Primární protilátka CONFIRM anti-vimentin (V9) Primary Antibody

Primární protilátka CONFIRM anti-vimentin (V9) Primary Antibody Katalogové číslo 790-2917 INDIKACE A POUŽITÍ Určené použití Tato protilátka je určena k diagnostickému použití in vitro (IVD). Primární protilátka CONFIRM anti-vimentin (V9) Primary Antibody od společnosti Ventana Medical Systems (Ventana) je myší monoklonální protilátka mouse monoclonal antibody (IgG1) nasměrovaná proti vimentinu. Tato protilátka je určena ke kvalitativní identifikaci vimentinu pomocí světelné mikroskopie v řezech fixovaných ve formalínu, zalitých v parafínu na barvicích automatech Ventana. Klinická interpretace jakéhokoli zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být doplněna morfologickými studiemi a hodnocením řádných kontrol. Hodnocení musí v kontextu klinické anamnézy pacienta a jiných diagnostických testů provádět kvalifikovaný patolog. Pouze na lékařský předpis. Souhrn a vysvětlení Antigen vimentinu je exprimován na endoteliálních buňkách, fibroblastech, buňkách hladkého svalstva a buňkách lymfoidní řady. Řada nádorů souběžně exprimuje vimentin a cytokeratin, např. karcinomy štítné žlázy, pleomorfní adenomy slinných žláz, ovariální karcinomy a některé renální karcinomy. Současná exprese desminu a vimentinu byla hlášena u řady nádorů měkkých tkání, např. rabdomyosarkomů, leiomyosarkomů a sarkomů měkké tkáně alveolů. 1,2,3,4,5 Principy a procedury Produkt CONFIRM anti-vimentin (V9) lze použít jako primární protilátku pro imunohistochemické barvení parafínových tkáňových řezů. Obecně lze říci, že imunohistochemické barvení umožňuje vizualizaci antigenů pomocí sekvenční aplikace specifické protilátky (primární protilátky), která se váže na antigen, sekundární protilátky (vazební protilátky), která se váže na primární protilátku, komplexu enzymů a chromogenního substrátu, což je proloženo promývacími postupy. Enzymatická aktivace chromogenu způsobuje vznik viditelného produktu reakce v místě antigenu. Vzorek pak lze obarvit kontrastním barvivem a zakrýt krycím sklíčkem. Výsledky jsou interpretovány pomocí světelného mikroskopu a pomáhají při rozlišení diagnózy patofyziologických procesů, které mohou nebo nemusí souviset s konkrétním antigenem. Produkt CONFIRM anti-vimentin (V9) je optimálně naředěn pro použití s detekčními soupravami Ventana a barvicími automaty. Každý krok barvicího protokolu je definován přesnou dobou inkubace a specifickou teplotou, při které inkubace probíhá. Na konci každého inkubačního kroku jsou řezy v barvicím automatu Ventana opláchnuty za účelem ukončení probíhající reakce a k odstranění nenavázaného materiálu, který by mohl bránit požadované reakci v následujících krocích. Aby odpařování vodných roztoků reagencí ze vzorků na sklíčkách bylo co nejmenší, nanáší barvicí automat na sklíčka krycí roztok. Barvení je dokončeno po inkubaci s chromogenním substrátem a volitelně barvením kontrastním barvivem. Více informací o provozu přístroje naleznete v příslušném Návodu k obsluze barvicího automatu Ventana. MATERIÁLY A METODY Dodané reagencie Produkt CONFIRM anti-vimentin (V9) obsahuje dostatek reagencie pro 50 testů. 1 5 ml dávkovač CONFIRM anti-vimentin (V9) obsahuje přibližně 12,5 µg (2,5 µg/ml) myší monoklonální protilátky mouse monoclonal antibody nasměrované proti vimentinu přítomnému ve tkáni. Protilátka je naředěna v pufru s obsahem proteinového nosiče a konzervační látky. Rekonstituce, mísení, ředění, titrace Tato protilátka je optimalizována pro použití v barvicích automatech Ventana spolu s detekčními soupravami Ventana. Nevyžaduje se rekonstituce, mísení, ředění ani titrace. Další ředění by mohlo vést ke slabšímu obarvení antigenu. Uživatel musí všechny takové změny ověřit. Rozdíly v přípravě tkání a v technických postupech v laboratoři mohou způsobit výrazně rozdílné výsledky a vyžadují pravidelné používání kontrol (viz část Postupy kontroly kvality). Potřebné materiály a reagencie, které nejsou součástí dodávky Následující reagencie a materiály mohou být k barvení potřebné, ale nejsou dodávány s primární protilátkou: 1. Ventana CONFIRM Negative Control Mouse Ig 2. Mikroskopická sklíčka, pozitivně nabitá 3. Tkáně pro pozitivní a negativní kontrolu 4. Sušička schopná udržovat teplotu 70 C ± 5 C 5. Štítky s čárovým kódem (odpovídající testované negativní kontrole a primární protilátce) 6. 