Stanovení antioxidační aktivity a redukční síly na ječmeni jarním (Hordeum vulgare, L. cv. Bonus) Autor: Bc. Ursula Ferretti Spoluautor: Mgr. Jakub Nezval Ostravská Univerzita v Ostravě Přírodovědecká fakulta Katedra Fyziky SGS20/PřF/2013 a IET (CZ.1.05/2.1.00/03.0100)
Obsah: Cíl práce Úvod do problematiky Metodika Experiment Výsledky Závěr
Cíl práce: Navrhnout a otestovat průběh vybraných metod ORAC DPPH FRAP Zkalibrovat metody standardním antioxidantem Trolox Sledovat změny antioxidační aktivity (AoA) v extraktech rostlin vystavených vybranému abiotickému faktoru Zda je AoA extraktů získaných z rostlin pod abiotickým stresem vyšší oproti kontrolním rostlinám? Vyhodnotit získaná data
Úvod do problematiky: Stresové faktory Abiotické Biotické Aktivní formy kyslíku 1 O 2, H 2 O 2, O 2 -, OH, HO 2 Antioxidanty Enzymatické Superoxiddismutasa, Katalasa Nízkomolekulární polyfenoly, karotenoidy Oxidativní stres Obr. 1: Schéma působení abiotického stresu
Metodika: Metoda DPPH (1,1-difenyl-2-pikrylhydrazyl) Principem metody je stanovení antioxidační aktivity pomocí stabilního radikálu DPPH a jeho reakce s antioxidanty, doprovázená barevnou změnou Obr. 2: Křvika TEAC - Závislost průměrného poklesu absorbance měřícího roztoku DPPH při 515 nm na koncentraci Troloxu (n=3, +SD). Trojice koncentračních řad Troloxu byla vytvořena ředěním ze stejného zásobního roztoku. Amax - 515 nm a 517 nm Použití: ke stanovení antioxidační kapacity potravin, hydrofobních systémů, vybraných rostlinných extraktů a metabolitů
Metoda FRAP (FERRIC REDUCTION ANTIOXIDANT POWER) Nepracuje s volnými radikály, ale je založena na principu redukce železitých iontů na železnaté Složení činidla: Roztok železitého komplexu TPTZ (2,4,6-tripyridyl-S-triazin) Roztok bezbarvého hexokyanatu draselného - K 3 [Fe(CN) 6 ] Acetátový pufr o ph 3,6 V poměru 1:1:10 Po reakci činidla FRAP s antioxidanty dochází taktéž k barevné změně (z průhledného roztoku vznikne modrý) Amax 593 nm Obr. 3: Křivka TEAC - Závislost průměrného nárůstu absorbance měřícího roztoku FRAP při 593 nm na koncentraci Troloxu (n=3, +SD). Trojice koncentračních řad Troloxu byla vytvořena ředěním ze stejného zásobního roztoku.
Metoda ORAC (Oxygen Radical Antioxidant Capacity) Principem metody je sledování úbytku signálu fluorescenční sondy, která je zhášena působením AFK, vygenerovaných azoiniciátorem. Složení činidla: Obr. 4 : Křivka TEAC - Závislost průměrné změny plochy pod křivkou [rel.] měřícího roztoku ORAC na koncentraci Troloxu [µm] (n=3, +SD), kdy trojice koncentračních řad Troloxu byla vytvořena ředěním ze stejného zásobního roztoku. PBS (ph=7,4), extrakt, standard (Trolox) Fluorescein Azo-iniciátor-AAPH (2,2 -azobis(2-amidinopropan)dichloridu) Hodnoty měření: Reakční čas: 30 min Teplota 37 C Excitační vlnová délka na 485 nm a emisní vlnová délka na 600 nm. Šířka štěrbin excitačního a emisního monochromátoru byla nastavena na 10 nm. K vyhodnocování se využívá technika pro kvantifikaci : Plocha pod křivkou/area Under Curve (AUC)
Metoda TEAC Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) Všechny výše uvedené metody stanovení antioxidační aktivity/kapacity produkují relativní výsledky Aby bylo možné srovnávat mezi sebou výsledky různých metod, je nezbytné metody kalibrovat za pomoci zvoleného antioxidantu a získat tak hodnotu TAC (Total Antioxidant Capacity) Využívá ke kalibraci derivátu vitamínu E 6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman 2-dikarboxylové kyseliny, Troloxu Relativní změna signálu je poté vztažena ke hmotnosti nebo látkovému množství Troloxu ve vzorku
Experiment: Ječmen jarní (Hordeum vulgare L. cv. Bonus) Růstové komory 8 dní Vystaveny světlu 16 hod denně Světelná intenzita FAR byla pro LI rostliny byla 100 µmol.m -2.s -1 a HI 1000 µmol.m -2.s -1 Teplota vzduchu 20 C, rel.vlhkost vzduchu 65% Výkon UV-B lamp: 0,5 W 8.den byl ječmen nasbírán a ze středních segmentů primárních listů bylo naváženo celkově 72 vzorků po 100 mg. Z těchto vzorků byly postupně připravovány extrakty ve vybraných rozpouštědlech tj. voda, 40% a 100% metanol.
