MASARYKOVA UNIVERZITA Lékařská fakulta STANOVENÍ KREVNÍ SKUPINY AB0 A ANTIGENU D POROVNÁNÍ AGLUTINAČNÍCH METOD Bakalářská práce obor Zdravotní laborant Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Dana Bukáčková Autor: Romana Rojková Brno, duben 2013
Poděkování: Na tomto místě bych ráda poděkovala MUDr. Daně Bukáčkové za vedení práce a čas, který mi při vedení mé bakalářské práce věnovala. Také děkuji MUDr. Jarmile Celerové za cenné rady a připomínky, všem zaměstnancům Krevní banky FNUSA za toleranci při praktickém zpracování mojí bakalářské práce a MUDr. Ivu Lázničkovi za umožnění vyšetření krevních skupin pomocí E.M. technologie.
Prohlašuji, že předložená bakalářská práce je mým původním autorským dílem, které jsem vypracovala samostatně. Veškerou literaturu a další zdroje, z nichž jsem při zpracování čerpala, v práci řádně cituji a uvádím v seznamu použitých zdrojů. Souhlasím s prezenčním zpřístupněním své práce v univerzitní knihovně. V Brně dne 20. dubna 2013 Romana Rojková....
Jméno a příjmení autora: Romana Rojková Název bakalářské práce: Stanovení krevní skupiny AB0 a antigenu D porovnání aglutinačních metod Pracoviště: Krevní banka Fakultní nemocnice u sv. Anny, Brno Vedoucí bakalářské práce: MUDr. Dana Bukáčková Rok obhajoby: 2013 Souhrn: Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D patří mezi základní vyšetření imunohematologických laboratoří. Pro svou jednoduchost a ekonomičnost jsou využívány aglutinační testy. Tyto testy lze provádět několika metodami. Cílem mé práce bylo vyšetřit krevní skupinu AB0 a antigen D pomocí aglutinace zkumavkovou metodou, aglutinací v mikrotitračních destičkách, sloupcovou aglutinací, E.M. technologií a jednotlivé metody mezi sebou porovnat. Klíčová slova: krevní skupina AB0, antigen D, aglutinace, metoda
Seznam symbolů a zkratek: AGH antiglobulinum humanum (antiglobulinové sérum) AIHA autoimunní hemolytická anémie ČLS JEP Česká lékařská společnost Jana Evangelisty Purkyně GPA glykoforin E.M. Erythrocytes Magnetizer ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay HON hemolytické onemocnění novorozence Ig imunoglobulin KB FNUSA Krevní banka Fakultní nemocnice u svaté Anny KS krevní skupina LISS roztok o nízké iontové síle (Low Ionic Salt Solution) NAT nepřímý antiglobulinový test PAT přímý antiglobulinový test PCR-SSP polymerázová řetězová reakce se sekvenčně specifickými primery PEG polyetylenglykol PP pracovní postup RhIg anti-d imunoglobulin
OBSAH OBSAH...6 ÚVOD...8 TEORETICKÁ ČÁST...9 1 Obecné imunohematologické pojmy...9 1.1 Antigeny...9 1.2 Protilátky...9 1.3 Komplement...11 2 Krevní skupiny...12 2.1 AB0 systém...13 2.1.1 AB0 antigeny...13 2.1.2 AB0 protilátky...15 2.1.3 Vylučovatelství...15 2.1.4 Získané změny AB0 systému...15 2.1.5 Význam AB0 systému pro transfuzi...16 2.2 Rh systém...17 2.2.1 Rh antigeny...17 2.2.2 Rh protilátky...18 2.2.3 Význam Rh systému pro transfuzi...18 2.3 Ostatní skupinové systémy...18 3 Imunohematologické testy...19 3.1 Aglutinační testy...19 3.1.1 Rozdělení aglutinačních testů podle reagencií použitých pro aglutinaci...21 3.1.2 Rozdělení aglutinačních testů podle techniky provedení...22 3.1.3 Hodnocení aglutinačních reakcí...25 3.2 Precipitační testy...25 3.3 Testy na průkaz hemolyzinů...26 3.4 Testy inhibice hemaglutinace...26 3.5 ELISA...26 3.6 Ostatní testy používané v imunohematologii...26 4 Stanovení krevní skupiny AB0 systému a antigenu D...27 4.1 Stanovení krevní skupiny AB0 systému...27 4.2 Stanovení antigenu D...27
4.3 Diskrepantní výsledky...28 PRAKTICKÁ ČÁST...30 5 Materiál a použitá metodika...30 5.1 Charakteristika souboru...30 5.2 Preanalytická část...30 5.3 Analytická část...31 5.3.1 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D zkumavkovou metodou...31 5.3.2 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D v mikrotitrační destičce...32 5.3.3 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D sloupcovou aglutinací...34 5.3.4 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D E.M. technologií...35 5.4 Postanalytická část...37 5.4.1 Interpretace výsledků...37 6 Výsledky...39 6.1 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D jednotlivými metodami...39 6.2 Srovnání časové náročnosti jednotlivých metod...40 6.3 Srovnání finančních nákladů jednotlivých metod...42 6.4 Srovnání z pohledu manuální náročnosti a komfortu práce laboranta...43 6.5 Charakteristika jednotlivých metod...44 ZÁVĚR...45 SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ...47 SEZNAM INTERNETOVÝCH ZDROJŮ...49 PŘÍLOHY...50
ÚVOD Předmětem a cílem této práce je srovnat vyšetření krevních skupin AB0 systému a antigenu D pomocí zkumavkové metody, aglutinací v mikrotitračních destičkách, metodou sloupcové aglutinace a E.M. technologií. Tyto jednotlivé metody mezi sebou porovnat a na základě výsledků určit vhodnost použití. Vyšetření AB0 skupiny a antigenu D patří mezi základní vyšetření imunohematologických laboratoří. Jsou vyšetřovány u pacientů, kde se předpokládá transfuzní substituce, těhotných žen, novorozenců, dárců krve, ale především tvoří nejdůležitější součást předtransfuzního vyšetření. Proto je nutné mu věnovat náležitou pozornost. Na začátku minulého století byly možnosti metod vyšetření krevních skupin omezené. Vyšetřovalo se pouze sérologickými metodami a provedení testů se uskutečňovalo pomocí zkumavek a sklíček. Původní zkumavkové a sklíčkové testy jsou v současnosti nahrazovány provedením v mikrotitračních destičkách a technikou sloupcové aglutinace. Mezi jejich hlavní přednosti patří možnost automatizace pomocí imunohematologických analyzátorů. S rozvojem znalostí na úrovni molekulárně genetické se do diagnostiky postupně začleňují i techniky DNA analýzy. Tato práce je členěna do několika oddílů. V první části jsou uvedené obecné imunohematologické pojmy. Druhá část je věnována krevním skupinám. Zde je popsán AB0 a Rh systém. V dalších částech jsou popsány imunohematologické testy a vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D. V praktické části se věnuji laboratornímu postupu vyšetření krevní skupiny v AB0 systému, antigenu D a srovnání jednotlivých metod. V závěru hodnotím jednotlivé výsledky a shrnuji vhodnost použití. - 8 -