10% neutrální pufrovaný formalín 7. Nádoby nebo lázně na barvení 8. Stopky 9. Xylen 10. Etanol nebo reagenční alkohol 11. Deionizovaná nebo destilovaná voda 12. Tlakový hrnec Biocare Medical* (barvicí automaty ES a NexES IHC) 13. Barvicí nádoby Tissue-Tek * 14. Sériové barvicí automaty ES, NexES IHC, BenchMark Series 15. Detekční soupravy Ventana iview TM DAB, AEC, Alkaline Phosphatase Red a Enhanced Alkaline Phosphatase Red Detection Kit* 16. Ventana Amplification Kit* 17. Ventana Endogenous Biotin Blocking Kit* 18. Software k příslušné detekční soupravě (pouze pro barvicí automat ES) 19. Ventana APK Wash* (10X) (barvicí automaty ES a NexES IHC) 20. Ventana Liquid Coverslip TM (Low Temperature)* (barvicí automaty ES a NexES IHC) 21. Ventana EZ Prep TM (10X)* (barvicí automaty BenchMark Series) 22. Ventana Reaction Buffer (10X)* (barvicí automaty BenchMark Series) 23. Ventana Liquid Coverslip (High Temperature)* (barvicí automaty BenchMark Series) 24. Ventana Cell Conditioning 1 (Pre-dilute) (barvicí automaty BenchMark Series) 25. 10 mm citrát sodný (ph 6,0) 26. Ventana Hematoxylin counterstain 27. Ventana Bluing Reagent 28. Fixační médium 29. Krycí sklo 30. Světelný mikroskop (20-80x) * Podle konkrétní aplikace. Uchovávání a manipulace Uchovávejte při teplotě 2 8 C. Chraňte před mrazem. Uživatel musí ověřit všechny podmínky pro skladování, pokud se tyto podmínky liší od podmínek specifikovaných v příbalové informaci. K zajištění správného nadávkování reagencie a stability protilátky po každém cyklu je nutno dávkovač uzavřít víčkem a okamžitě uložit ve svislé poloze do chladničky. Každý dávkovač s protilátkou má stanovenou dobu expirace. Při řádném skladování zůstane reagencie stabilní do data uvedeného na štítku. Nepoužívejte reagencii po uplynutí data expirace pro předepsanou metodu skladování. Tento výrobek nejeví žádné zjevné známky nestability; proto by se současně s neznámými vzorky měly provádět pozitivní a negativní kontroly. Objeví-li se příznaky nestability reagencie, obraťte se na místní zastoupení společnosti Ventana. Odběr vzorků a příprava pro analýzu Pro použití s primární protilátkou, která je použita s detekčními soupravami Ventana na barvicích automatech Ventana, jsou vhodné tkáně, zpracované běžným způsobem, fixované ve formalínu a zalité v parafínu (viz část Potřebné materiály a reagencie, které nejsou součástí dodávky). Doporučený fixační prostředek pro tkáně je 10% neutrální pufrovaný formalín. 6 Mohou se vyskytnout rozdílné výsledky jako důsledek prodloužené fixace nebo speciálních procesů, například odvápňování preparátů kostní dřeně. Každý řez musí mít správnou tloušťku a musí být umístěn na pozitivně nabité podložní sklíčko. Sklíčka obsahující řezy tkání lze sušit v troubě po dobu nejméně 2 hodin (avšak maximálně 24 hodin) při teplotě 70 C ± 5 C. Postup ručního odparafínování Je potřeba, pokud je použit barvicí automat ES nebo NexES IHC nebo pokud není navolena funkce odparafínování na sériovém barvicím automatu BenchMark Series: 2008-11-20 Strana 1 z 5 18062CS Rev C

1. Podrobnější pokyny, kdy je potřeba opatřit sklíčka štítkem s čárovým kódem, naleznete v kapitole Návod k použití v Návodu k obsluze k příslušnému barvicímu automatu. 2. Ponořte sklíčka postupně do 3 xylenových lázní vždy na 5 ± 1 minut. 3. Přeneste sklíčka do 100% etanolu a ponořte je postupně do 2 lázní vždy 4. Přeneste sklíčka do 95% etanolu a ponořte je do lázně s tímto roztokem 5. Přeneste sklíčka do 80% etanolu a ponořte je do lázně s tímto roztokem 6. Sklíčka přesuňte do lázně s deionizovanou nebo destilovanou vodou a minimálně 10 krát je ponořte. 7. Přeneste sklíčka podle určeného postupu do roztoku APK Wash (1X) nebo do pufrového roztoku. V případě použití roztoku APK Wash musí sklíčka zůstat v roztoku, dokud nejste připraveni provést barvicí cyklus. V případě pufrového roztoku by v něm sklíčka měla zůstat až do zahájení procesu demaskování antigenů. Nenechte sklíčka oschnout. Sklíčka barvená na sériových barvicích automatech BenchMark Series mohou být odparafínována v přístroji. Zvolíte-li tuto možnost, opatřete sklíčka čárovým kódem a umístěte je do přístroje. Jestliže tuto vlastnost nezvolíte, pokračujte podle výše uvedeného Postupu ručního odparafínování. VAROVÁNÍ A BEZPEČNOSTNÍ OPATŘENÍ 1. Při manipulaci s reagenciemi je nutné dodržovat příslušná bezpečnostní opatření. Při manipulaci s podezřelými karcinogeny či toxickým materiálem (např. xylen nebo formaldehyd) používejte jednorázové rukavice. 