Výsledky: U metody DPPH bylo zjištěno, že množství antioxidantů ve vzorcích bylo natolik malé, že nedošlo k žádné evidentní změně. Tento problém byl již vyřešen změnou objemu přidávaného vzorku. Obr. 5: (A 1) Srovnání průměrnýchtrolox ekvivalentů [mm] rostlin pěstovaných při různých světelných ozařenostech a extrahovaných v různých rozpouštědlech (ve vodě, 40% a 100%),(n=6, +SD) (A 2) Detail předchozího grafu.
Obr. 6: Srovnání průměrnýchtrolox ekvivalentů [mm] rostlin pěstovaných při různých světelných ozařenostech a extrahovaných v různých rozpouštědlech,(n=6, +SD), (B 1) voda, (B 2) 40% methanol, (B- 3) 100% methanol U metody FRAP jsou výsledky rozporuplné, podle y osy lze i u této metody (a taktéž po následném přezkoumání) říci, že množství antioxidantů ve vzorcích bylo příliš malé a tudíž se musí pozměnit objem přidávaného vzorku.
Obr. 7: Srovnání průměrnýchtrolox ekvivalentů [mm] rostlin pěstovaných při různých světelných ozařenostech a extrahovaných v různých rozpouštědlech,(n=6, +SD), (C 1) voda, (C 2) 40% methanol, (C- 3) 100% methanol U metody ORAC se výsledky shodují s hypotézou AoA vzrůstá s ozářeností (LI x HI) i po přidání stresového faktoru (UV-B)
Závěr: Metoda ORAC plně souhlasí s hypotézou, že extrakty obdržené z listů rostlin vystavených UV-B radiaci a FAR mohou vykazovat vyšší antioxidační aktivitu (oproti kontrolním vzorkům), což je zřejmě způsobeno změnou regulace biosyntézy nízkomolekulárních antioxidantů, indukovanou nadměrnou produkcí aktivních forem kyslíku a dusíku. Nemodifikovanou metodu DPPH není možné použít pro stanovení antioxidační aktivity extraktů z ječmene jarního připravených z malého množství rostlinného materiálu. Metoda FRAP je velmi citlivá na přesnost a bylo by lepší ji modifikovat podobně jako metodu DPPH
A co bude dál?... Modifikace metody DPPH Modifikace metody FRAP Zavést metodu stanovení celkových polyfenolů s použitím činidla Folin-Ciocalteu Modifikovat metodu ABTS
Děkuji za pozornost
Literatura: PITERKOVÁ, Jana, Kateřina TOMÁNKOVÁ, Lenka LUHOVÁ, Marek PETŘIVALSKÝ a Pavel PEČ. Oxidativní stres: Lokalizace tvorby aktivních forem kyslíku a jejich degradace v rostlinném organismu. Chemické listy. 2005, č. 99, s. 455-466. FERRETTI, Ursula. Stanovení antioxidační aktivity rostlinných exktraků in-vitro. Ostrava, 2012. Bakalářská práce. Ostravská Univerzita v Ostravě. INZÉ, Dirk a Marc VAN MONTAGU. Oxidative stress in plants. Current opinion in biotechnology. 1995, č. 6, s. 153-158. ISSN 0958-1669. IMPA, S.M. et al Drought Stress Induced Reactive Oxygen Species and Anti-oxidants in Plants. AHMAD, Parvaiz a M PRASAD. Abiotic stress responses in plants: metabolism, productivity and sustainability. New York: Springer, c2012, s. 131-148. ISBN 978-1-4614-0634-1. NAGUIB, Yousry M.A. A Fluorometric Method for Measurement of Oxygen Radical-Scavenging Activity of Water-Soluble Antioxidants. Analytical Biochemistry. 2000, roč. 284, č. 1, s. 93-98. ISSN0032697. DOI: 10.1006/abio.2000.4691. Dostupné z: http://linkinghub.elsevier.com/retri eve/pii/s0003269700946918