TEORETICKÁ ČÁST 1 Obecné imunohematologické pojmy 1.1 Antigeny Antigen je cizorodá látka z vnějšího nebo vnitřního prostředí, kterou imunitní systém rozpozná a navodí imunitní reakci. Malá část molekuly antigenu, kterou imunitní receptory rozeznávají, se označuje epitop. Komplex antigenu s protilátkou, případně komplementový fragment, se nazývá imunokomplex. Jeho velikost a složení je různé, záleží na poměru množství protilátek a antigenu. (Hořejší, Bartůňková a kol., 2009) Všechny krevní skupinové substance jsou v přesném smyslu definice antigeny, které mohou stimulovat cizí imunitní systém, v závislosti na jeho stupni cizosti a antigenní síle, k tvorbě specifických protilátek. (Eckstein, 1994) Antigeny krevních skupin jsou součástí struktury krevní buňky, kde vykonávají různé funkce. Fungují jako transportní kanály, regulují komplementový systém, mají enzymatickou aktivitu, fungují jako receptory pro viry a bakterie. Některé antigeny jsou také nutné pro udržení morfologických vlastností erytrocytů. (Tesařová a kol., 2008) V imunohematologii jsou hlavní krevně skupinové antigeny nazývány aglutinogeny. Biochemicky se jedná o proteiny, glykoproteiny, či glykolipidy. Definování jednotlivých antigenů a klasifikace je neustálý proces, ve kterém se neustále pokračuje. (Řeháček, Masopust a kol., 2013; Tesařová a kol.,2012). V současné době rozeznáváme 329 antigenů, z nich 292 řazených do 33 systémů krevních skupin, dále do kolekcí a sérií antigenů s nízkou, resp. vysokou frekvencí výskytu. (Řeháček, Masopust a kol, 2013) 1.2 Protilátky Protilátky jsou glykoproteinové povahy, které se v organismu vytváří jako odpověď na setkání s antigenem. Jsou tvořeny plazmatickými buňkami, které vznikají kontaktem lymfocytů B s antigenem. Protilátky jsou specifické pro daný antigen, termín imunoglobulin značí širší pojem pro protilátku, bez ohledu na její specifičnost. (Hořejší, Bartůňková a kol., 2009) - 9 -
Tvorba protilátek krevních skupin může být stimulována antigenem krevně skupinového systému, který se v organismu vyskytl prostřednictvím transfuze nebo těhotenstvím. Klinicky významné protilátky mají schopnost způsobit potransfuzní reakce a také mohou být příčinou HON. (Penka, Tesařová a kol., 2012) Protilátky rozdělujeme podle několika kritérií: Podle antigenů které stimulují jejich tvorbu autoprotilátky namířené proti antigenům vlastního organismu, aloprotilátky namířené proti cizorodým antigenům. Podle příčiny vzniku přirozené vznikají po stimulaci antigeny z okolního prostředí, nikoliv imunizací erytrocytárními antigeny. Tyto antigeny jsou strukturně podobné antigenům krevních skupin. Řadíme sem např. anti-a, anti-b, imunní vznikají imunizací erytrocytárními antigeny během těhotenství nebo při transfuzi. Podle sérologických vlastností kompletní vyvolávají přímou aglutinaci v solném testu, většinou se jedná o protilátky třídy IgM, inkompletní k vyvolání aglutinace a jejich průkazu je potřeba určitých laboratorních úprav např. přidání antiglobulinového séra nebo enzymu do reakční směsi. Řadíme sem IgG protilátky. Podle specifity specifické namířené proti konkrétnímu antigenu, nespecifické reagují s různými antigeny. Podle optimální teploty při reakci tepelné optimální teplota 37 C, chladové optimální teploty od 20 C do 23 C nebo nižší. (Penka, Tesařová a kol., 2012) - 10 -
1.3 Komplement Aktivace komplementu se podílí na obraně organismu proti cizorodým částicím. Je tvořen soustavou asi 30 sérových a membránových proteinů. Hlavní složku komplementu tvoří 9 sérových proteinů, které označujeme C1 C9. Klíčovou složkou je C3, konečným produktem komplementové kaskády je komplex proteinů C5, C6, C7, C8, C9 označovaný jako MAC. Ten perforuje membrány a způsobuje lýzu buněk. Jednotlivé složky C1 C9 se nachází v séru v neaktivní formě a po různých podnětech se kaskádovitě aktivují. Produkt jednoho kroku štěpí neaktivní prekurzor dalšího faktoru. Aktivace probíhá klasickou, alternativní nebo lektinovou cestou. U klasické cesty dochází k aktivaci navázáním protilátek na antigenní povrch, alternativní cesta je aktivována mikrobiálními povrchy. Lektinová cesta je zahájena sérovým lektinem (MBL lektin vázající manózu). Důležité jsou regulační proteiny, které zabraňují samovolnému rozvoji kaskády. (Hořejší, Bartůňková 2009) Komplement mohou aktivovat AB0 protilátky nebo nepravidelné antierytrocytární protilátky, které se vytvořily imunizací během transfuze či těhotenství. Tyto protilátky mohou způsobit hemolýzu erytrocytů. Je-li aktivace silná, většinou AB0 inkompatibilita, dochází k vytvoření MAC komplexu, který perforuje buněčnou membránu a způsobí hemolýzu erytrocytů. Jedná-li se o slabší aktivaci, non-ab0 inkompatibilita a AIHA, proběhne aktivace komplementu, ale dochází k zastavení ve fázi aktivace složek C3. Fáze lytická neproběhne. (Řeháček, Masopust a kol, 2013) - 11 -
2 Krevní skupiny Slovní spojení krevní skupina je užíváno v různých kontextech. Používá se jako vlastnost v systému AB0 a přítomnost či nepřítomnost antigenu D nebo v obecném smyslu jako označení některého z široké palety všech antigenů. (Písačka, 2009) K objevu krevních skupin došlo počátkem 20. století a téměř 20 let trvalo, než byly všeobecně známé. Jako první byly objevené krevní skupiny AB0 systému, které se dlouho pokládaly za jediné. K jejich objevu dospěl v roce 1901 vídeňský vědec Karl Landsteiner. Při zkoumání aglutinace lidských krvinek menší skupinky osob, rozdělil krev do tří skupin A, B, C. Čtvrtou skupinu neobjevil proto, že v malé skupince osob se nevyskytovala. Za svůj objev dostal v roce 1930 Nobelovu cenu. V roce 1902 zjistili A. Decastello a A. Sturli případ, který neodpovídal žádné ze tří Landsteinerových skupin. První, kdo správně roztřídil krev do 4 skupin, byl český lékař Jan Janský. Krevní skupiny pojmenoval číslicemi I, II, III, IV. V letech 1910 1911 se podíleli Ludvik Hirszfeld a E. von Dungern na pojmenování krevních skupin A, B, 0, AB. Hirszfeld také prokázal, že pro krevní skupiny platí Mendelův zákon o dědičnosti. Poznatky o krevních skupinách byly poprvé využity při transfuzi v roce 1911 R. Ottenbergerem. Téměř po 25 letech dalšího pátraní se podařilo v rámci imunizace králíků lidskými erytrocyty Landsteinerovi objevit další 3 antigenní vlastnosti erytrocytů M, N a P. Tyto úspěchy vedly k dalším pokusům, díky nimž Landsteiner ve spolupráci s A. S. Wienerem objevili systém Rh. První údaje související s Rh systémem se objevily kolem roku 1940. Byl to případ potransfuzní reakce u rodičky, která dostala transfuzi od manžela a předtím porodila mrtvý plod. V séru rodičky byla zjištěna protilátka, která reagovala s krvinkami přibližně 85% AB0 kompatibilních jedinců. Bylo potvrzeno, že úmrtí plodu i potransfuzní reakce souvisí s nalezenou protilátkou, reagující s dosud neznámým krvinkovým antigenem. Systém nazvali podle opice Macacus rhesus, jejíž krvinky použili v pokusech. Objev skupinového systému Rh objasnilo dříve záhadné reakce po transfuzi a také příčinu hemolytického onemocnění novorozence. V dalších letech pak dochází k objevování dalších systémů jako Kell, Duffy, Kidd, Lutheran a jiné. (Nečas, 2009; Hrubiško, 1974) - 12 -