2. Zabraňte kontaktu reagencií s očima a sliznicemi. Jestliže se reagencie dostanou do kontaktu s citlivými oblastmi, omyjte je vydatným množstvím vody. 3. Se vzorky pacientů a všemi materiály v kontaktu s těmito vzorky by mělo být zacházeno jako s biologicky nebezpečným materiálem a měly by být zneškodněny dle příslušných bezpečnostních opatření. Nikdy nepipetujte ústy. 4. Zamezte mikrobiologické kontaminaci reagencií; mohly by pak poskytovat nesprávné výsledky. 5. Nedodržení příslušných inkubačních dob a teplot může vést k chybným výsledkům. Jakoukoli změnu tohoto druhu musí uživatel ověřit. 6. Reagencie jsou již optimálně naředěny a další ředění by mohlo zapříčinit ztrátu barvení antigenu. Jakoukoli změnu tohoto druhu musí uživatel ověřit. 7. Doporučené metody likvidace jsou uvedeny v celostátních a místních předpisech. 8. Při použití v souladu s pokyny není tento produkt klasifikován jako nebezpečná látka. Konzervační látkou v reagencii je buď ProClin 300, nebo azid sodný (NaN 3 ). Příznaky nadměrné expozice látce ProClin 300 nebo NaN 3 zahrnují podráždění kůže a očí a podráždění sliznic a horních cest dýchacích. Koncentrace látky ProClin 300 v tomto výrobku je menší nebo rovna 0,05%, a nesplňuje tudíž kritéria OSHA pro nebezpečné látky. U citlivých jedinců se mohou objevit systémové alergické reakce. Koncentrace NaN 3 v tomto výrobku je nižší než 0,1%, a nesplňuje tudíž kritéria OSHA pro nebezpečné látky. Usazeniny NaN 3 mohou reagovat s olovem a mědí v potrubí a vytvářet vysoce explozivní azidy kovů. Při likvidaci splachujte dostatečným množství vody, aby nedocházelo k usazování azidů v potrubí. NÁVOD K POUŽITÍ Jednotlivé kroky postupu Primární protilátky Ventana byly vyvinuty za účelem použití v barvicím automatu Ventana ve spojení s detekčními soupravami a příslušenstvím výrobce Ventana. Doporučené barvicí protokoly pro barvicí automaty jsou uvedeny níže v tabulce 1. Parametry automatických procedur lze zobrazit, vytisknout a upravovat podle postupů uvedených v Návodu k obsluze. Některé parametry obsluhy barvicího automatu jsou předem nastaveny výrobcem. Tabulka 1. Doporučené barvicí protokoly pro produkt CONFIRM anti-vimentin (V9) Typ postupu ES nebo NexES IHC Platforma nebo metoda BenchMark Series Odparafínování V systému offline Zvoleno Úprava buněk (odmaskování antigenu) 10 mm citrát sodný (ph 6,0), 2 minuty, tlakový hrnec, 120 C Cell Conditioning 1, standardní Enzym (proteáza) Není vyžadováno Není vyžadováno Protilátka (primární) Cca 16 minut, 37 C Cca 16 minut, 37 C A/B Blok (blokování biotinu) Volitelné Volitelné Amplifikace Volitelné Volitelné Kontrastní barvivo (hematoxylin) Hematoxylin, 2 až 4 minuty Hematoxylin, 2 až 4 minuty Po jádrovém barvení Bluing, 2 až 4 minuty Bluing, 2 až 4 minuty Postupy barvení na barvicích automatech Ventana jsou následující. Další podrobné pokyny a další vlastnosti protokolu naleznete v Návodu k obsluze. Barvicí automaty ES a NexES IHC Je nutno odmaskovat antigen: 1. Parafín se ze sklíček odstraňuje pomocí sérií xylenu a odstupňovaných alkoholů až po vodu a poté v lázni s příslušným pufrem. Proveďte odmaskování antigenu a přeneste sklíčka do roztoku APK Wash (1X). 2. Založte primární protilátku a dávkovače příslušné detekční soupravy a potřebné přídavné reagencie do zásobníku pro reagencie a umístěte zásobník do barvicího automatu. Zkontrolujte nádoby na tekutiny a odpad. 3. Osušte zabarvený konec sklíčka a aplikujte čárový kód, který odpovídá naplánovanému protokolu protilátky. 4. Vyjměte sklíčka, zbavená parafínu, po odmaskování antigenu a opatřená štítky, z roztoku APK Wash (1X). Zamezte vysychání tkání. Postup ručního odmaskování antigenu Ruční odmaskování antigenu je potřebné, používáte-li barvicí automat ES nebo NexES. Postup zhodnocení antigenu (úprava buněk), (pro sklíčka s tkáněmi barvenými na automatu ES, NexES nebo pro ruční metody): 1. Připravte k použití tlakový hrnec. 