoho vzorku... 62 8.9 Opakovaně pozitivní hemokultury... 63 8.10 Diskuze... 64 Závěr... 66 Použitá literatura... 67

Seznam použitých zkratek ARO Anesteziologicko-resuscitační oddělení BG 1,3-β-D-glukan C. Candida C. inconsp. Candida inconspicua CNS centrální nervová soustava Cr. Cryptococcus ELISA enzyme-linked immunosorbent assay EORTC/MSG European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group G glukóza GI gastrointestinální Chl. chlamydokonidie CHR chromagar L laktóza M maltóza MIC minimální inhibiční koncentrace My. mycelium např. například PA peptonový agar PATH Prospective Antifungal Therapy S sacharóza SABA Sabouraudův agar s antibiotiky SAP sekretované asparagové proteinázy T trehalóza TFA trifluoroctová kyselina Tr. Trichosporon

1 Úvod Kvasinky rodu Candida patří mezi významné původce mykotických onemocnění. Přirozeně se vyskytují u zdravých lidí jako komenzálové v gastrointestinálním traktu, pochvě, v dutině ústní a na kůži, při oslabení imunitního systému však způsobují povrchové i systémové mykózy. Velice závažnou formou systémové mykózy je kandidémie, při které kvasinky pronikají do krevního řečiště, mohou způsobovat septický stav a následné úmrtí pacienta. V těchto případech je důležitá včasná diagnostika a vhodná léčba antimykotiky. Pro diagnostiku je důležitá jak preanalytická, tak analytická část. Cílem je spolehlivě identifikovat původce a určit jeho citlivost k antimykotikům v co nejkratším čase a současně efektivně využít finanční prostředky. U systémových kandidóz, obzvláště kandidémií, je kladen důraz na zkracování času potřebného k identifikaci kvasinek. Nejčastěji izolovanou kvasinkou je C. albicans, ovšem narůstá výskyt i non-albicans druhů. Celkový počet případů přímo souvisí s narůstajícím počtem imunokompromitovaných pacientů (např. pacienti po transplantacích, léčení imunosupresivy, HIV pozitivní, ) a s narůstajícím počtem invazivních operačních postupů, ale také s profylaktickým podáváním antimykotik u některých skupin pacientů (akutní leukemie, transplantace krvetvorné tkáně apod.) 9

I TEORETICKÁ ČÁST 2 Charakteristika kvasinek Kvasinky jsou skupina hub, které jsou většinou jednobuněčné a množí se nepohlavně pučením. Jsou to kulaté či oválné buňky, velké přibližně 3-15 µm, některé rody mohou tvořit i pseudohyfy (vláknité útvary), což jsou podlouhlé buňky, které zůstaly po pučení spojené a neoddělily se. Souboru těchto buněk se říká pseudomycelium. Některé druhy kvasinek mohou vytvářet i tzv. pravé mycelium (vlákno vzniklé příčným dělením protáhlých buněk). (Votava 2010) Kvasinky mohou kvasit cukry za vzniku ethanolu a oxidu uhličitého. Většinou žijí saprofyticky, ale mohou být původci onemocnění člověka, především u imunokompromitovaných pacientů. (Votava 2010) 10

3 Rod Candida 3.1 Taxonomické zařazení Říše: Fungi Kmen: Ascomycota Podkmen: Ascomycotina Třída: Ascomycetes Řád: Saccharomycetales Čeleď: Saccharomycetaceae Rod: Candida (DoctorFungus 2007) 3.2 Morfologie Kandidy patří mezi dimorfní houby, tvoří kvasinkovitou formy (blastospory) i vláknitou formu (hyfy/pseudohyfy). Kvasinkovitá forma bývá většinou saprofytická, vláknitá patogenní. (Jedličková 2006) Velikost kvasinkové formy se pohybuje kolem 3-5 µm, mají kulatý či oválný tvar a množí se pučením. Protáhlé blastospory, které tvoří větvené řetízky, nazýváme pseudohyfy. Kandidy mohou vytvářet také pravé hyfy skládající se z více buněk, které dohromady utvářejí septa. (Bednář 1996) V klinickém materiálu nejvíce zastoupený druh, Candida albicans, může také tvořit rezistentní buňky (chlamydokonidie) jedná se o větší, kulaté útvary se silnou stěnou, bývají umístěny na koncích hyf a po jejich stranách. Dále se vyznačuje schopností germinace neboli tvorbou zárodečných klíčků (germ tubes), které mají vzhled jemných vláken vyrůstající z blastokonidií. (Bednář 1996) 3.3 Epidemiologie U zdravých lidí kandidy obvykle mohou kolonizovat celý gastrointestinální (GI) trakt od dutiny ústní až po konečník, jako komenzálové se mohou vyskytovat také ve vagině, močové trubici, na kůži nebo pod nehty. (Murray 2013) Kolonizace na těchto místech se může stát zdrojem infekce, pokud dojde k přemnožení kvasinek a jejich invazi. Příčinou může být 11

oslabení imunitního systému či narušení normální mikroflóry. Většinou jsou tedy kandidózy endogenního původu. (Votava 2010) Exogenně se může kandidóza přenášet mezi lidmi navzájem (nosokomiální kandidózy, vyvolané vysoce virulentními kmeny), kontaminovanými předměty (např. venózní katetry), infuzními roztoky apod. (Bednář 1996) Onemocnění způsobené rodem Candida může být primární (u zdravých lidí, infikováni vysoce virulentními kmeny) nebo sekundární (pacienti s oslabenou imunitou a hospitalizovaní se závažným základním onemocněním). (Bednář 1996; Sardi et al. 2013) Mezi faktory, které přispívají k rostoucímu počtu případů mykotických onemocnění, patří intravenózní katetry, parenterální výživa, invazivní operace, nadměrné užívání širokospektrálních antibiotik, cytotoxická chemoterapie a transplantace. (Sardi et al. 2013) Kandidy mohou způsobovat řadu onemocnění od povrchové kandidózy po život ohrožující systémové kandidózy. Povrchové kandidózy postihují kůži, nehty, sliznici v dutině ústní a v pochvě. Systémová kandidóza může být lokalizovaná nebo diseminovaná a spojená se sepsí. (Greenwood et al. 1999) Nejčastějším původcem kandidózy je C. albicans, patogenní pro člověka jsou i C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei, C. lusitaniae, C. guilliermondii, C. dubliniensis, C. rugosa a další. (Murray 2013) 3.4 Faktory virulence Virulence se liší u různých druhů rodu Candida. Mezi faktory virulence patří schopnost adherence, tvorba biofilmu, produkce hydrolytických enzymů, germinace a tvorba hyf. 3.4.1 Adherence a tvorba biofilmu Základním faktorem virulence je schopnost adherence na povrch hostitelských buněk, díky které jsou kvasinky schopny buňky kolonizovat. Mohou adherovat na epiteliální buňky, endoteliální buňky, fibrin nebo umělé materiály (kanyly, protézy). (Bednář 1996) Kandidy mohou také vytvářet biofilm (specifické organizované komunity buněk řízené signálními molekulami, nejedná se o náhodné nahromadění buněk po buněčném dělení). Biofilm zvyšuje rezistenci vůči antimykotikům. (Sardi et al. 2013) Tuto schopnost mají kromě C. albicans i C. parapsilosis, C. tropicalis a C. glabrata. (Silva et al. 2009) Adheziny se specificky vážou na aminokyseliny a cukry na povrchu buněk nebo pomáhají adherenci na nebiologické povrchy. (Verstrepen a Klis 2006) 12