2.1 AB0 systém AB0 systém a k němu patřící krevní skupiny jsou ze všech skupinových systémů erytrocytů nejstarší. Systém určují 3 základní alely kodominantní A a B a recesivní 0, které se navzájem homozygotně a heterozygotně kombinují. Podle vzájemné kombinace dávají vznik čtyřem základním fenotypům: A, B, 0, AB. Fenotyp A je tvořený genotypem AA, A0, fenotyp B je tvořený genotypem BB, B0. Alela 0 je vůči alelám A a B recesivní a fenotypově se projevuje jen v homozygotní kombinaci. Fenotyp AB tvoří genotyp AB. Označení jednotlivých krevních skupin určuje přítomnost antigenů (aglutinogenů) A nebo B na povrchu membrány erytrocytů a dvou přirozeně se vyskytujících protilátek (aglutininů) anti-a a anti-b v séru. V krevním séru se nachází pravidelná protilátka proti antigenu, který není přítomen na vlastních erytrocytech. (Tesařová a kol., 2008) Zastoupení antigenů a protilátek AB0 systému shrnuje tabulka. 1. Krevní skupina AB0 antigeny AB0 protilátky A A anti-b B B anti-a 0 H anti-a, anti-b AB A, B žádné Tab. 1: Krevní skupiny AB0 antigeny, AB0 protilátky ( upraveno podle Penka, Tesařová a kol, 2012) 2.1.1 AB0 antigeny AB0 antigeny jsou oligosacharidy složené z řetězců jednoduchých cukrů: D-glukózy, D-galaktózy, D-manózy, N-acetyl-D-glukosaminu, N-acetyl-D-galaktosaminu a L-fukózy. Jsou součástí glykoproteinů a glykolipidů v membráně erytrocytů a jejich rozpustná forma je také obsažena v sekretech. (Penka, Tesařová a kol., 2012) Antigeny A, B, H, nejsou přímým produktem genu. Na jejich vzniku se podílí genově specifický enzym glykosyltransferáza, která připojuje specifické monosacharidy ke galaktóze prekurzorové substance, k tzv. H antigenu. Gen H umožňuje vznik H-transferázy, která katalyzuje připojení fukózy ke galaktóze v oligosacharidovém řetězci a vytváří prekurzorový H antigen. Ten tvoří receptor pro specifické monosacharidy krevní skupiny A a B. U krevní skupiny 0 zůstává nepokrytý. - 13 -
Gen A kóduje vznik A-transferázy, která specificky připojuje N-acetyl-galaktosamin k H antigenu a vzniká sacharid typický pro A antigen. Gen B syntetizuje B-transferázu, která specificky připojuje D-galaktózu k H antigenu a vzniká typický sacharid pro B antigen. Gen 0 je amorfní, tichá alela, která nemá žádnou transferázovou aktivitu, nedochází tedy k připojení monosacharidu k prekurzorové substanci. Pokud u osob chybí gen H, nesyntetizuje se H-transferáza a nevytváří se prekurzorový H antigen, tudíž se nemohou připojit imunodominatní cukry. Tyto osoby nemají na membráně erytrocytu antigeny H, A, ani B Tento fenotyp se označuje jako Bombay. (Penka, Tesařová a kol., 2012; Písačka, 2012) Většina ABH antigenů je syntetizována v hematopoetické tkáni, přibližně 1% antigenů je na erytrocyty navázané z plazmy. Na erytrocytech plodu je lze detekovat již od 5. týdne. (Tesařová a kol., 2008) Obr. 1: Chemické složení AB0 antigenů (upraveno podle Penka, Tesařová a kol., Hematologie a transfuzní lékařství II). - 14 -
2.1.2 AB0 protilátky Systém AB0 se od ostatních systémů krevních skupin odlišuje výskytem přirozených protilátek. Tyto přirozené protilátky označujeme jako aglutininy anti-a, anti-b. Vytváří se během prvních let života jako odpověď na substance, které jsou podobné antigenům A a B. Tyto substance jedinec přijímá z okolního prostředí. Každý jedinec si tedy vytvoří protilátku proti tomu antigenu, který nemá na vlastních erytrocytech. U novorozenců se tyto protilátky nevyskytují, ale vytváří se až během prvních měsíců života. (Řeháček, Masopust a kol., 2013) Protilátky v AB0 systému jsou převážně třídy IgM (u jedinců bez imunizace), ale mohou se vyskytovat i jako IgG nebo IgA (především u osob imunizovaných těhotenstvím nebo převodem inkompatibilní krve). IgM protilátky jsou schopny aktivace komplementu a mohou vést k hemolýze. Uplatňují se v etiologii potransfuzních reakcí, hemolytického onemocnění novorozence a u pacientů po transplantaci orgánů. (Penka, Tesařová a kol., 2012) 2.1.3 Vylučovatelství Antigeny A, B, H se mohou kromě erytrocytů vyskytovat také v sekretech a jiných tělních tekutinách. Přibližně 80% osob tvoří H, H a A nebo H a B antigeny, které se vyskytují v sekretech. Sekrece je řízená sekretorským genem Se a se. Vylučování rozpustných substancí nastává pouze, pokud jeden lokus nese gen Se. Pokud je gen se v homozygotní kombinaci, jedná se o nevylučovatelství. Osoby vylučující antigeny A, B, H se nazývají sekretoři, osoby které nevylučují antigen H ani svůj skupinový antigen se nazývají non-sekretoři. (Sakalová a kol., 1995) 2.1.4 Získané změny AB0 systému K získaným změnám krevní skupiny dochází při transplantaci kostní dřeně, u které nebyla zachována stejná skupina. Po úspěšném přihojení je změna trvalá. Také po masivních nestejnoskupinových transfuzích dochází dočasně ke změně krevní skupiny. K zeslabení A, B, H antigenu může dojít u některých hematoonkologických onemocnění. Získaný antigen B se může objevit u pacientů krevní skupiny A s infekcemi, které provází onemocnění střev. Tuto změnu způsobují bakteriální enzymy, které mění N-acetyl-D-galatosamin na galaktosamin, který se částečně shoduje s B specifickou galaktózou. Tyto krvinky poté reagují s některými anti-b protilátkami a vyšetření antigenů odpovídá krevní skupině AB. Získaný - 15 -