2. Do tlakového hrnce vložte kazetu se vzorky. Poznámka: Dříve než kazetu umístíte do tlakového hrnce, ujistěte se, že je povrch kazety zcela suchý. Je-li povrch kazety mokrý, z tlakového hrnce se ozve praskání a jakýkoli zbytek vody v hrnci může způsobit jeho poruchu. 3. Zarovnejte držadla kazety s držadly tlakového hrnce. 4. Nalijte do mísy 500 ml deionizované vody a umístěte tepelný kryt (kruhový kryt) doprostřed nádoby. Poznámka: Tepelný štít zabraňuje tepelné deformaci plastových nádob. 5. Umístěte každou barvicí nádobku Tissue-Tek, naplněnou 250 ml 10 mm citrátu sodného (ph 6,0) nebo pufrem EDTA (ph 8,0) v souladu s tabulkou 1 Doporučené barvicí protokoly uvedenou v příbalové informaci pro každou primární protilátku a položte příslušná sklíčka na tepelný kryt, který je umístěn uprostřed mísy. V případě potřeby lze nahradit Cell Conditioning 1 (ph 8,5) pufrem EDTA a Cell Conditioning 2 (ph 6,0) lze nahradit 10 mm citrátu sodného. Do komory lze umístit až 2 nádoby a je třeba se ujistit, že se obě dotýkají tepelného krytu. 6. Zakryjte tlakový hrnec víkem a zajistěte jej (zarovnejte šipku otevřeno s bílou tečkou na držadle mísy. Uchopte rukojeť víka a otočte ve směru pohybu hodinových ručiček do polohy uzavření; jakmile je víko uzavřeno, odvzdušňovací ventil sníží tlak na odvzdušňovací trysce). 7. Nastavte reostat na 10 a hrnec uzavřete a zajistěte (cca 120 C). 8. Tlakový hrnec zapněte a sledujte do doby, dokud tlak v hrnci nedosáhne hodnoty 17 25 psi a teplota nedosáhne 120 C 125 C. Jakmile tlakový hrnec dosáhne požadované teploty, nastavte kalibrovaný časový spínač na 2 minuty, jelikož časovač tlakového hrnce neodpovídá reálnému času. Jakmile se ruční stopky vypnou, vypněte časovač hrnce. Ohřev se vypne a kontrolka se přepne z pozice ohřev na udržování tepla. Poznámka: Je nezbytné, aby technik sledoval teplotu a tlakové podmínky pro potvrzení, že požadované specifikace byly splněny. 2008-11-20 Strana 2 z 5 18062CS Rev C

9. Jakmile je postup usnadnění antigenu dokončen, vypněte tlakový hrnec. 10. Technik může sledovat snižování tlaku pravidelnou kontrolou měřiče tlaku. Jakmile tlak klesne na 0 psi, tlakový hrnec lze bezpečně otevřít. Otočte poklicí proti směru hodinových ručiček a pomalu ji sejměte, aby pára mohla uniknout a neopařila vám ruce. Poznámka: Při otevírání víka buďte velmi opatrní, neboť povrch i kapalina jsou stále velmi horké. 11. Vyjměte nádobu se sklíčky z mísy a umístěte stojany se zpracovanými sklíčky do nádoby s deionizovanou vodou o pokojové teplotě. 12. Jakmile dokončíte oplachování, umístěte sklíčka do stojanu na sklíčka Tissue-Tek naplněného deionizační vodou k udržení vlhkosti, než jsou sklíčka opatřena čárovým kódem. Vyjměte sklíčka jedno po druhém ze stojanu; vysušte matné konce a zkontrolujte, zda se tkáňové řezy během procesu nevysušily. Opatřete sklíčka příslušným štítkem s čárovým kódem a vraťte je do nádoby na sklíčka. Tento postup opakujte se všemi sklíčky. 13. Jakmile jsou všechna sklíčka opatřena štítky, vylijte deionizovanou vodu z nádoby se sklíčky a naplňte roztokem APK Wash (1X). Sklíčka musí zůstat v roztoku až do provedení barvicího cyklu. Barvicí automaty BenchMark Series 1. Opatřete sklíčka štítkem s čárovým kódem odpovídajícím protokolu protilátky, která má být zpracována. 2. Založte primární protilátku a dávkovače příslušné detekční soupravy a potřebné přídavné reagencie do zásobníku pro reagencie a umístěte zásobník do barvicího automatu. Zkontrolujte nádoby na tekutiny a odpad. 3. Vložte sklíčka do barvicího automatu. Pro všechny přístroje 1. Spusťte barvicí cyklus. 2. Po dokončení cyklu vyjměte sklíčka z barvicího automatu. 3. Používají-li se detekční soupravy iview DAB a Alkaline Phosphatase Red Detection Kit, umýt jemným čisticím prostředkem nebo v alkoholu, aby se odstranil krycí roztok; dehydratovat, projasnit a pokrýt obvyklým způsobem permanentním fixačním médiem. 