Bio-Rad Laboratories Therapeutic Drug Monitoring Therapeutic Drug Monitoring SSRIs by HPLC Dny kontroly kvality a speciálních metod HPLC Bio-Rad Lednice 8.-9. Listopadu 2012 Bio-Rad Laboratories Mnichov, Německo
Therapeutic Drug Monitoring by HPLC Kvantitativní stanovení Neuroleptics (Neuroleptika) RAPsyD = Rapid Analysis of Psychoactive Drugs (Rychlá analýza psychoaktivních drog) Antiepileptics (Antiepileptika) Benzodiazepines/Tricyclic Antidepressants (Benzodiazepiny / Tricyklická antidepresiva) Selective Serotonin Uptake Inhibitors (SSRIs=Selektivní inhibitory zpětného vychytávání serotoninu)
Online sample preparation for TDM Příprava vzorku pro HPLC analýzu Pacientské vzorky: Příprava vzorku: Proces přípravy vzorku: HPLC analýza: moč nebo vzorky séra s velkým množstvím různých látek separace látek patřících do stejné skupiny preparační kolonka, degradace, derivatizace vysoce selektivní separace látek Proč používat on-line přípravu vzorku? snadnější manipulace krátká doba mezi přijetím vzorku a odesláním výsledkem snížení rizika záměny pacientských vzorků, méně manuálních kroků nižší spotřeba reagencií
Princip online přípravy vzorku MF 1 Sérum + Int. Std. MF 2 Extrakční kolona: - C8 materiál - velké částice pryskyřice: Extr. Column přibližně 20 µm - vazba analytů - uvolnění analytů z vazebných proteinů - odmytí ostatních látek - definované podmínky pro analytickou kolonu odpad Anal. kolona Analytická kolona: - C 18 materiál - velikost částic pryskyřice: 3-5 µm - separace analytů - léků Zpětný proplach extrakční kolony X detektor
HPLC požadavky na systém Požadavky na systém (otevřený HPLC): 2 HPLC pumpy 6-ti cestný spínací ventil Extrakční kolona a prefilter jsou dostatečné k uskutečnění 100 analýz Příprava vzorku Analýza vzorku
HPLC požadavky na systém HPLC přístrojové požadavky pro Online Metodu: Dvě HPLC pumpy: Binární nebo kvartérní pumpa bývá nedostačující => je tedy nutné použít dvě nezávislé pumpy Moderní pumpy s automatickou regulací toku snižují spotřebu reagencií Spínací ventil Systém musí umožňovat časovou regulaci injekčního a druhého přepínacího ventilu Autosampler Autosampler s pipetovací funkcí pro přidání interního standardu sníží manuální práci obsluhy
Analytické kroky Krok 1: Krok 2: Odstředíme 600 µl vzorku (sérum/plasma), kalibrátoru, kontrol 500 µl supernatantu přeneseme do zkumavek v autosampleru Krok 3: Přidáme Vnitřní Standard a zamícháme Pro autosampler bez pipetovací funkce Krok 4: Umístíme zkumavky se vzorky do autosampleru Krok 5: Spustíme analýzu
SSRIs pomocí HPLC Selective Serotonin Reuptake Inhibitors (Selektivní inhibitory zpětného vychytávání serotoninu) SSRIs HPLC s přípravou vzorků on-line
Klinické souvislosti Selektivní inhibitory zpětného vychytávání Serotoninu (SSRI) Léky s antidepresivní účinky Blokují transportní protein pro Serotonin na synaptické štěrbině => Blokují zpětné vychytávání Serotoninu (neurotransmitéru) do buněk => Zvyšují koncentraci Serotoninu na synaptických štěrbinách v centrálním nerovovém systému Velmi selektivní pro transportní protein Serotoninu => nízké nežádoucí účinky (např. na rozdíl od tricyklických antidepresiv) SSRIs jsou v současné době standardním antidepresivem Terapeutické monitorování léčby => oddálený efekt po začátku terapie: TDM pro sledování spolupráce => snižování nákladů použitím minimální efektivní dávky