antigen A je možné detekovat u proteových infekcí. (Řeháček, Masopust a kol., 2013, Tesařová a kol., 2008) 2.1.5 Význam AB0 systému pro transfuzi Vzhledem k tomu, že se v AB0 systému vyskytují pravidelné protilátky, patří tento systém pro klinickou transfuzní praxi mezi nejdůležitější. Tvoří součást předtransfuzního vyšetření a je nutné dodržet AB0 kompatibilitu. Převodem inkompatibilních erytrocytů dochází k navázání protilátek, aktivaci komplementu a hemolýze. AB0 inkompatibilita má za následek těžké život ohrožující potransfuzní reakce. Dodržují se transfuze stejnoskupinových erytrocytů, neboť nerespektování této skutečnosti může vést k akutní hemolytické potransfuzní reakci. Přesto můžou nastat situace, kdy dochází k nedostatku stejnoskupinových erytrocytů a v těchto případech je nutné dodržet určitá pravidla. Jedinci s krevní skupinou 0 jsou označováni jako univerzální dárci a jejich erytrocyty mohou být použity v případě, že stejnoskupinové erytrocyty nejsou dostupné nebo není známa krevní skupina příjemce. Naopak jedinci s krevní skupinou AB jsou označováni jako univerzální příjemci erytrocytů (tab. 2). Při transfuzi plazmy platí pravidla opačná. Jedinci s krevní skupinou AB jsou označováni jako univerzální dárci plazmy, univerzálními příjemci plazmy jsou jedinci s krevní skupinou 0 (tab. 3). (Eckstein, 1994) AB0 kompatibilita Příjemce Lze podat transfuzní přípravek 0 0 A A, 0 B B, 0 AB AB, A, B, 0 Tab. 2: Erytrocyty AB0 kompatibilita (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_08) AB0 kompatibilita Příjemce Lze podat transfuzní přípravek 0 0, A, B, AB A A, AB B B, AB AB AB Tab. 3: Plazma AB0 kompatibilita (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_08) - 16 -
2.2 Rh systém Rh systém patří mezi vysoce polymorfní a imunogenní systém krevních skupin. Dosud bylo rozpoznáno 53 antigenů, k nejznámějším patří antigeny D, C, E, c, e. (Řeháček, Masopust a kol, 2013) 2.2.1 Rh antigeny Rh antigeny jsou kódované dvěma geny: genem RHD pro expresi antigenu D a genem RHCE pro antigeny C, c, E, e. (Tesařová a kol., 2008) Mezi hlavní antigeny Rh systému patří antigen D, který se vyznačuje velmi silnou imunogenicitou. Osoby, u kterých se vyskytuje antigen D, se označují jako RhD pozitivní, osoby kde tento antigen chybí, označujeme jako RhD negativní. D antigen představuje soubor epitopů na extramembranozní části RhD proteinu (epitop=seskupení imunologicky funkčních aminokyselin). (Tesařová a kol., 2008) Monoklonálními protilátkami je v současnosti rozpoznáno více než 30 různých D epitopů. Atypické formy antigenu D lze rozdělit na variantní/eventuálně parciální D antigeny a slabé D antigeny. Variantní D antigeny představují kvalitativní změnu antigenu, kdy dochází ke ztrátě jednoho či více D epitopů. Způsobené jsou bodovými mutacemi nebo hybridní formou proteinu. Je zde riziko vzniku anti-d u některých variant. Slabé antigeny, dříve označované D u, mají kvantitativní změnu antigenu. Jedná se o kompletní antigen, který má redukovaný počet antigenních míst. Nehrozí zde riziko vzniku anti-d a osoby považujeme za RhD pozitivní. DEL fenotyp je extremně slabá exprese antigenu D, vyskytující se hlavně ve východní Asii. Tento antigen lze prokázat pouze elučními testy. (Řeháček, Masopust a kol., 2013; Penka, Tesařová a kol., 2012) Antigeny C, c, E, e tvoří alelické páry genů, nejsou tak významné jako antigen D, přesto můžou v případě inkompatibility vyvolat tvorbu protilátek. Rh systém obsahuje kromě výše uvedených dalších 6 antigenů, které se vyskytují ve frekvenci 1 99 %, čtyři složené antigeny, 26 antigenů o nízké frekvenci výskytu (LFA low frequency antigen) a 12 antigenů o vysoké frekvenci výskytu (HFA hight frequency antigen). (Řeháček, Masopust a kol., 2013) - 17 -
2.2.2 Rh protilátky Protilátky Rh systému jsou ve svém klinickém významu hned na druhém místě po AB0 protilátkách. Vznikají převážně po imunizaci transfuzí nebo těhotenstvím a mají potenciál způsobovat hemolytické potransfuzní reakce a hemolytické onemocnění novorozence. Nejčastěji nalézáme anti-d, anti-c, dále anti-e a anti-c. Některé typy Rh protilátek se mohou také vyskytovat jako tepelné autoprotilátky u autoimunitní hemolytické anémie. (Penka, Tesařová a kol., 2012) 2.2.3 Význam Rh systému pro transfuzi Vzhledem k tomu, že antigen D patří mezi silné imunogeny, je nutné provádět transfuze z hlediska D antigenu kompatibilně. U více jak 80 % osob, které se setkaly s antigenem D, dochází k tvorbě protilátek. Z tohoto důvodu je nutné dodržet kompatibilitu především u dívek a žen ve fertilním věku. Výjimky jsou přípustné pouze v ohrožení života a nedostatku D negativních erytrocytů. V tomto případě, kdy se D negativním jedincům transfundovaly D pozitivní erytrocyty, je nutné profylakticky aplikovat anti-d hyperimunní globulin k potlačení imunitní odpovědi. Profylaktická aplikace RhIg je nutná také u D negativních žen po porodu D pozitivního dítěte. (Eckstein, 1994) 2.3 Ostatní skupinové systémy Mimo výše uvedených antigenních systémů AB0 a Rh se vyskytuje celá řada dalších antigenních systémů, či krevních skupin, které se vyskytují na erytrocytech. Běžně se nevyšetřují. V klinické transfuzní praxi mají význam jen pokud jsou přítomny protilátky, které si pak vyžadují stejnoskupinovou transfuzi. Mezi tyto systémy patří Kell, Duffy, Lutheran, MNSs, P, Kidd atd. - 18 -
3 Imunohematologické testy 3.1 Aglutinační testy Makroskopické aglutinační testy jsou pro svou jednoduchost a ekonomičnost základem imunohematologie erytrocytů. Využívají se ke stanovení krevních skupin, průkazu protilátek a u testů kompatibility. Princip aglutinace spočívá v reakci protilátky s antigenem korpuskulární povahy, která vede ke vzniku aglutinátu. Rozlišujeme 2 fáze aglutinační reakce: 1. Primární fáze v této fázi dochází k vazbě protilátky na receptory antigenu, tzv. senzibilizaci erytrocytu, tato fáze je reverzibilní, ovlivňuje ji řada faktorů: poměr množství antigenu a protilátky nadbytek protilátky může vést k slabým či falešně negativním reakcím. Protilátka obsadí všechny epitopy na jedné krvince a nezbývá antigen, který by využila protilátka k překlenutí vzdálenosti mezi erytrocyty. Tento jev se nazývá prozóna, naředěním vyšetřovaného materiálu lze tomuto jevu předejít, teplota optimální teplota pod 20 C, při které reaguje protilátka s antigenem, je charakteristická pro chladové protilátky, tyto protilátky bývají především třídy IgM. Při teplotách 37 C optimálně reagují především IgG protilátky s klinicky významným potenciálem a označujeme je jako tepelné protilátky. Nastavení teplot využíváme v diagnostice pro dosažení nejvhodnějších vazeb nebo naopak s cílem disociace vazeb, které se využívá u elučních testů, ph optimální teplota většiny protilátkových testů je 7. Snížení ph může vést k disociaci protilátky z komplexu s antigenem a tím k falešně negativní reakci, doba inkubace ovlivňuje ji třída imunoglobulinu a jeho schopnost vazby ke specifickému antigenu, iontové vazby snížením iontové síly reakčního prostředí dochází ke zlepšení vazby protilátky. Je-li použit roztok o nižší iontové síle (LISS), dochází rychleji k vytvoření potřebných vazeb mezi protilátkou a antigenem. 2. Sekundární fáze v této fázi vzniká propojení senzibilizovaných erytrocytů pomocí protilátkové vazby, tato fáze probíhá pomaleji a aglutinace je viditelná. Při neutrálním ph erytrocyty obklopuje negativní iontový mrak a díky němu se navzájem odpuzují (zeta potenciál). Aby došlo k aglutinaci, musí protilátka tento zeta potenciál překonat. Díky své velikosti je protilátková molekula IgM schopná překonat tento potenciál a aglutinovat - 19 -