Adhezinem C. albicans je mananprotein, který na povrchu buněk tvoří fibrilární vrstvu. Chrání také buňky před fagocytózou a tím dále zvyšuje jejich virulenci. Kmeny bez této struktury jsou nevirulentní. (Bednář 1996) 3.4.2 Hydrolytické enzymy Extracelulární hydrolytické enzymy hrají významnou roli v adherenci, průniku do tkáně, invazi a destrukci hostitelské tkáně. Nejvýznamnější hydrolytické enzymy produkované kvasinkami jsou proteázy a fosfolipázy.(sardi et al. 2013) SAP (sekretované asparagové proteinázy) mají vliv na adherenci, zničení tkání a změnu v imunitní odpovědi. C. albicans má 10 izoenzymů, dále byly popsány u C. tropicalis, C. parapsilosis a C. guilliermondii. SAP jsou kódovány SAP1-10 geny. (Sardi et al. 2013) U fosfolipáz bylo objeveno 7 kódujících genů, ale pravděpodobně pouze PLB1 má roli ve virulenci u živočichů. (Sardi et al. 2013) 3.4.3 Přepínání fenotypu Přepínání fenotypu ( phenotypic switching ) přispívá ke schopnosti přizpůsobit se aktuálním podmínkám, pomáhá také snadnějšímu průniku do tkání a invazi, vláknité formy totiž pronikají lépe do tkání než kvasinkovité formy. Tuto schopnost má především C. albicans a C. dubliniensis. (Bednář 1996; Sardi et al. 2013) 3.5 Charakteristika jednotlivých druhů 3.5.1 Candida albicans Candida albicans je nejčastěji izolovaná kvasinka z klinického materiálu. Žije jako saprofyt, ale může být i oportunním patogenem, způsobuje infekce kůže, dutiny ústní (moučnivka, soor), vaginální kandidózy, u oslabených jedinců způsobuje invazivní infekce s vysokou mortalitou. (Votava 2010) Morfologická charakteristika v kapitole 3.2. 3.5.2 Candida glabrata Candida glabrata je druhá nejčastěji izolovaná kvasinka rodu Candida, není schopna tvořit pseudohyfy, zárodečné klíčky a pravé hyfy, ale může vytvářet biofilm, její buňky jsou navíc výrazně menší (1-4µm), než u ostatních kvasinek. Relativně snadno si vytvoří rezistenci 13

vůči flukonazolu a dalším azolům. (Murray 2013; Sardi et al. 2013; Silva et al. 2012) Na rozdíl od C. albicans, pro kterou má z hlediska virulence klíčovou roli tvorba hyf a sekrece proteináz, u C. glabrata nemají žádný význam. (Kaur et al. 2005) C. glabrata se vyskytuje spíše při močových infekcích, systémovou mykózu způsobuje méně často, nicméně její četnost při invazivních infekcích záleží také na skladbě pacientů a existuje vztah mezi incidencí sepsí způsobených C. glabrata a dlouhodobě používanou profylaxí flukonazolem. (Greenwood et al. 1999; Pfaller a Diekema 2010) Častěji se vyskytuje u dospělých než u dětí a novorozenců. (Silva et al. 2012) 3.5.3 Candida parapsilosis Candida parapsilosis dorůstá velikosti 2,5-4µm, nevytváří hyfy, pouze pseudohyfy, může vytvářet biofilm.(silva et al. 2012) Je méně virulentní než C. albicans a C. tropicalis, ale je významným nozokomiálním patogenem, ačkoliv byla dříve spojována spíše s endokarditidou u drogově závislých pacientů. (Weems 1992) C. parapsilosis má vysokou afinitu k parenterální výživě, často kolonizuje ruce zdravotnických pracovníků a vytváří biofilm na povrchu protéz a venozních katetrech, často ohrožuje nedonošené novorozence. (Trofa et al. 2008) 3.5.4 Candida tropicalis Candida tropicalis patří mezi tři nejčastěji izolované non-albicans druhy z hemokultur a moči, je velká 4-8µm, vytváří hyfy a pseudohyfy, netvoří zárodečné klíčky. Nejčastěji je spojována s pacienty s neutropenií a malignitami, často se vyskytuje u pacientů s dlouhodobou katetrizací a léčených dlouhodobě antibiotiky. (Silva et al. 2012) 3.5.5 Candida krusei Buňky C. krusei jsou na rozdíl od ostatních kandid protáhlého oválného tvaru připomínající dlouhozrnnou rýži. (Samaranayake a Samaranayake 1994) C. krusei je přirozeně rezistentní vůči flukonazolu, proto se často vyskytuje u pacientů flukonazolem profylakticky léčených, dále často u neutropenických pacientů, pacientů po transplantaci kmenových buněk a u hematoonkologických pacientů. (Pfaller et al. 2014) 14

4 Onemocnění způsobená rodem Candida 4.1 Povrchové kandidózy Kandidové infekce dutiny ústní se vyskytují především u pacientů s poruchou systémové či lokální imunity, konkrétně u HIV pozitivních pacientů, novorozenců, podvyživených pacientů, diabetiků nebo dlouhodobě léčených antibiotiky. Této infekci se také říká moučnivka (soor), na sliznici úst a jazyka se tvoří bílé povlaky, takže vypadají jako posypané moukou. Infekce se může rozšířit i na jícen, obzvláště u imunokompromitovaných pacientů. (Anaissie et al. 2009; Votava 2010) Kandidóza střeva bývá nejčastější v tenkém střevě, může vést k hematogenní infekci a přechodu do systémové mykózy, obstrukci střeva a může dojít i k perforaci. (Anaissie et al. 2009) Kandidová infekce kůže je poměrně častá u novorozenců, může se jednat i o vrozenou kandidózu. Nebezpečím kožních lézí je riziko vzniku diseminované formy, mohou však být také projevem a diagnostickou hodnotou kandidemie u neutropenických pacientů. (Anaissie et al. 2009; Zazula et al. 2005) Kandidová infekce nehtů postihuje nehtovou ploténku rukou i nohou, dochází ke ztluštění nehtového lůžka, změně barvy na žlutohnědou, zduření nehtových valů. (Korandová 2014) Vulvovaginální kandidóza je častým onemocněním žen, projevuje se především svěděním a výtokem z pochvy, ten může být bílý až tvarohovité konzistence nebo vodnatý, vagina je bolestivá, podrážděná. Pacienti mohou být i asymptomatičtí (jedná se o kolonizaci). (Sobel et al. 1998; Sobel 2007) 4.2 Systémové kandidózy Pro systémové kandidózy je charakteristická invazivní infekce s postižením orgánů, jsou zde zařazeny orgánová a diseminovaná kandidóza. (Zazula et al. 2005) Orgánová kandidóza často zasahuje močový trakt, plíce, srdce, centrální nervovou soustavu (CNS), oko, kosti a klouby, játra a slezinu. (Zazula et al. 2005; Anaissie et al. 2009) Kandidóza plic je většinou sekundární (vzniká hematogenní cestou), primárně vzniká přímým vdechnutím, ale spíše výjimečně. Při izolaci rodu Candida z moči se může jednat o kontaminaci (např. u žen s vulvovaginální kandidózou), kolonizaci (často u pacientů s obvyklými systémovými rizikovými faktory diabetes, imunokompromitovaní, atd.; nebo 15