4. Použije-li se AEC chromogen, nedehydratovat a neprojasňovat. Pro AEC použít vodné fixační médium. Obarvená sklíčka by měla být hodnocena během 2 až 3 dnů od barvení a jsou stabilní po dobu nejméně 2 let, jsou-li správně skladována při pokojové teplotě (15 C 25 C). Postupy kontroly kvality Pozitivní tkáňová kontrola S každým provedeným barvicím postupem je třeba provést pozitivní kontrolu tkáně. Příkladem pozitivní kontroly pro protilátku CONFIRM anti-vimentin (V9) je tonzila. Komponenty tkání pro pozitivní kontrolu (cytoplazmatické barvení endoteliálních buněk a buněk lymfoidní řady) se používají k potvrzení, že protilátka byla aplikována a že přístroj pracuje správně. Tkáň může obsahovat pozitivně i negativně zabarvené buňky nebo části tkáně a může sloužit jako pozitivní i negativní tkáňová kontrola. Kontrolní vzorky musí být čerstvé vzorky z pitvy, biopsie nebo operace připravené nebo fixované co nejdříve a zalité stejným způsobem jako testované řezy. Takové tkáně mohou monitorovat všechny kroky postupu, od přípravy tkáně až po barvení. Použití tkáňového řezu fixovaného nebo zpracovaného jiným způsobem než testovaný vzorek zajistí kontrolu pro všechny reagencie a všechny kroky metody kromě fixace a zpracování tkáně. Tkáň se slabým pozitivním zbarvením je vhodnější pro optimální kontrolu kvality a pro rozpoznání nižší úrovně degradace reagencie. Známé pozitivní tkáňové kontroly se mají používat pouze ke sledování správné funkce zpracovaných tkání a testových reagencií, nikoli jako pomůcka při stanovování konkrétní diagnózy vzorků pacientů. Pokud se u pozitivních kontrolních tkání neprojeví pozitivní zabarvení, je nutno považovat výsledky testovacích vzorků za neplatné. Negativní tkáňová kontrola Jako negativní tkáňová kontrola může posloužit stejná tkáň, která byla použita pro pozitivní kontrolu. Rozmanitost různých typů buněk, které se nacházejí ve většině řezů tkání, nabízí oblasti pro interní negativní kontrolu, ale to by měl ověřit uživatel. Části, které se nebarví, by měly prokázat nepřítomnost specifického zabarvení a zajistit indikaci nespecifického zabarvení pozadí. Pokud se v částech tkáně pro negativní kontrolu projeví specifické zbarvení, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Nevysvětlitelné rozpory Nevysvětlitelné neshody v kontrolách by měly být ihned oznámeny místnímu zastoupení společnosti Ventana. Pokud se výsledky kontroly kvality neshodují se specifikacemi, výsledky pacienta jsou neplatné. Objeví-li se neshody, prostudujte kapitolu Řešení problémů této příbalové informace. Zjistěte problém a zjednejte nápravu. Potom analýzu vzorků pacienta zopakujte. Negativní reagenční kontrola Negative Reagent Control K usnadnění interpretace výsledků je třeba provést pro každý vzorek cyklus s negativní reagenční kontrolou negative reagent control. Negativní reagenční kontrola negative reagent control je použita místo primární protilátky, aby se dalo vyhodnotit nespecifické zabarvení. Sklíčko je třeba správným způsobem obarvit použitím CONFIRM Negative Control Mouse Ig nebo CONFIRM Negative Control Rabbit Ig. Je-li pro negativní kontrolu použita jiná reagencie, nařeďte ji ve stejném poměru jako antisérum primární protilátky ředicím roztokem Ventana Antibody Diluent. Jako alternativa výše uvedených negativních reagenčních kontrol negative reagent control může sloužit i samotné ředidlo. Inkubační doba negativní reagenční kontroly negative reagent control by měla odpovídat inkubační době primární protilátky. Pokud se panely řady protilátek používají se sériovými řezy, může negativní reagenční kontrola negative reagent control na jednom podložním sklíčku sloužit jako negativní kontrola nebo kontrola nespecifické vazby pozadí pro jiné protilátky. Ověření testu Před prvním použitím protilátky nebo barvicího systému v diagnostickém postupu by měla být ověřena specificita protilátky testováním na řadě dostupných tkání se známými imunohistochemickými charakteristikami účinnosti, které představují známé pozitivní a negativní tkáně (prostudujte si Postupy kontroly kvality popsané výše v této části příbalového letáku a požadavky pro kontrolu jakosti akreditačního programu College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist,7 nebo schválenou směrnici CLSI 8 nebo oba dokumenty). Tyto postupy kontroly kvality musejí být provedeny vždy, když se změní šarže protilátky nebo když se změní parametry testu. K ověření testu jsou vhodné tkáně uvedené v seznamu v kapitole Souhrn očekávaných výsledků. Interpretace výsledků Postup imunologického barvení na automatech Ventana způsobuje barevnou reakci produktu až vysrážení na místech antigenu