erytrocyty. IgG molekula je malá k přemostění vzdálenosti mezi jednotlivými erytrocyty. K viditelné aglutinaci jí napomáhá: centrifugace umožní vzájemné přiblížení erytrocytů, proteolytické enzymy pomáhají zrušit negativní náboj erytrocytů, AGH sérum zajistí vzájemné spojení senzibilizovaných erytrocytů, vliv koloidních látek (bovinní albumin) ovlivňuje elektrostatický náboj erytrocytu, LISS zvyšuje citlivost testů a současně snižuje iontovou sílu prostředí, PEG usnadňuje vazbu protilátek, vliv polymerů (dextran, albumin, želatina) ovlivňuje změnu zeta potenciálu, chemická modifikace IgG molekuly, pozitivně nabité molekuly neutralizují negativní náboj na erytrocytech. (Tesařová a kol, 2008). Obr. 2 : Sérologický účinek IgM a IgG protilátek (Dostupné z: http://www.med4you.at/laborbefunde/techniken/transfusionsmedizin/lbef_transfusionsmedizin.htm#a gglutinationstest) - 20 -
3.1.1 Rozdělení aglutinačních testů podle reagencií použitých pro aglutinaci Testy v solném prostředí Tyto testy se řadí mezi jednoduché a finančně nenáročné. Používají se k průkazu protilátek IgM třídy a k vyšetření erytrocytárních antigenů pomocí diagnostik obsahující protilátky IgM třídy. Test se provádí se suspenzí krvinek, které byly připraveny ve fyziologickém roztoku. Testy v LISS (Low Ionic Salt Solution) LISS testy pomáhají zvýšit citlivost protilátek, které se nacházejí v nízkém titru. LISS roztok snižuje iontovou sílu prostředí a tím zvyšuje počet spojení protilátek. Také doba inkubace je u těchto testů zkrácena. K testu se používají erytrocyty resuspendované v roztoku LISS. Testy antiglobulinové (AGH testy, Coombsovy testy) Patří mezi základní testy v detekci IgG protilátek. Jejich použití zavedl v roce 1954 Coombs a proto jsou označovány také jako Coombsovy testy. K detekci protilátek je nutné přidat sekundární protilátku (sérum proti lidskému imunoglobulinu tzv. AGH). Sekundární protilátka proti původní senzibilizující protilátce zajistí vzájemné spojení senzibilizovaných erytrocytů a aglutinační reakce je viditelná. Testy rozlišujeme ve dvou provedeních jako přímý a nepřímý antiglobulinový test. Přímý antiglobulinový test (PAT) detekuje IgG protilátky nebo složky komplementu navázané na erytrocyty in vivo, přítomnost navázaných protilátek se projeví vznikem aglutinátu. Používá se k průkazu imunitního typu hemolýzy. Nepřímý antiglobulinový test (NAT) slouží k průkazu protilátek nebo C3 složky komplementu, které se nachází volně v séru. Tímto testem se provádí screening a identifikace protilátek, slouží k určení kompatibility erytrocytů při předtransfuzním vyšetření a je možné ho použít i pro detekci antigenů. Testy enzymové Nepatří mezi rutinní a povinné vyšetření. Jsou však vhodné u pacientů kde je anamnéza potransfuzních reakcí a při vyšetřování potransfuzní reakce. Používají se také jako doplňkové vyšetření u pacientů s dlouhodobou transfuzní substituční léčbou a těžším klinickým stavem. Dále lze dočasně použít jako doplňkové vyšetření v laboratořích, které nedosahují opakovaně správných výsledků ve vnitřní a vnější kontrole kvality. (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07) - 21 -
Používají se proteolytické enzymy (ficin, bromelin, papain), které zvyšují schopnost protilátek aglutinovat erytrocyty např. snižují zeta potenciál erytrocytů, redukují množství kyseliny sialové na povrchu membrány erytrocytu, čímž umožní přiblížení erytrocytů. Tímto testem mohou být zvýrazněny aglutinační reakce např. Rh antigenů, naopak antigeny některých systémů mohou být destruovány např. MNS, Fy. (Řeháček, Masopust a kol., 2013) Jeho provedení může být jednofázové (erytrocyty + enzym + sérum/ plazma) nebo dvoufázové, které se vyznačuje vyšší citlivostí ( enzymaticky upravené erytrocyty + sérum/ plazma). (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07 ze dne 1. 3. 2011) 3.1.2 Rozdělení aglutinačních testů podle techniky provedení Testy sklíčkové Sklíčkové testy jsou prováděny na rovné ploše kachle nebo skla. Na plochu se nanesou diagnostická séra a suspenze erytrocytů, které se spolu na ploše promíchají. Za občasného kývavého pohybu se sleduje, zda se objeví aglutinace. V současné době slouží tyto testy pouze pro orientační vyšetření, zejména k potvrzení již známých skupin. Testy zkumavkové Zkumavkové testy jsou založeny na mísení reagencií s vyšetřovaným materiálem ve zkumavce a následné centrifugaci. Oproti dříve prováděným testům byly provedeny malé obměny: je zvýšen poměr protilátka antigen tím, že vyšetřované krvinky používáme v 3 5% suspenzi pufrovaného fyziologického roztoku, který zvýší citlivost, naklonění zkumavky a následné odečtení reakce antigenu s protilátkou je nahrazeno centrifugací a následnou opatrnou resuspenzací. Centrifugací je docíleno zvýraznění slabých reakcí. Aglutinace v mikrotitračních destičkách Modifikací zkumavkových testů jsou aglutinace v mikrotitračních destičkách, kde jsou zkumavky nahrazeny jamkami ve tvaru U. Používají se mikrotitrační destičky s 96 jamkami, které mohou obsahovat již předkapané diagnostické séra nebo jsou potažené membránami erytrocytů. - 22 -