s lokálními rizikovými faktory např. zavedení katetru) nebo o infekci močového měchýře či ledvin. Sekundární kandidóza ledvin může být projevem sepse způsobené kandidémií. U infekcí srdce může Candida způsobovat endokarditidu, myokarditidu i perikarditidu. Infekce CNS jsou poměrně vzácné, vznikají sekundárně u pacientů s kandidémií, častěji u novorozenců než u dospělých. Oční infekce může být spojena s úrazem oka nebo je sekundární u kandidémie, stejně tak je většina infekcí kostí a kloubů sekundární u kandidémie. (Anaissie et al. 2009) 4.2.1 Kandidémie Při kandidémii jsou kvasinky přítomné v krvi, nemusí vždy docházet k postižení orgánů, ale je časté. Může probíhat jako akutní či chronická forma. Akutní forma probíhá podobně jako sepse. U dětí dochází ke vzniku meningitidy častěji než u dospělých, může dojít také k postižení dalších orgánů (viz výše). (Anaissie et al. 2009) Klinické projevy jsou nespecifické, významným příznakem je přetrvávající horečka, případně septický stav nereagující na léčbu širokospektrálními antibiotiky. Může dojít k diseminaci do jakéhokoliv orgánu, nejčastěji dochází k postižení jater, sleziny a ledvin. (Ráčil et al. 2007) Chronická forma je méně častá, většinou se vyskytuje u pacientů s akutní leukémií léčených cytotoxickou chemoterapií. Klinicky se projevuje přetrvávající horečkou nereagující na antibiotika, často negativní hemokulturou, bolestmi břicha (zejména v pravém horním kvadrantu), nevolností, zvracením, zvýšenými jaterními testy a přítomností abscesů v játrech, případně slezině, plicích a ledvinách. (Anaissie et al. 2009) EORTC/MSG (European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group) stanovila podmínky potvrzení invazivní kvasinkové infekce. (De Pauw et al. 2008) O potvrzenou kandidémii se jedná, pokud je splněna jedna podmínka: a) histopatologicky, cytopatologicky nebo přímou mikroskopií vzorku získaného biopsií z normálně sterilního místa (jiné než sliznice) prokáže buňky kvasinek (obzvláště pseudohyfy nebo pravé hyfy u Candid) b) je kultivačně prokázána Candida spp. ze vzorku sterilně odebraného (včetně drénu zavedeného 24 hodin) z normálně sterilního místa s klinickými nebo radiologickými známkami odpovídající infekčnímu procesu c) Pozitivní hemokultura na kvasinky (Candida species) 16

O pravděpodobnou kandidémii se jedná, pokud jsou splněny současně hostitelské podmínky, klinická kritéria i mykologická kritéria. Pokud jsou splněny pouze hostitelské faktory a klinická kritéria, je kandidémie možná. 1. Hostitelské faktory (např. nedávná neutropenie, příjemce transplantace kmenových buněk, dlouhodobá léčba kortikosteroidy, léčba imunosupresivy potlačující T- lymfocyty nebo zděděné těžké imunodeficience) 2. Klinická kritéria (např. kvasinkové onemocnění dolních cest dýchacích, sinonasální infekce, infekce CNS, diseminovaná kandidóza nejméně 1 z následujících nálezů po epizodě kandidémie v předchozích 2 týdnech malé terčovité abscesy v játrech nebo slezině nebo progresivní retinální exsudáty na očním pozadí) 3. Mykologická kritéria (např. β-d-glukan detekovaný v séru) Kategorie jisté infekce může být použita pro jakéhokoliv pacienta (tj. bez ohledu na imunokompetenci), zatímco kategorie pravděpodobné a možné infekce jsou navrženy pouze pro imunokompromitované pacienty. Některé skupiny pacientů jsou ke vzniku kandidémie náchylnější než jiní. Mezi rizikové faktory patří: kolonizace, parenterální výživa, neutropenie, dlouhodobá léčba imunosupresivy, intravaskulární katetry, popáleniny, nedonošení novorozenci, břišní operace, transplantace kmenových buněk nebo orgánu, parenterální užívání drog, chronická granulomatózní choroba, nedostatek myeloperoxidázy u neutrofilů, dlouhodobá léčba antibiotiky, nedávná operace mozku, AIDS, selhání ledvin nebo hemodialýza, diabetes mellitus. (Anaissie et al. 2009) 4.3 Imunita V obraně organismu proti kvasinkám se uplatňuje jak imunita vrozená, tak získaná. První linií obrany je mechanická bariéra zabraňující průniku kvasinek do organismu, tu tvoří kůže a slizniční membrány, dále se na ní podílí přirozená bakteriální mikroflóra a řasinkový epitel dýchacích cest. Důležitost těchto mechanismů se projeví především při jejich narušení - úrazem, popáleninami, zavedením katetru, narušením přirozené mikroflóry podáváním širokospektrálních antibiotik. (Anaissie et al. 2009) Dalším důležitým mechanismem, který se uplatňuje po proniknutí kvasinek do organismu, je fagocytóza, při které dojde k pohlcení buňky kvasinky a nitrobuněčnému zničení uvnitř fagocytující buňky. S nimi úzce spolupracují i T-lymfocyty. (Votava 2010) 17