lokalizovaných primární protilátkou. Předpokládané barevné reakce nalezete v příbalovém letáku k příslušné detekční soupravě. Před interpretací výsledků musí vyhodnotit pozitivní a negativní kontroly kvalifikovaný patolog se zkušeností s postupy v imunohistochemii. Pozitivní tkáňová kontrola Nejprve je nutné provést test zabarvené tkáně pro pozitivní kontrolu a ověřit tak správnost funkce všech reagencií. Známkou pozitivní reaktivity je přítomnost správně zbarveného reakčního produktu v cílových buňkách. Předpokládané barevné reakce nalezete v příbalové informaci k příslušné detekční soupravě. V závislosti na délce inkubace a síle použitého hematoxylinu je výsledkem kontrastního barvení světle až tmavě modré zbarvení buněčných jader. Nadměrné nebo neúplné kontrastní barvení může narušit správnou interpretaci výsledků. Pokud se u pozitivních kontrolních tkání neprojeví pozitivní zbarvení, je nutno považovat výsledky testovaných vzorků za neplatné. Negativní tkáňová kontrola Tkáň pro negativní kontrolu je nutno testovat po tkáni pro pozitivní kontrolu, aby byla ověřena specificita značení cílového antigenu primární protilátkou. Nepřítomnost specifického zbarvení v tkáni pro negativní kontrolu potvrzuje nepřítomnost zkřížené reaktivity s buňkami nebo částmi buněk. Pokud se projeví specifické zabarvení ve tkáni pro negativní kontrolu, je nutno považovat výsledky vzorků pacienta za neplatné. Pokud se vyskytuje nespecifické zabarvení, je většinou difúzní. V řezech z tkání nadměrně fixovaných formalínem se může také objevit sporadické slabé zbarvení pojivové tkáně. K interpretaci výsledků používejte pouze intaktní buňky, jelikož nekrotické nebo degenerované buňky mohou často barvit nespecificky. Tkáň pacienta Vzorky pacienta se vyšetřují jako poslední. Intenzitu pozitivního zbarvení je třeba hodnotit s ohledem na případné zbarvení pozadí negativní reagenční kontroly negative reagent control. Jako u každého imunohistochemického testu, negativní výsledek znamená, že antigen nebyl detekován, nikoli že daný antigen není v testovaných buňkách nebo tkáni přítomen. V případě potřeby použijte k identifikaci falešně negativních reakcí panel protilátek (viz. sekce Souhrn očekávaných výsledků). Ke správné interpretaci každého imunohistochemického výsledku by měla být testována rovněž morfologie každého vzorku tkáně s využitím řezů barvených hematoxylinem a eozinem. Pacientovy morfologické nálezy a příslušné klinické údaje musí interpretovat kvalifikovaný patolog. 2008-11-20 Strana 3 z 5 18062CS Rev C

OMEZENÍ Všeobecná omezení 1. Imunohistochemie (IHC) je diagnostický proces obsahující více kroků, který vyžaduje specializované vyškolení ve výběru vhodných reagencií a tkání, fixaci a zpracování, přípravě imunohistochemického podložního skla a interpretaci výsledků zabarvení. 2. Zbarvení tkáně závisí na způsobu zacházení s tkání a na jejím zpracování před barvením. Nesprávná fixace, zmrazení, rozmrazení, oplach, sušení, zahřívání, řezání nebo kontaminace jinými tkáněmi nebo tekutinami může vést ke vzniku artefaktů, záchytu protilátky nebo k falešně negativním výsledkům. Rozdíly v metodách fixace a zalévání nebo vnitřní nepravidelnosti tkáně mohou způsobit nekonzistentní výsledky. 3. Nadměrné nebo neúplné kontrastní barvení může narušit správnou interpretaci výsledků. 4. Klinická interpretace jakéhokoli pozitivního zabarvení nebo jeho nepřítomnosti musí být vyhodnocena v kontextu klinické historie, morfologie a jiných histopatologických kritérií. Klinická interpretace jakéhokoli barvení nebo jeho nepřítomnosti musí být doplněna morfologickými studiemi a řádnými kontrolami a také dalšími diagnostickými testy. Tato protilátka je určena pro užití v panelu protilátek. Je odpovědností kvalifikovaného patologa, aby se seznámil s protilátkami, reagenciemi a metodami používanými k barvení preparátů. Barvení se musí provádět v certifikované akreditované laboratoři pod dohledem patologa zodpovědného za hodnocení barvených podložních sklíček, který zajistí adekvátnost pozitivních a negativních kontrol. 5. Ventana dodává protilátky a reagencie pro použití optimálně naředěné, pokud jsou dodrženy pokyny, které jsou součástí produktu. Jakákoli odchylka od doporučených postupů testu může vést k tomu, že očekávané výsledky budou neplatné. Je nutno používat a dokumentovat příslušné kontroly. Uživatel, který se od doporučených postupů odchýlí, musí přijmout odpovědnost za interpretaci výsledků pacientů. 