Technika sloupcové aglutinace Technika sloupcové aglutinace byla vyvinuta v 80 letech minulého století a do oběhu se dostala v roce 1988. Tento systém kombinuje princip aglutinace a chromatografie. Aglutinace probíhá v mikrozkumavkách, které jsou vylisovány v plastové kartě, díky níž je snadná manipulace. Mikrozkumavku tvoří reagenční komůrka a gelový sloupec, kterým během centrifugace prochází materiál a působí jako filtr. Gelovým sloupcem migrují až na dno jednotlivé neaglutinované erytrocyty, shluky dvou a více krvinek jsou zadržovány v gelovém sloupci, velké shluky zůstávají v horní části sloupce. Pozitivní reakce tvoří tedy červenou linku na gelové suspenzi event. viditelné rozptýlení erytrocytů v gelovém médiu. Negativní reakce jsou tvořeny terčíkem sedimentovaných erytrocytů u dna komůrky. Předností této metody je snadná a jednoznačná interpretace výsledků. Obr. 3: Mikrozkumavka gelové karty (upraveno podle Řeháček, Masopust a kol., 2013 Transfuzní lékařství) E.M. technologie (Erythrocytes Magnetizer) Tato technologie tvoří novinku mezi aglutinačními technikami a není proto v imunohematologických laboratořích příliš rozšířená. Je založena na magnetizaci erytrocytů, která je využívána v kombinaci s magnetickým polem. Magnetizaci erytrocytů docílíme přidáním magnetizujícího roztoku Magnelys a následnému vystavení působení magnetickému poli. Roztok Magnelys zajistí, aby se magnetické částice pevně navázaly na povrch - 23 -
erytrocytu. Navázání probíhá vazbou kovové částice s anti-gpa na transmembránový protein erytrocytu. Testy se provádí v mikrotitračních destičkách pomocí analyzátoru QWALYS nebo ve spojení s pracovním místem FREELYS. Jedná se o tzv. mini laboratoř, která spojuje třepačku, inkubátor a magnetickou desku. Funkce jako míchání a inkubace mikrotitrační destičky je naprogramována jednotlivými programy pomocí integrovaného časovače. Díky E.M. technologii je centrifugace mikrotitračních destiček zcela eliminována. Obr. 4.: Vazba kovové částice na erytrocyt (Dostupné z: http://www.diagast.com/index.php?option=com_content&view=article&id=235&itemid=192&lang=e n) Obr. 5: Princip testu E.M. technologie (Dostupné z: http://www.diagast.com/index.php?option=com_docman&task=cat_view&gid=104&itemid=209&lan g=en) - 24 -
Aglutinace na principu laterální difůze Tato bezpřístrojová metoda se vyznačuje vysokou citlivostí. Stěny kanálků, které jsou součástí plastové karty, obsahují imobilizované specifické protilátky. Protékající suspenze erytrocytů adheruje ke stěně kanálku v místě setkání s protilátkou. Vzniklý imunokomplex se projeví červeným proužkem. Tento systém umožňuje detekovat antigeny erytrocytů bez laboratorních přístrojů a bez použití elektřiny. (Řeháček, Masopust a kol., 2013) 3.1.3 Hodnocení aglutinačních reakcí Výsledky aglutinací v imunohematologických testech jsou velmi důležité, proto musí být správně zhodnocené a řádně zdokumentované. Hodnocení lze vyjádřit kvalitativně (pozitivní/negativní), semikvantitativně (počtem křížků) a kvantitativně (titrem protilátek). Síla aglutinace vypovídá o množství přítomného antigenu či protilátky. Výsledný aglutinát provedený zkumavkovým testem je dobře pozorovatelný pouhým okem a je dostatečně pevný při standardním způsobu poklepu na dno zkumavky. Nadměrné třepání aglutinátů může vést k falešně negativnímu hodnocení, naopak nedostatečné resuspendování vede ke smíšeným reakcím. Hodnocení aglutinátů v testech sloupcové aglutinace má standardizovaný způsob hodnocení. Hodnotí se od nejsilnější reakce 4+, přes reakce typu dvojí populace až k negativní reakci. Mixed Field (MF) jsou hodnoceny reakce, kde se aglutinace nachází v prostředí neaglutinovaných erytrocytů. Hemolýzu hodnotíme jako pozitivní reakci. (Tesařová a kol., 2008) 3.2 Precipitační testy Podobný princip jako u aglutinace se uplatňuje při precipitaci. Liší se pouze v charakteru antigenu, který je solubilní povahy. Rozpustný antigen se váže na solubilní protilátku a výsledkem je vznik precipitátu nebo-li zákalu. Precipitaci lze provádět v tekutém nebo polotekutém (gelovém) prostředí. Ve zkumavkách tvoří viditelný sediment na agarovém gelu precipitační linie. Stejně jako u aglutinace vzniká precipitát pouze při optimálním poměru antigenu a protilátky. (Litzman a kol., 2009) - 25 -
3.3 Testy na průkaz hemolyzinů Tyto testy se řadí mezi jednoduché sérologické reakce. Vazba protilátky na povrch erytrocytu způsobí aktivaci komplementu a následnou lýzu erytrocytu. Hemolýza značí pozitivní výsledek testu, protože prokazuje přítomnost protilátek aktivující komplement. Důležitá je reakční teplota. Při jejím poklesu se hemolýza zpomaluje, až nakonec ustane. Vyšší teploty nad 37 C naopak hemolýzu urychlují, při teplotě 56 C dochází k inaktivaci komplementu. (Smetana a kol., 1992) 3.4 Testy inhibice hemaglutinace V těchto testech prokazujeme antigen nebo protilátku inhibicí dříve zjištěné aglutinace. Provádí se např. se solubilními antigeny ve slinách, na které se naváží odpovídající protilátky a po přidání vhodných erytrocytů nedochází k aglutinaci. (Tesařová a kol., 2008) 3.5 ELISA Používá se jak k detekci antigenu, tak i protilátky. Ke zjištění reakce se používají enzymy křenová peroxidáza nebo alkalická fosfatáza, které jsou připojeny na protilátky bez zničení její aktivity či protilátkové specifiky. Po reakci se značenou protilátkou se přidá vhodný substrát, který je enzymem rozložen na barevný produkt. Pomocí spektrofotometru je barevný produkt detekován. (Smetana a kol., 1992) 3.6 Ostatní testy používané v imunohematologii V imunohematologii lze použít i metody průtokové cytometrie či radioimunoanalýzu, avšak díky náročnému provedení a vysokým finančním nákladům se běžně nepoužívají. Postupně se k imunohematologickým metodám začínají zařazovat i molekulárně - biologické metody, především genotypovací PCR-SSP a multiparametrové genotypování pomocí BloodChip. (Tesařová a kol., 2008, Písačka, 2009) - 26 -