4.4 Léčba Léčba kvasinkových infekcí se provádí léčivy působícími na kvasinky a plísně, antimykotiky. Lze je rozdělit do několika skupin na azoly, polyeny, echinokandiny a ostatní. Azoly působí na tvorbu ergosterolu nezbytnou součást buněčné stěny hub, čímž dojde oslabení buněčné membrány. Mezi azoly řadíme dvě skupiny látek imidazoly a triazoly. Imidazoly se používají většinou k lokální léčbě, řadíme k nim např. ketokonazol, klotrimazol a mikonazol. Triazoly se používají k léčbě povrchových i systémových onemocnění. Flukonazol patří mezi hojně používané antimykotikum, které však nelze použít u původců C. glabrata a C. krusei. Používá se především u pacientů bez neutropenie, lze ho použít i k léčbě kandidémie. Profylaktické podávání flukonazolu má významný vliv na snížení výskytu invazivních mykotických onemocnění u některých skupin pacientů. Do první generace triazolů patří kromě flukonazolu také itrakonazol. Do druhé generace řadíme vorikonazol a posakonazol. U vorikonazolu byla prokázána účinnost při léčbě kandidémie. (Diatková et al. 2012) Polyeny působí také na buněčnou membránu kvasinek, vážou se na ergosterol v membráně a poškozují její integritu. Amfotericin B deoxycholát byl hojně používaným antimykotikem vhodným i pro léčbu kandidémií, avšak použití je limitováno kvůli vysoké toxicitě především nefrotoxicitě a ztrátě iontů (kalium a magnézium). Méně toxické jsou lipidové přípravky amfotericinu B: lipozomální amfotericin B, amfotericin B lipidový komplex a amfotericin B koloidní disperze. (Diatková et al. 2012) Echinokandiny působí přímo na tvorbu buněčné stěny s následkem lýzy buňky. Mezi echinokandiny patří kaspofungin, mikafungin a anidulafungin. Všechny jsou v intravenózní podobě, mají dobrý průnik do tkání kromě mozkomíšního moku. Jsou doporučovány, pokud se jedná o infekci C. glabrata nebo C. krusei. (Diatková et al. 2012) Mezi ostatní antimykotika patří flucytosin, který se však používá k léčbě kryptokokových infekcí, nikoliv kandidóz. (Ráčil et al. 2008) 18

5 Diagnostika kvasinek Diagnostika kvasinek je postavena na stejných základech jako diagnostika bakterií: mikroskopické pozorování odebraného materiálu, následná kultivace a identifikace. Z hlediska léčby infekce je také důležité stanovení citlivosti k antimykotikům. 5.1 Odběr a zpracování materiálu Pro laboratorní diagnostiku kvasinek je důležitý správně provedený odběr a zpracování vyšetřovaného materiálu. Odebíraný materiál závisí na druhu infekce, při povrchových infekcích se nejčastěji odebírají šupiny kůže, vlasy a nehty, u slizničních infekcí jsou nejčastější stěry, u systémových krev, vzorky tkání, moč, likvor, tekutina z bronchoalveolární laváže, sputum, exsudáty, hnis, punktáty. Důležité je také zajistit odběr vzorku před podáním antimykotik. (Votava 2010) 5.1.1 Materiál u povrchových infekcí Kožní šupiny jsou odebírány skalpelem, pokud možno z okraje infikované oblasti, protože z těchto míst je nejvyšší pravděpodobnost záchytu a úspěšné kultivace. Před odběrem je místo dekontaminováno 70% alkoholem, odběr se provádí do sterilní zkumavky. Vlasy a chlupy se odebírají sterilní pinzetou, nejlépe přímo z ložiska. Je důležité, aby vzorek obsahoval i vlasovou cibulku. U nehtů se seškrabují šupinky napadených nehtů ze spodní strany nehtu. Stěry sterilním tamponem se používají u mokvavých lézí. Vzorky se transportují do laboratoře ve zkumavkách neupravované, zalévání bujonem se nedoporučuje. (Votava 2010) 5.1.2 Materiál slizničních infekcí a systémových mykóz Stěry se používají u slizničních mykóz a ran, u popállenin lze použít i otiskovou metodu (přiložení sterilního navlhčeného filtračního papíru nejpve na popálenou plochu a posléze na kultivační půdu - Sabouraudův agar). Vzorky tkání při systémových nebo invazivních mykózách je třeba co nejdříve zpracovat, odběr musí probíhat asepticky. (Votava 2010) Krev je odebírána do sterilních lahviček s bujónem, které jsou součástí automatizovaných systémů (BactAlert, Bactec). 19

5.2 Mikroskopie Přímá mikroskopie může pomoci rychle rozhodnout, zda se jedná o kvasinky, pokud jsou pozorovány typické útvary (chlamydokonidie, arthrokonidie), můžeme orientačně zařadit i do rodu C. albicans nebo Trichosporon. Pozorovat můžeme preparát nativní nebo barvený. Jako základ se používá Gramovo barvení prováděné i v mikrobiologických vyšetřeních. (Anaissie et al. 2009) Nativní preparát se připraví tak, že se na podložní sklo kápne kapka biologického vzorku, pevný vzorek se rozmělní a homogenizuje v kapce fyziologického roztoku na podložním skle. Preparát se překryje krycím sklíčkem a pozoruje v mikroskopu. (Juránková 2011) Gramovo barvení se používá k barvení buněčné stěny, v bakteriologii se používá k rozlišení grampozitivních (modré) a gramnegativních (červené) bakterií. Kvasinky na sebe vážou Gramovo barvivo, barví se modře až modrofialově. (Juránková 2011) Preparát se připravuje podobně jako nativní, nepřekrývá se však krycím sklem, ale nechá se zaschnout. Po zaschnutí je sklíčko fixováno plamenem (3x protažení). Postup Gramova bavení po zafixování zaschlého nátěru na podložním skle: Gram I 20 sekund Oplach vodou Lugolův roztok 20 sekund Oplach vodou Odbarvení alkoholem 10 sekund Oplach vodou Safranin 60 sekund Oplach vodou a osušení Preparát pozorujeme s použitím imerzního oleje a objektivu (10x100). Louhový preparát se běžně používá při pozorování kožních šupin, nehtů nebo vlasů, k lepšímu pozorování mykotických elementů se využívá KOH k projasnění tkáně. Materiál se vloží do kapky 10-40% KOH na podložním skle a překryje se krycím sklíčkem, po 30-60 minutách se přebytečný KOH odsaje a jemně se zatlačí na krycí sklíčko (kvůli roztlačení materiálu do tenčí vrstvy). (Votava 2010) Výhodné je také využití barviv, která se vážou na chitin v buněčných stěnách hub a kvasinek, např. MykoInk, chlorazolová čerň, nebo fluorescenční barviva Calcofluor, Rylux BSU nebo Blancophor. Nespecifické barvivo, které lze také k obarvení použít je Lugolův roztok. Postup při fluorescenční mikroskopii: připraví se roztok smícháním 0,1% roztoku fluorescenčního barviva a 20% roztoku KOH v poměru 1:1, do něho se vloží vzorek. Po 20