6. Tento výrobek není určen k použití v průtokové cytometrii, neboť charakteristiky účinnosti nebyly stanoveny. 7. U tkání, které nebyly předem testovány, mohou reagencie vykazovat neočekávané reakce. V důsledku biologické variability exprese antigenu v neoplazmě nebo jiných patologických tkáních nelze zcela vyloučit možnost neočekávaných reakcí i v testovaných skupinách tkání. 9 Se zdokumentovanými neočekávanými reakcemi se obraťte na místní zastoupení společnosti Ventana. 8. Tkáně osob infikovaných virem hepatitidy B, které obsahují povrchový antigen (HBsAg) hepatitidy B, mohou s křenovou peroxidázou vykazovat nespecifické zabarvení. 10 9. Normální séra ze stejného živočišného zdroje jako sekundární antiséra použitá v blokovacích krocích mohou v důsledku přítomnosti autoprotilátek nebo přirozených protilátek způsobovat falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky. 10. Falešně pozitivní výsledky se mohou vyskytovat v důsledku neimunologické vazby proteinů nebo produktů reakce se substrátem. Falešně pozitivní výsledky mohou být rovněž důsledkem aktivity pseudoperoxidázy (erytrocytů), aktivity endogenní peroxidázy (cytochromu C), alkalické fosfatázy alkaline phosphatase nebo endogenního biotinu (například z jater, mozku, prsu, ledvin) v závislosti na typu použitého imunologického barvení. 11 11. Jako u každého imunohistochemického testu znamená negativní výsledek pouze to, že antigen nebyl detekován, nikoli že antigen není v testovaných buňkách nebo tkáni přítomen. Specifická omezení 1. Protilátka byla optimalizována pro inkubační dobu v délce 16 minut (s tkání zhodnocenou antigenem) ve spojení s detekčními soupravami Ventana a barvicími automaty Ventana. V důsledku rozdílů ve fixaci a zpracování tkání může být u jednotlivých vzorků nutné prodloužit nebo zkrátit dobu inkubace primární protilátky. Další informace o proměnných faktorech fixace naleznete v dokumentu Immunohistochemistry Principles and Advances. 12 2. Protilátka ve spojení s detekčními soupravami a příslušenstvím Ventana zjišťuje antigen, který přežívá běžně provedenou fixaci ve formalínu, zpracování tkáně a její nařezání. Uživatelé, kteří nedodrží doporučené postupy, nesou odpovědnost za interpretaci výsledků pacienta. SOUHRN OČEKÁVANÝCH VÝSLEDKŮ 1. Specificita protilátky CONFIRM anti-vimentin (V9) byla stanovena pomocí studie, která prokázala správné barvení normálních a neoplastických tkání. U normální lidské tkáně byly zjištěny následující výsledky: tkáň adrenální, mozková (mozeček a mícha), tenkého střeva, ledvin, jater, plic, kosterního svalstva, myokardu, vaječníků, pankreatu, placenty, prostaty, kůže, žaludku, varlat, tonzil a dělohy byla u 1 z 1 případu testována jako pozitivní. Výsledky studie exprese u neoplázií jsou následující: u melanomu 5 z 5 případů testováno jako pozitivní; u medulárního karcinomu štítné žlázy, Schwannomu a lymfomu 3 ze 3 případů testovány jako pozitivní, u leiomyosarkomu a chondrosarkomu 1 z 1 případu testován jako pozitivní a adenokarcinom tlustého střeva u 0 ze 2 případů testován jako pozitivní. 2. Senzitivita závisí na zachování antigenu. Jakákoli nesprávná manipulace s tkání během fixace, řezání, zalévání nebo uchovávání, která mění antigennost, zeslabuje detekci protilátky CONFIRM anti-vimentin (V9) a může mít za následek falešně negativní výsledky. 3. Reprodukovatelnost barvení v rámci cyklu byla stanovena na základě barvení 5 sklíček obsahujících stejnou tkáň. Pět z 5 sklíček bylo zabarveno pozitivně. U všech sklíček byla intenzita barvení stejná. Uživatel musí ověřit reprodukovatelnost výsledků v rámci jednoho cyklu barvením různých setů sériových řezů snízkou, střední a vysokou hustotou antigenu v jednom cyklu. 4. Reprodukovatelnost barvení mezi cykly byla stanovena na základě barvení sklíček obsahujících stejnou tkáň ve 5 cyklech na různých přístrojích. Pět z 5 sklíček bylo zabarveno pozitivně. Všechna sklíčka se zabarvila v podobné intenzitě. Uživatelé by měli ověřit výsledky reprodukovatelnosti mezi cykly barvením několika souborů sériových řezů s nízkou, střední a vysokou hustotou antigenu v různých dnech. ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ 1. Jestliže pozitivní kontrola vykazuje slabší barvení, než se očekává, měly by být současně zkontrolovány i další cykly s pozitivní kontrolou, aby bylo možné stanovit, zda je uvedené způsobeno primární protilátkou nebo některým z běžných sekundárních antigenů. 2. Pokud je pozitivní kontrola negativní, je nutno ji zkontrolovat, aby bylo zajištěno, že má sklíčko správný štítek s čárovým kódem. Jestliže má sklíčko správný štítek, měly by být současně zkontrolovány i další cykly s pozitivní kontrolou, aby bylo možné stanovit, zda je uvedené způsobeno primární protilátkou nebo některým z běžných sekundárních antigenů. Odběr, fixace nebo odstraňování parafínů z tkání mohlo být provedeno nesprávným způsobem. Sběr tkáně, její fixace a skladování musí probíhat dle správného postupu. 3. Vyskytne-li se přílišné barvení pozadí, pravděpodobně je přítomna vysoká koncentrace endogenního biotinu. Je možné zahrnout krok blokování biotinu. 4. Jestliže se nepodařilo odstranit všechen parafín, je potřeba postup pro odstranění parafínu zopakovat. 5. Je-li barvení specifickou protilátkou příliš intenzivní, opakujte cyklus s primární protilátkou s kratší inkubační dobou vždy o 4 minuty až do doby dosažení požadované intenzity barvení. 6. Jestliže dochází ke smývání řezů tkání ze sklíčka, zkontrolujte, zda jsou podložní sklíčka nabita kladným nábojem. 7. Nápravná opatření viz kapitola Jednotlivé kroky postupu a Návod k obsluze barvicího automatu, nebo se obraťte na místní zastoupení společnosti Ventana. LITERATURA 1. Sheibani K, Battifora H. Signet-ring cell melanoma. A rare morphologic variant of malignant melanoma. Am J Surg Pathol 12(1): 28-34, 1988. 2. Azumi N, and Battifora H. The distribution of vimentin and keratin in epithelial and nonepithelial neoplasms. A comprehensive immunohistochemical study on formalinand alcohol-fixed tumors. Am J Clin Pathol 88(3): 286-296, 1987. 3. Benjamin E, Law S, Bobrow LG. Intermediate filaments cytokeratin and vimentin in ovarian sex cord-stromal tumors with correlative studies in adult and fetal ovaries. J Pathol 152(4): 253-263, 1987. 4. Miettinen M, Lehto VP, Virtanen I. Antibodies to intermediate filament proteins. The differential diagnosis of cutaneous tumors. Arch Dermatol 121(6): 736-741, 1985. 5. Osborn M, Debus E, Weber K. Monoclonal antibodies specific for vimentin. Eur J Cell Biol 34(1): 137-143, 1984. 6. Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology, 2nd Edition. The C.V. Mosby Company, St. Louis, 1980. 7. College of American Pathologists Laboratory Accreditation Program, Anatomic Pathology Checklist, 2001. 8. NCCLS. Quality Assurance for Immunocytochemistry: Approved Guideline. NCCLS document MM4-A- (ISBN 1-56238-396-5). NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, PA 19087-1898 USA, 1999. 9. Herman GE, Elfont EA. The taming of immunohistochemistry: the new era of quality control. Biotech Histochem 66(4): 194-199, 1991. 10. Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B surface antigen. A possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Pathol 73(5): 626-32, 1980. 11. Nadji M, Morales AR. Immunoperoxidase: part 1. The technique and its pitfalls. Lab Med 14: 767, 1983. 12. Roche PC, Hsi ED. Immunohistochemistry-Principles and Advances. Manual of Clinical Laboratory Immunology, 6 th edition. (NR Rose Ed.) ASM Press, 2002. 2008-11-20 Strana 4 z 5 18062CS Rev C

DUŠEVNÍ VLASTNICTVÍ CONFIRM TM, EZ Prep TM, iview TM a Liquid Coverslip TM jsou ochranné známky společnosti Ventana Medical Systems, Inc.; BenchMark, ES, NexES IHC a Ventana jsou registrované ochranné známky společnosti Ventana Medical Systems, Inc. Tissue-Tek je registrovaná ochranná známka společnosti Sakura Finetek. Společnost Ventana uděluje kupujícímu licenci pouze na jedno použití v rámci těchto patentů: Patent USA č. 6045 759, 6192 945 B1, 6416 713 B1 a zahraniční stejnopisy. KONTAKTNÍ INFORMACE Ventana Medical Systems, Inc. 1910 E. Innovation Park Drive Tucson, Arizona 85755 USA +1 520 887 2155 +1 800 227 2155 (USA) www.ventana.com Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Strasse 116 D-68305 Mannheim Germany 2008-11-20 Strana 5 z 5 18062CS Rev C