4 Stanovení krevní skupiny AB0 systému a antigenu D Vyšetřování krevních skupin patří mezi poměrně jednoduchý laboratorní výkon, musí se mu avšak věnovat náležitá pozornost, neboť chybné vyšetření může vést až k fatálním následkům. Její stanovení tvoří nejdůležitější součást předtransfuzního testu, dále se vyšetřuje u dárců, těhotných žen a novorozenců, vyžaduje-li to situace. 4.1 Stanovení krevní skupiny AB0 systému Sérologické určení AB0 skupiny je založeno na detekci A a B antigenů na erytrocytech pomocí diagnostických sér a potvrzení detekcí očekávaných aglutininů pomocí známých erytrocytů. Stanovení antigenu A a B na erytrocytech se provádí minimálně pomocí monoklonálního diagnostického séra anti-a a anti-b. Diagnostické sérum anti-b by nemělo detekovat získaný antigen B. Současně se provádí vyšetření pravidelných protilátek v séru nebo plazmě pomocí diagnostických erytrocytů A 1, A 2, B, 0 minimálně však pomocí A 1 a B. Vzájemné vyšetření antigenů a protilátek musí souhlasit, objeví-li se diskrepance, musí být (pokud možno) objasněna před vydáním výsledku. Pokud je to možné, vyžádá se nový vzorek. Při neodkladných transfuzích se podají univerzální erytrocyty, pokud se jedná o nesrovnalosti u dárce, nelze erytrocyty použít, dokud není problém objasněn. Výjimku, kdy se pravidelné protilátky nevyšetřují, tvoří novorozenci a děti do 4 měsíců věku. Kontrolní vyšetření protilátek je tady nahrazeno opakovaným vyšetřením antigenů, při kterém se použijí diagnostická séra s 2 různými klony pro každou specifiku. (Penka, Tesařová a kol, 2012; Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07 ze dne 1. 3. 2011) 4.2 Stanovení antigenu D Stanovení antigenu D se provádí pomocí 2 různých klonů IgM monoklonálních anti-d diagnostických sér. Ke každé sérii vyšetření je nutná pozitivní a negativní kontrola. Současná doporučení požadují při určování antigenu D zohlednit účel, pro který je prováděno, zda se jedná o příjemce transfuze, novorozence, dárce krve či těhotnou ženou. V případě dárců se používají diagnostická séra, která detekují variantu D VI. U těhotných, novorozenců a příjemců transfuze se naopak používají séra, která tuto variantu nedetekují. U D negativních dárců se provádí povinné došetření AGH testem, kterým lze prokázat variantní D antigeny. Atypické - 27 -
exprese D antigenu se rozlišují kombinací sérologického vyšetření a vyšetření DNA. Součástí vyšetření antigenu D je také tzv. Rh kontrola. Jedná se o kontrolní diagnostikum, které neobsahuje specifickou anti-d protilátku a slouží k vyloučení falešně pozitivních reakcí. (Penka, Tesařová a kol, 2012; Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07 ze dne 1. 3. 2011) 4.3 Diskrepantní výsledky K diskrepantním výsledkům dochází vlivem technických chyb, dále mohou nastat problémy při vyšetření erytrocytů a při vyšetření AB0 protilátek. Technické chyby K technickým chybám dochází vzácně, většinou spočívají ve: špatné identifikaci vzorku nebo jiného materiálu, chybném zápisu výsledků, absenci diagnostik, které vedou k falešně negativním výsledkům, kontaminaci diagnostik nebo vzorku, které mohou být příčinou falešně negativních nebo falešně pozitivních výsledků, špatné centrifugaci, nesprávně zvoleném poměru diagnostik, nadměrném či nedostatečném resuspendování sedimentu, použití nevhodného materiálu, zvýšení teploty reakční směsi. Problémy při vyšetřování erytrocytů Reakci může komplikovat: přítomnost vysoké koncentrace bílkovin nebo jiných makromolekul v erytrocytech resuspendovaných ve vlastním séru, jejich vlivem může docházet k falešně pozitivním výsledkům, dvojí populace erytrocytů (vzájemná kontaminace krevních vzorků, po alogenní transfuzi krve, po transplantaci kostní dřeně a kmenových buněk, po intrauterinní transfuzi, získaný antigen B u KS A, polyaglutinabilita, mozaicismus Rh, chimérismus), - 28 -
zeslabení antigenů u leukemiků, erytrocyty s navázanými autoprotilátkami, které můžou vést k falešně pozitivním reakcím. Problémy při vyšetřování séra / plazmy Také u vyšetření AB0 protilátek může docházet k problémům, které mohou být způsobeny: mimořádnou koncentrací sérových proteinů nebo přítomností abnormálních proteinů (vlivem použití náhradních roztoků nebo kontrastních látek), autoprotilátkami, slabými protilátkami, imunodeficiencí, nepravidelnými protilátkami anti-h, anti-a, protilátkami proti složkám obsažených v reagenciích, neshodné transplantáty v AB0 systému. (Tesařová a kol., 2008; Rýznarová, 2012) Při zjištěných diskrepancích se doporučuje opakovat vyšetření z originálního vzorku, nikoliv z připravené suspenze, promytí vyšetřovaných erytrocytů, zařadit autokontrolu. Údaje o diskrepancích musí být uvedeny na výsledku a zaneseny do zdravotnické dokumentace pacienta. (Doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07 ze dne 1. 3. 2011) - 29 -
PRAKTICKÁ ČÁST 5 Materiál a použitá metodika V této části je popsán laboratorní postup vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D pomocí jednotlivých metod, které jsem použila. Postupovala jsem podle metodik vycházejících z doporučení výrobce, platných PP FNUSA a doporučení Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP. Stanovení krevní skupiny zahrnovalo vyšetření antigenů (aglutinogenů) A a B a stanovení AB0 protilátek v plazmě. Součástí vyšetření bylo i stanovení antigenu D. K vyšetření aglutinogenů jsem použila monoklonální anti-a, anti-b, anti-ab, 2 různé klony anti-d diagnostických IgM protilátek, kterými jsem zjišťovala přítomnost aglutinace. K vyloučení falešně pozitivních výsledků bylo použito také Rh kontrol sérum. Detekce AB0 pravidelných protilátek proběhla pomocí A 1, A 2, B, 0 typových erytrocytů. Ke srovnání jsem použila: zkumavkovou metodu, sloupcovou aglutinaci, aglutinaci v mikrotitračních destičkách, E.M. technologii. 5.1 Charakteristika souboru Praktická část práce byla provedena na Krevní bance FN u Sv. Anny v Brně v období 22.11.2011 25.11.2011. Soubor vzorků, které byly použity ke srovnání, byly získány od pacientů FNUSA. Jednalo se o 60 vzorků nesrážlivé krve, které byly náhodně vybrány. Součástí mé práce bylo i zařazení interní kontroly kvality, použity byly reagencie HEMA CQI firmy Diagast. U použitých diagnostických sér, krvinek, reagencií a gelových karet, byl kontrolován vzhled, specifita a reaktivita. 5.2 Preanalytická část Preanalytická část byla provedena v souladu s Doporučením Společnosti pro transfuzní lékařství ČLS JEP č. STL2011_07 ze dne 1. 3. 2011-30 -