15 minutách se preparát prohlíží přes krycí sklo ve fluorescenčním mikroskopu. (Votava 2010; Juránková 2011) 5.3 Kultivace Kultivace je důležitá pro určení rodu a druhu kvasinek, základní kultivační půdou je Sabouraudův agar, který bývá obohacený o antibiotika k potlačení růstu bakterií a o cukr (glukóza, dextróza, maltóza). Přesné složení podle výrobce Conda na 1l média: 40g dextrózy, 10g peptonové směsi, 15g agaru a 0,5g chloamfenikolu. (Laboratorios Conda, S.A.) Protože kvasinky rostou pomaleji než bakterie, kultivuje se alespoň 4-5 dní v termostatu při 28-30 C. Hemokultury jsou kultivovány ve speciálních automatizovaných kultivačních systémech. Kultivují se při 35 C přímo v odběrových lahvičkách (speciální mykologické nebo aerobní lahvičky). Přístroj pravidelně lahvičky kontroluje, jsou protřepávány, pozitivita vzorků je určována na základě detekce vznikajícího oxidu uhličitého v lahvičce. (Horvath et al. 2004) Pokud je hemokultura pozitivní, určuje se původce. Nejprve se mikroskopicky zhodnotí nátěr na sklíčko, následně lze využít dražší metody pro přímou identifikaci z hemokultury nebo se očkuje na Sabouraudův agar a kultivuje. 5.4 Identifikace kvasinek Kvasinky jsou saprofyté člověka, přesná identifikace kvasinek je důležitá zejména v případech, kdy se jedná o závažnou infekci, čili pozitivní kultivační výsledek je z jinak sterilního materiálu (krev, likvor, bioptický materiál apod.). Na základě identifikace a stanovení citlivosti k antimykotikům se poté rozhoduje o léčbě. Po kultivaci na Sabouraudově agaru se hodnotí barva, velikost a povrch kolonií, pro většinu kvasinek je typický hladký povrch kolonií, zatímco vláknité houby mají povrch drsný spíše vatovitý. (Votava 2010) 5.4.1 Kultivace na chromagaru Jedná se o selektivní a diferenciální půdu, která se používá k rychlé identifikaci a diferenciaci druhů Candida z klinických vzorků. (Sivakumar et al. 2009) Podle studie má dokonce lepší schopnost inhibovat růst bakterií než Sabouraudův agar. Díky chromagaru lze 21

poměrně spolehlivě odlišit C. albicans od ostatních kvasinek, i některé další kvasinky se specificky barví. (Silva et al. 2004) Principem rozdílného barevného růstu je reakce enzymů mikroorganismů s chromogenním substrátem. (Sivakumar et al. 2009) C. albicans roste na půdě v odstínech modré až zelené, C. krusei v typicky růžových koloniích. C. tropicalis roste typicky v modrých koloniích, ale může růst i v zelených, poté je špatně odlišitelná od C. albicans. (Sivakumar et al. 2009; Hospenthal et al. 2002) Chromagar vyrábí několik výrobců, jednotlivé půdy se liší zbarvením různých druhů kvasinek i cenou. 5.4.2 Aglutinace Aglutinace se využívá například k rozlišení C. albicans a C. dubliniensis, protože na chromagaru je nelze spolehlivě odlišit. Na latexových částicích jsou navázány monoklonální protilátky, které se specificky vážou na antigen na povrchu C. dubliniensis. Výsledkem reakce je okem pozorovatelná aglutinace. Na stejném principu je i aglutinace pro rychlé zařazení do druhu C. krusei. (ElitechGroup) Test bývá prováděn pomocí komerčně dodávaných setů, dle návodu výrobce. Zpravidla se jedná o tento postup: na destičku se nakape reagencie, do které se zamíchá kolonie vyšetřovaného kmene, pozoruje se přítomnost/nepřítomnost aglutinace. Obrázek 1: Princip latexové aglutinace 5.4.3 Kultivace na mediích chudých na živiny Pro kultivaci se využívá rýžový agar, bramborový agar nebo kukuřičný agar. Jsou to media chudá na živiny, na kterých se sleduje schopnost kvasinek tvořit pseudomycelium, mycelium a chlamydospory. (Votava 2010; Juránková 2011) Produkci chlamydospor u C. albicans při kultivaci na kukuřičném agaru lze zvýšit přidáním Tween 80 do kultivačního media, u rýžového agaru Tween 80 produkci nezvyšuje. Dle studie je nejlepším mediem pro 22

pozorování tvorby chlamydospor rýžový agar a kukuřičný agar obohacený o Tween 80. (Rosenthal a Furnari 1959) Obrázek 2: Tvorba chlamydospor C. albicans na rýžovém agaru (Mallátová a Mencl 2010) Mycelium i chlamydokonidie na půdách chudých na živiny tvoří C. albicans a C. dubliniensis. Pouze mycelium tvoří C. parapsilosis, C. krusei a Trichosporon asahii. C. tropicalis tvoří mycelium, chlamydokonidie mohou, ale nemusí být pozorovány. C. glabrata a Cryptococcus neoformans mycelium ani chlamydokonidie nevytváří. (Joshi 1975) 5.4.4 Auxanogramy Auxanogram patří mezi identifikační metody založené na biochemické aktivitě kvasinek, v případě auxanogramu se prokazuje schopnost kvasinky asimilovat různé zdroje uhlíku. (Votava 2010) V 5,5 ml fyziologického roztoku se suspendují kolonie kvasinek na zákal McFarland 2, na peptonový agar se část objemu nalije, rozlije po celé ploše a zbytek se odsaje Pasteurovou pipetou. Miska se nechá uschnout, poté se na misku položí disky s cukry (nejčastěji se jedná o glukózu, sacharózu, laktózu, maltózu a trehalózu). Misky se kultivují 24 hodin v termostatu při 30 C ± 1 C. Vizuálně se hodnotí růst v přítomnosti cukru (+) a bez růstu (-). V současné době se využívají komerční sety pro přesnější identifikaci, například ID32C od firmy biomérieux běžně používaný v Evropě nebo API 20C používaný spíše ve Spojených státech amerických, oba dva sety mají srovnatelné výsledky. V obou případech jsou kolonie kvasinek suspendovány v roztoku na určitý zákal, poté jsou nakapány do stripu a kultivovány s kultivačním mediem obsahujícím konkrétní sacharid. Po uplynutí stanovené doby kultivace 23

se vizuálně hodnotí pozitivita nebo negativita jamek na základě zákalu jamky. Výsledky jsou převedeny na kód, který je následně vyhodnocen podle vzoru nebo pomocí přístroje. (Ramani et al. 1998) Tabulka 1: Očekávané výsledky auxanogramu vybraných druhů G S L M T C. albicans + + - + +/- C. glabrata + - - - + C. krusei + - - - - C. tropicalis + + - + + C. kefyr + + + - - C. parapsilosis + + - + + S. cerevisiae + +/- - +/- - C. dubliniensis + + - + +/- Tr. asahii + + + + + Cr. neoformans + - + + +/- Kromě auxanogramu existují také zymogramy, při kterých se zjišťuje schopnost kvasinek fermentovat cukry (např. glukózu, sacharózu, laktózu a maltózu). 5.4.5 MALDI-TOF hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time of flight) patří mezi velmi moderní metody určené pro rychlou a spolehlivou identifikaci kvasinek. (Lima-Neto et al. 2014) MALDI-TOF MS (s hmotnostním spektrometrem) využívá k identifikaci mikroorganismů druhově specifické šablony hmotnosti peptidů a proteinů, díky kterým lze identifikovat široké spektrum bakterií a kvasinek. (Murray 2013) Existuje několik způsobů přípravy vzorku pro analýzu od přímého nanášení vzorku a zakápnutí kyselinou mravenčí, přes extrakci pomocí ethanolu a kyseliny mravenčí, u sporulujících organismů se používá extrakce pomocí TFA (trifluoroctová kyselina). Laser hmotového spektrometru MALDI-TOF ozáří nanosekundovým pulsem směs vzorku a matrice, přičemž matrice absorbuje energii pulsu a její rozklad ionizuje molekuly vzorku, především ve vysokých koncentracích přítomné ribosomální proteiny. Pozitivně nabité ionty jsou pak na krátkou vzdálenost urychleny silným elektrickým polem a vstupují do vakua v trubici detektoru, kde se pohybují rychlostí úměrnou jejich hmotnosti a náboji. Doby letu iontů se velmi přesně měří a výpočetně se konvertují na poměr molekulové hmotnosti a náboje. (Státní veterinární ústav Jihlava) 24