Návrh soupravy Nový kit vytvořený pro TDM SSRIs pro HPLC Specifické: Kalibrátory Kontroly Vnitřní standard Analytická kolona Mobilní fáze Extrakční kolona Benzo/TCA pro HPLC Specifické: Kalibrátory Kontroly Vnitřní standard RAPsyD pro HPLC Specifické: Kalibrátory Kontroly Vnitřní standard
Návrh soupravy pro TDM Nový kit vytvořený pro TDM TDM pro HPLC Základní souprava - TDM Mobilní fáze 1 - TDM Mobilní fáze 2 - TDM Extrakční souprava 1 (Extrakční kolona 1) TDM Analytická kolona Benzo/TCA Kalibrátor -Set A, B, C, D RAPsyD Kalibrátor -Set A, C SSRIs Kalibrátor -Set A, B, C, D, E, F TDM Vnitřní Standard (IS 1, 2, 3, 4, 5) TDM Mobilní fáze 3 (používá se jako MF 1 pro SSRI Kal A) TDM Extrakční souprava 2 (Extrakční kolona 2 pro SSRI Kal D, F)
SSRIs sady kalibrátorů 13/17 Analytů v šesti kalibračních sadách Kalibrátor A: Prosinec 2012 - O-Desmethyl-Venlafaxine - Venlafaxine - N-Desmethyl-Venlafaxine (inactive metabolite) Kalibrátor B: dostupné - Citalopram - Fluvoxamine - Desmethyl-Citalopram (inactive metabolite) Kalibrátor C: 1. čtvrtletí 2013 - Norfluoxetine - Fluoxetine Fluorescenční-Detekce UV-Detekce Fluorescenční-Detekce Fluorescenční-Detekce Odpovídající dvoustupňové kontrolní sady jsou k dispozici
SSRIs sady kalibrátorů 13/17 Analytů v šesti kalibračních sadách Kalibrátor D: Prosinec 2012 - Paroxetine - Mirtazapine - Reboxetine - Desmethyl-Mirtazapine (neaktivní metabolit) Kalibrátor E: 1. čtvrtletí 2013 - Hydroxy-Bupropion - Duloxetine - Bupropion Kalibrátor F: dostupné - Sertraline - Desmethyl-Sertraline (20% activity of Sertr.) UV-Detekce UV-Detekce UV-Detekce Odpovídající dvoustupňové kontrolní sady jsou k dispozici
Bio-Rad TDM pro HPLC AED soupravy pro HPLC Antiepileptika Kalibrátor A: - Sultiam - Zonisamid - 10-OH-Carbazepin - Desmethylmethsuximid - Lamotrigin - Oxcarbazepin Kalibrátor B: - Ethosuximid - Primidon - Phenobarbital - Carbamazepin-Epoxid - Phenytoin - Carbamazepin Kalibrátor C: - Felbamat Online & manuální postup RAPsyDpro HPLC Neuroepileptika Kalibrátor A: - Norclozapin - Olanzapin - Quetiapin - Clozapin Kalibrátor C: - 9-OH-Risperidon - Risperidon Benzo/TCA pro HPLC Antidepresiva Kalibrátor A (TCA): - Nordoxepine - Desipramine - Nortriptyline - Nortrimipramine - Norclomipramine - Doxepine - Imipramine - Amitriptyline - Clomipramine - Trimipramine Kalibrátor B: - Oxazepam - Alprazolam - Chlordiazepoxide - Desalkylflurazepam - Nordiazepam - Trazodone Kalibrátor C: - Clonazepam - Flunitrazepam Kalibrátor D: - Bromazepam - Lorazepam - Temazepam SSRI s pro HPLC Antidepresiva Kalibrátor A: - O-Desmethyl-Venlafaxine - Venlafaxine Kalibrátor B: - Citalopram - Fluvoxamine Kalibrátor C: - Norfluoxetine - Fluoxetine Kalibrátor D: - Paroxetine - Mirtazapine - Reboxetine Kalibrátor E: - Hydroxy-Bupropion - Duloxetine - Bupropion Kalibrátor F: - Sertraline
Děkuji za pozornost!