5.3 Analytická část 5.3.1 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D zkumavkovou metodou Diagnostika a ostatní reagencie: nesrážlivý vzorek krve, diagnostické monoklonální sérum anti-a (AB01) Diagast, diagnostické monoklonální sérum anti-b (AB02) Diagast, diagnostické monoklonální sérum anti-a,b (AB03) Diagast, diagnostická monoklonální séra anti-d (RH1), (RH2) Diagast 2 různé klony, Rh kontrol (NEG CONTROL) sérum Diagast, typové erytrocyty A 1, A 2, B, 0 (HEMATEST) Diagast (diagnostika jsou dodávána jako 5% suspenze erytrocytů v konzervačním roztoku), fyziologický roztok. Spotřební materiál: pipety, špičky, wassermannovy a aglutinační zkumavky, stojánky na zkumavky. Přístrojové vybavení: centrifuga Hettich universal 320. Postup: centrifugace vzorku 3 minuty při 1200g, do označených zkumavek dávkovat kapátkem lahvičky 1 kapku suspenze typových erytrocytů A 1, A 2, B, 0, do zkumavek s typovými erytrocyty přidat 100 µl plazmy, připravit 5% nepromytou suspenzi erytrocytů ve fyziologickém roztoku, do označených zkumavek kapátkem lahvičky přidat po jedné kapce anti-a, anti-b, anti-a,b, 2 různé klony anti-d a Rh kontrol sérum, k diagnostickým sérům přidat 50 µl 5% suspenze erytrocytů, - 31 -
protřepáním promíchat obsah zkumavek a centrifugovat 1minutu při 500g, mírným poklepem na dno zkumavky zhodnotit případnou aglutinaci a výsledek zaznamenat. Obr. 6: Diagnostika potřebná k vyšetření krevní skupiny zkumavkovou metodou 5.3.2 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D v mikrotitrační destičce Diagnostika a ostatní reagencie: nesrážlivý vzorek krve, mikrotitrační destičky Groupa 2D Micro Diagast, typové erytrocyty A 1, A 2, B, 0 Hemamicro Diagast (diagnostika jsou dodávána jako 1% suspenze erytrocytů v konzervačním roztoku), bromelin. Spotřební materiál: pipety, špičky, zkumavky, stojánky na zkumavky. - 32 -
Přístrojové vybavení: centrifuga Hettich universal 320, centrifuga Hettich universal 32, třepačka mikrotitračních destiček Heidolph Titramax 100. Postup: centrifugace vzorku 10 minut při 1200g, označit mikrotitrační destičku, do příslušných reakčních jamek označených mikrotitračních destiček dávkovat 25(+/-5 µl) vyšetřované plazmy, ze sedimentu erytrocytů připravit 1 % suspenzi nepromytých erytrocytů v bromelinu, jemně protřepat bromelinovou suspenzi erytrocytů a do příslušných jamek mikrotitrační destičky dávkovat 40 µl bromelinové suspenze erytrocytů, k vyšetřované plazmě přidat 25(+/-5 µl) suspenze typových erytrocytů A 1, A 2, B, 0, inkubace 10 minut při laboratorní teplotě, po inkubaci třepat na třepačce 10 sekund při 1000 vibracích/min, centrifugace 1 minutu při 150g, třepat na třepačce 2 minuty při 700 vibracích/min a poté 30 vteřin při 300 vibracích/min, vznik případných aglutinátů zhodnotit makroskopicky a zaznamenat, odečet má být proveden do 3 minut po třepání. Obr. 7: Vyšetření krevní skupiny v mikrotitrační destičce - 33 -
5.3.3 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D sloupcovou aglutinací Diagnostika a ostatní reagencie: nesrážlivý vzorek krve, ID karty NaCl, enzyme test and cold agglutinins; ID karta AB0/D- BioRad, typové erytrocyty A 1, A 2, B, 0 (diagnostika jsou dodána jako 0,8% suspenze erytrocytů v konzervačním roztoku, diluent č. 2 (modifikovaný LISS). Spotřební materiál: pipety, špičky, zkumavky, stojánky na zkumavky. Přístrojové vybavení centrifuga Hettich universal 320, centrifugy DiaMed (ID-centrifuge 24 S). Postup: centrifugace vzorku 5 minut při 1200g, označit ID karty, ze sedimentu erytrocytů připravit 5% suspenzi erytrocytů v diluentu č. 2, do ID karty NaCl, enzyme test and cold agglutinins nakapat 50 µl typových erytrocytů A 1, A 2, B, 0, do stejné karty přidat 50 ul plazmy, do ID karty AB0/D rozpipetovat 10 µl suspenze připravených 5% erytrocytů, inkubace 10 minut při laboratorní teplotě, centrifugace 10 min při 910 otáčkách v ID-centrifuge 24 S, vznik případných aglutinátů zhodnotit makroskopicky a zaznamenat. - 34 -
Obr. 8: Zásady správného pipetování (Dostupné z:http://www.eurexmedica.cz/files/0000000043.pdf) Obr. 9: Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D sloupcovou aglutinací 5.3.4 Vyšetření krevní skupiny AB0 a antigenu D E.M. technologií Technologii E. M. jsem měla možnost využít díky laskavosti firmy Hebios. Tato technika byla prováděna v mikrotitračních destičkách, které byly ve spojení s pracovním místem FREELYS. Diagnostika a ostatní reagencie: nesrážlivý vzorek krve, mikrotitrační destičky Groupa 2 Lys Diagast, Hemalys A 1, A 2, B, 0 Diagast, Bromeline Diagast, Magnelys Diagast. - 35 -
Spotřební materiál: pipety, špičky, zkumavky. Přístrojové vybavení: odstředivka Hettich universal 320, pracovní místo FREELYS Nano. Postup: centrifugace vzorku 5 minut při 2500g, umístit lahvičky Magnelys, Hemalys, Bromeline do odpovídajících pozic Freelys systému, označit a umístit mikrotitrační destičku do centrálního držáku FREELYS systému, do příslušných reakčních jamek označených mikrotitračních destiček dávkovat 25 µl vyšetřované plazmy, promíchat roztok Magnelys a dávkovat 240 µl do označené zkumavky, nasát 10 µl erytrocytového shluku a přenést do roztoku Magnelys, do suspenze erytrocytů přidat 750 µl Bromeline, suspenzi erytrocytů dávkovat do jamek mikrotitrační destičky obsahující reagencie, jemně promíchat lahvičky Hemalys a dávkovat 25 µl erytrocytů Hemalys do jamek obsahující plazmu, vložit mikrotitrační destičku na třepačku pracovního místa FREELYS a zapnout program P1, inkubace 10 minut při laboratorní teplotě, vložit mikrotitrační desku na 5 minut na magnetickou desku pracovního místa FREELYS, po inkubaci přenést mikrotitrační destičku na třepačku a zapnout program P2, mikrotitrační destičku přenést do centrálního držáku pracovního místa FREELYS, vznik případných aglutinátů zhodnotit makroskopicky a zaznamenat, odečet má být proveden do 2 minut po třepání. - 36 -
Obr. 10: Pracovní místo FreeLys (Dostupné z: http://www.diagast.com/index.php?option=com_content&view=article&id=55&itemid=191&lang=en 5.4 Postanalytická část 5.4.1 Interpretace výsledků Zkumavková metoda, metoda na mikrotitračních destičkách a E.M. technologie: Pozitivní (+): došlo k aglutinaci, erytrocyty jsou shluknuté do jednoho, či několika shluků. Odpovídající antigen nebo protilátka byla přítomna ve vyšetřovaném vzorku. Negativní (-): nedošlo k aglutinaci, erytrocyty se resuspendují do homogenní suspenze. Odpovídající antigen nebo protilátka nebyla ve vyšetřovaném vzorku přítomna. Sloupcová aglutinace: Pozitivní (+): došlo k aglutinaci, aglutinace se vyskytuje na povrchu gelu nebo je rozptýlená v gelu. Odpovídající antigen nebo protilátka byla přítomna ve vyšetřovaném vzorku. Negativní (-): nedošlo k aglutinaci, erytrocyty sedimentují na dno mikrozkumavky. Odpovídající antigen nebo protilátka nebyla ve vyšetřovaném vzorku přítomna. - 37 -