Výsledné spektrum je porovnáno s databází spekter a analyzovaný vzorek je identifikován. V případě neúspěchu nebo nejednoznačné identifikace lze analýzu zopakovat nebo přistoupit k molekulárním metodám. 5.4.6 Molekulární metody Molekulární metody se dají považovat za vrchol současné diagnostiky v mykologii, využívá se při nich DNA kvasinek. Tyto metody jsou velice přesné, ale také dražší než nemolekulární metody. U těchto metod je obzvláště důležité vyhnout se kontaminaci vzorku, proto se manipulace s nimi prování ve sterilních boxech. PNA FISH (Peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization) je rychlá metoda k identifikaci bakterií a kvasinek, lze ji využít i na přímou identifikaci z pozitivních hemokultur bez nutnosti kultivovat na SA a získat čisté kolonie. (Harris a Hata 2013) Metoda se provádí pomocí setů dodávaných výrobcem, na sklíčku se smíchá kapka fixačního roztoku a kapka pozitivní hemokultury, po uschnutí se sklíčko fixuje (plamenem nebo methanolem), přidá se PNA sonda a překryje se krycím sklíčkem. Hybridizuje se v termostatu, poté se sklíčko ponoří do předehřátého promývacího roztoku, odstraní se krycí sklíčko a inkubuje se. Po inkubaci se sklíčka nechají uschnout, přidá se kapka montážního media, překryje se krycím sklíčkem. Hodnotí se fluorescenčním mikroskopem při zvětšení objektivu 60x nebo 100x. (AdvanDx) Obrázek 3: Výsledek PNA FISH, C. albicans (vlevo), C. glabrata (uprostřed) a C. tropicalis (vpravo) (AdvanDx) Real-time PCR lze použít přímo pro vzorky odebrané krve do zkumavky s citrátem nebo EDTA. Prvním krokem je izolace DNA, která se provádí pomocí dodávaných kitů, principem je lýza lidských krevních buněk dříve než se rozpadnou buňky se stanovovanou DNA. Vyizolovaná DNA se smíchá se směsí primerů, sond a Master Mixem, provede se amplifikace DNA v cykleru podle programu: počáteční denaturace při 95 C 10 minut, následuje 50 cyklů denaturace po 10s při 95 C, annealing 10s při 58 C a elongace 20s při 72 C, závěrem analýza 25

křivky tání. Záznam amplifikace se provádí pomocí fluorescence sond navázaných na nově vznikající DNA. (Susanne Gebert et al. 2008; Wellinghausen et al. 2009) DNA microarray je založeno na principu párování komplementárních bází nukleotidů DNA, nejprve se provede izolace DNA, následuje multiplex PCR (umožňuje současnou amplifikaci více řetězců DNA), označení molekul DNA fluorescenční značkou, aplikace na čip a hybridizace, omytí a skenování čipu. (Ferrari et al. 2013; Spiess et al. 2007) Obrázek 4: Výsledky microarray DNA (Spiess et al. 2007) DNA sekvenováním lze navázat na metody PCR, pomocí sekvenování lze určit přesné pořadí nukleotidů v nareplikovaném úseku DNA. Tuto metodu lze využít k přesnému rozlišení některých druhů, např. k odlišení C. dubliniensis od C. albicans. (Kiraz et al. 2014) 26

5.5 Stanovení citlivosti k antimykotikům Stanovení citlivosti k antimykotikům je důležitý krok z hlediska zvolení vhodné léčby, u kvasinek se používají kvalitativní metody (diskový difuzní test) a kvantitativní metody (E-test, diluční test). Pomocí diskového difuzního testu lze kvalitativně určit, zda je testovaný kmen k antimykotiku citlivý či rezistentní. Na povrch Mueller-Hintonova agaru s přídavkem glukózy a metylenové modři se nalije 05,ml připraveného inokula (denzita 0,5 McFarland pro kandidy, 1McFarland pro Cr. neoformans), přebytek se odsaje pipetou. Otevřená miska se nechá zaschnout, poté jsou aplikovány disky napuštěné testovanými antimykotiky. Kultivuje se 24-48 hodin při 35-37 C, hodnotí se velikost zóny kolem disku až do 80% inhibice růstu kvasinek. (BioVendor) Diskový difuzní test je ovšem standardizován pouze pro flukonazol a vorikonazol a některé kvasinkové druhy. V ostatních případech jsou výsledky testu nestandardizované. Pomocí E-testu lze stanovit minimální inhibiční koncentraci (MIC) antimykotika. Na kultivační půdu RPMI se nalije suspenze kolonií kvasinek ve fyziologickém roztoku (denzita 0,5 McFarland pro kandidy, 1 McFarland pro Cr. neoformans), přebytek se odsaje Pasteurovou pipetou a nechá zaschnout. Proužek napuštěný gradientem antimykotika se pokládá od konce s nejnižší koncentrací, mezi proužkem a agarem nesmí vzniknout vzduchové bubliny. Kultivuje se při 35-37 C, 24-48 hodin pro kandidy, 48-72 hodin pro kryptokoky. MIC lze stanovit i za pomocí mikrodilučního testu (Sensititre YeastOne, TREK Diagnostic Systems, UK) a to i pomocí přímého testování citlivosti z pozitivních hemokultur. (Avolio et al. 2009) Stanovení se provádí na deskách potažených antimykotiky v příslušném ředění, dle pokynů výrobce se do jamek na desce aplikují vzorky, kultivuje se nejméně 24 hodin při 35 C. Výsledky jsou vizuálně hodnoceny, u pozitivních jamek dochází ke změně zbarvení z modré na červenou. (MCS DIAGNOSTICS 2012) V obou případech se hodnotí nejnižší koncentrace, při které je růst inhibován. O citlivost či rezistenci k testovanému antimykotiku se rozhoduje podle stanovených break-pointů. 27

5.6 Sérologické metody Pokud je třeba rychlý průkaz mykózy, lze využít i sérologické metody, které detekují mykotické antigeny nebo protilátky tvořené proti nim. Reakce jsou založené na principu vazby antigen-protilátka, často uspořádání ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Velkou nevýhodou nepřímého průkazu (detekce tvořených protilátek) je riziko falešné pozitivity u zdravých jedinců, která vzniká přirozenou reakcí na kvasinky saprofytické a vyskytující se v prostředí, a falešné negativity u imunosuprimovaných pacientů, u kterých nemusí být dostatečná protilátková odpověď. (Votava 2010) Příkladem časného průkazu invazivní kvasinkové infekce může být detekce mannanového antigenu (povrchový antigen rodu Candida) v kombinaci s detekcí protilátek proti němu (antimannan). V lidském séru nebo plazmě je lze stanovit např. pomocí imunoenzymatické sendvičové reakce. Zředěné vzorky séra/plazmy se nanesou do jamek mikrotitrační destičky, na které je navázán antigen (pokud stanovujeme protilátky) nebo protilátka (pokud stanovujeme antigen). Po inkubaci při 37±1 C se destička promyje, přidá se konjugát (protilátky značené peroxidázou), po další inkubaci se znovu promyje. Pokud byl ve vzorku přítomný antigen/protilátka, dojde ke vzniku sendvičového komplexu, přidáním chromogenu (obsahuje substrát pro peroxidázu) se komplex vizualizuje a vzniklé zbarvení se měří na spektrofotometru. (Bio-Rad) Panfungální antigen 1,3-β-D-glukan (BG) je součástí vnější buněčné stěny saprofytických a patogenních hub, je uvolňován do krve pacientů s invazivní mykotickou infekcí. (Kędzierska et al. 2007) Detekce se může provádět kalorimetrickou metodou pomocí lyzátu z ostrorepa. BG aktivuje faktor G, který aktivuje koagulační enzym odštěpující pna z chromogenního peptidového substrátu a vytváří chromofor absorbující pří 405 nm. (Obayashi et al. 1995; Associates of Cape Cod Inconporated 2007) 28

II PRAKTICKÁ ČÁST 6 Cíle a hypotézy práce Cíle praktické části bakalářské práce shrnuté v bodech: - osvojení technik laboratorní diagnostiky kvasinek - porovnání výsledků získaných pomocí MALDI-TOF a postupem bez použití MALDI- TOF - zhodnocení získaných dat o hemokulturách kultivačně pozitivních na kvasinky a porovnání se světovými daty MALDI-TOF je moderní metoda využívaná po celém světě, lze předpokládat, že identifikace kmenů s využitím této metody bude mít vyšší úspěšnost oproti postupu identifikace bez použití této metody. V České republice je úroveň zdravotnictví srovnatelná s ostatními vyspělými státy, proto lze očekávat, že získaná data o hemokulturách kultivačně pozitivních na kvasinky budou s nimi porovnatelná. 29

7 Laboratorní diagnostika kvasinek 7.1 Materiál a metody 7.1.1 Mikroorganismy K vypracování praktické části bakalářské práce bylo použito 15 kmenů kvasinek vyizolovaných od pacientů FN Brno z různých klinických materiálů. 7.1.2 Pomůcky a přístroje - mikrobiologické kličky - kahan - zapalovač - sterilní špičky k automatické pipetě (Associates of Cape Cod) - stojan na zkumavky - nastavitelná automatická pipeta (Brand, LabSystem) - termostat 35-37 C (BT 120) - komorový termostat 29-31 C - skleněné zkumavky se sterilním fyziologickým roztokem - prázdné sterilní skleněné zkumavky - sterilní Pasteurovy pipety - diagnostický set API 32C (BioMérieux) - Biotyper (Bruker) - McFarlandova stupnice (BioMérieux) - bambusová párátka - mravenčí kyselina (Bruker) - matrice pro MALDI TOF (α-kyano-4-hydroxy-skořicová kyselina) (Bruker) - set ELITex Bicolor dubliniensis (ELITech Microbio) 7.1.3 Kultivační půdy - Sabouraudův agar obohacený o antibiotika (zkratka SABA; Conda) - Rýžový agar (Conda) - Chromagar Candi (Trios) - Peptonový agar na auxanogramy (zkratka PA; Conda) 30

7.1.4 Naočkování kmenů Misky se Sabouraudovým agarem s antibiotiky (dále SABA) byly popsány označením kmenu a datem. Z Petriho misek s vybranými kmeny bylo provedeno rozočkování na SABA vytemperovaný na pokojovou teplotu: vyžíhanou kličkou bylo nabráno několik kolonií a hustě natřeno asi do 1/3 misky se SABA, vyměněnou vyžíhanou kličkou hádkem rozočkováno, znovu vyměněnou kličku rozočkováno, dalším hádkem vyplněn volný prostor Petriho misky (viz Obrázek 5). Obrázek 5: Schéma očkování Misky byly kultivovány dnem vzhůru v komorovém termostatu při 30 C ± 1 C 48 hodin. Po uplynutí doby byla zhodnocena barva a vzhled kolonií. 7.1.5 Kultivace při 37 C Petriho misky se SABA byly rozděleny fixou na 6 částí, popsány datem a označením kmenů. Vykultivované kmeny byly naočkovány jednoduchým hádkem do příslušných částí. Misky byly kultivovány 48 hodin při 37 C ± 1 C. 7.1.6 Kultivace na Chromagaru Candi Petriho misky s Chromagarem Candi byly rozděleny fixou na 3 části, popsány datem a označením kmenů. Kmeny byly naočkovány nejdříve hustým nátěrem, který byl následně rozočkován hádkem vyžíhanou kličkou. Misky byly kultivovány 48 hodin při 30 C ± 1 C. 31

7.1.7 Kultivace na rýžovém agaru Petriho misky s rýžovým agarem byly rozděleny fixou na 4 části, popsány datem a označením kmenů. Kmeny byly naočkovány jednoduchým hádkem, misky byly kultivovány při 30 C ± 1 C 48 hodin. 7.1.8 Auxanogram Ve zkumavkách s fyziologickým roztokem byly suspendovány kolonie kvasinek na zákal McFarland 2. Na vytemperovaný peptonový agar bylo napipetováno Pasteurovou pipetou přibližně 2ml připravené suspenze, rozlito po celé ploše misky, přebytek byl odsán. Misky uschly dnem dolů, na suchou misku poté byly naneseny disky s glukózou (G), sacharózou (S), laktózou (L), maltózou (M) a trehalózou (T) dle schématu (viz Obrázek 6). Misky byly kultivovány při 30 C ± 1 C 48 hodin. Obrázek 6: Rozmístění disků 7.1.9 API test Tři skleněné zkumavky s víčkem byly naplněny 2ml sterilní vody, do které byly suspendovány kolonie kvasinek třech vybraných kmenů na zákal McFarland 2. 250µl této suspenze bylo napipetováno do lahvičky s API C mediem dodávaným výrobcem soupravy. Po promíchání bylo napipetováno 135µl do každé jamky destičky diagnostické soupravy (celkem 32 jamek). Souprava byla kultivována 48 hodin při 30 C ± 1 C. 32

7.1.10 Aglutinace Pomocí setu ELITex Bicolor dubliniensis byla provedena aglutinace pro rozlišení C. albicans a C. dubliniensis. Do kruhu na diagnostické kartičce bylo napipetováno 20µl homogenizované reagencie TEST LATEX. Kličkou bylo nabráno několik kolonií kmene, který byl rozmíchán v kapce reagencie a rozetřen po celé ploše kruhu. 7.1.11 Gramovo barvení vybraných kmenů Pro Gramovo barvení bylo vybráno 5 kmenů. Na dvě podložní sklíčka bylo kápnuto 5 kapek fyziologického roztoku. Do každé kapky bylo kličkou rozmícháno několik kolonií daného kmene. Po zaschnutí a zafixování v plameni byly skla barveny krystalovou violetí po dobu 20 sekund, Lugolovým roztokem po dobu 20 sekund, alkoholem po dobu 10 sekund a safraninem po dobu 60 sekund. Mezi jednotlivými kroky byla sklíčka oplachována vodou. Osušená sklíčka byla pozorována v mikroskopu s použitím imerzního oleje. 7.1.12 MALDI TOF Pomocí bambusového párátka byly naneseny testované kmeny do pozic dle schématu. Každá pozice byla překryta 1 µl kyseliny mravenčí, po zaschnutí byl nanesen 1 µl matrice (kyselina skořicová). Vzorky byly změřeny na hmotnostním spektrometru Biotyper (Bruker). Obrázek 7: Destička připravená pro analýzu 33

7.2 Výsledky Po kultivaci na SABA byla hodnocena barva a vzhled vyrostlých kolonií. Výsledky byly zaznamenány do tabulky (Tabulka 3). Na miskách kultivovaných při 37 C ± 1 C narostly kolonie u všech testovaných kmenů. Na chromagaru Candi narostly kmeny v barvách typických pro určité druhy. (viz Obrázek 8-10) Po kultivaci na rýžovém agaru byla mikroskopicky vyhodnocena tvorba mycelií/pseudomycelií a chlamydokonidií. U auxanogramu se hodnotila schopnost kvasinek růst v přítomnosti daného cukru (asimilace). Výsledky byly zaznamenány do tabulky a podle vzoru bylo provedeno zařazení k určitému druhu. Aglutinace kmene KP 690 byla pozitivní, jedná se tedy o C. dubliniensis. Pozitivita/negativita jamek v API 32C byla odečtena okometricky, výsledky byly zaznamenány do tabulky (Tabulka 2) a vyhodnoceny pomocí počítačového programu mini API (BioMérieux). Obrázek 8: Chromagar Candi, KP 746 (vlevo nahoře), KP 760 hladké (vpravo nahoře) a KP 760 drsné (dole) 34

Obrázek 9: Chromagar Candi, KP 752 (vlevo nahoře), KP 747 (vpravo nahoře), KP 763 velké (dole) Obrázek 10: Chromagar Candi, KP 690 (vlevo nahoře), KP 704 (vpravo nahoře), KP 728 (dole) 35

36 Tabulka 2: Výsledky API 32C testu KP 763 malé GAL ACT SAC NAG LAT ARA CEL RAF MAL TRE 2KG MDG MAN LAC INO 0 + - + + - + - - + - + + + - - - SOR XYL RIB GLY RHA PLE ERY MEL GRT MLZ GNT LVT GLU SBE GLN ESC + + - + - + - - - + + + + + + + Výsledek: Candida parapsilosis KP 746 GAL ACT SAC NAG LAT ARA CEL RAF MAL TRE 2KG MDG MAN LAC INO 0 + + + + + + + - + + + + + + - - SOR XYL RIB GLY RHA PLE ERY MEL GRT MLZ GNT LVT GLU SBE GLN ESC + + + - + + + - + - + - + - + + Výsledek: Trichosporon asahii KP 704 GAL ACT SAC NAG LAT ARA CEL RAF MAL TRE 2KG MDG MAN LAC INO 0 + - + + - - - + + + + + + - + - SOR XYL RIB GLY RHA PLE ERY MEL GRT MLZ GNT LVT GLU SBE GLN ESC + + + - + + - - + + + - + - - + Výsledek: Cryptococcus neoformans

Nátěry na sklíčko nabarvené dle Grama byly prohlédnuty pod mikroskopem (10 x 100, imerze). Z hlediska Gramova barvení lze kvasinky považovat za Gram-pozitivní. Buňky kmene KP 746 měly kulatý až vejčitý tvar, byly nalezeny arthrokonidie (obdélníčkové buňky), buňky kmene KP 760 drsné byly protáhlé až tyčinkovité, bylo pozorováno apikální pučení, tvar buněk kmene KP 752 byl vejčitý. Buňky kmene KP 690 a IN 907 byly různě velké a kulaté. Obrázek 11: Tr. asahii (zvětšení 10x100) Obrázek 12: C. krusei (zvětšení 10x100) 37

Obrázek 13: C. glabrata (zvětšení 10x100) Obrázek 14: Cr. neoformans (zvětšení 10x100) Obrázek 15: C. dubliniensis (zvětšení 10x100) 38

Odběr vzorku Mikroskopie barvení dle Grama* Kultivace na SABA Postup s použitím MALDI-TOF Postup bez použití MALDI- TOF MALDI-TOF + chromagar Chromagar C. albicans C. non-albicans C. albicans C. non-albicans Rýžový agar Auxanogram + Rýžový agar Dourčeno Nedourčeno Dourčeno Nedourčeno API API Obrázek 16: Algoritmus laboratorního vyšetření kvasinek * U materiálů, které lze mikroskopovat 39

40 Tabulka 3: Celkové hodnocení bez MALDI Označení Barva Povrch Auxanogram Rýžový agar Chromagar Candi kmene kolonií kolonií G S L M T Mycelium Chlamydokonidie Hodnocení Zařazení API Závěr C. KP 690 Bílá hladké + + - + - + + (aglutinace +) Tmavě dubliniensis modrá / C. albicans C. dubliniensis KP 704 Bílá hladké + + - + - - - Růžová neurčeno Cr. Cr. neoformans neoformans KP 728 Bílá hladké + + - + + + + Modrá C. albicans C. albicans KP 746 Bílá drsné + + + + + + - Modrá Tr. asahii Tr. asahii Tr. asahii KP 747 Bílá hladké + + - + + + + Modrá C. albicans C. albicans KP 752 Bílá hladké + - - - + - - Růžová C. glabrata C. glabrata KP 760 hladké Bílá hladké + + - + + - - Modrá neurčeno neurčeno KP 760 drsné Bílá drsné + - - - - + - Růžová C. krusei C. krusei KP 763 velké Bílá hladké + + - + + + + Modrá C. albicans C. albicans KP 763 malé Bílá hladké + + - + + - - Bílá neurčeno C. parapsilosis C. parapsilosis KP 765 velké Bílá hladké + + - + + - - Bílá neurčeno neurčeno KP 765 malé Bílá hladké + + - + + + - Bílá neurčeno neurčeno KP 831 žluté Nažloutlá hladké + - - - - - - Bílá neurčeno neurčeno KP 831 bílé Bílá hladké + + - + + - - Modrá neurčeno neurčeno IN 907 Bílá hladké + + - + - - - Bílá neurčeno neurčeno